Burada, iki zebra balığı (Danio rerio) hücre hattının sferoidlerinin oluşumu için etkili, kolay ve hızlı bir 3D kültür protokolü sunuyoruz: ZEM2S (embriyo) ve ZFL (normal hepatosit).
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Embriyonik ve Karaciğer Zebra Balığı Hücre Hatlarının Sferoidlerinin 3D Kültür Yöntemi
Bu makalede
Özet
Özet
Balık hücre hatları, ekotoksisite değerlendirmesi için in vitro modeller vaat etmektedir; Bununla birlikte, geleneksel tek katmanlı kültür sistemlerinin (2D kültür) iyi bilinen sınırlamaları vardır (örneğin, kültürün uzun ömürlülüğü ve bazı in vivo hücresel fonksiyonların bakımı). Bu nedenle, sferoidler gibi 3D kültürler önerilmiştir, çünkü bu modeller doku benzeri yapıları yeniden üretebilir ve in vivo koşulları daha iyi yeniden yakalayabilir. Bu makalede, iki zebra balığı (Danio rerio) hücre hattına sahip sferoidlerin oluşumu için etkili, kolay ve hızlı bir 3D kültür protokolü açıklanmaktadır: ZEM2S (embriyo) ve ZFL (normal hepatosit). Protokol, hücrelerin yuvarlak tabanlı, ultra düşük bir ataşman, 96 delikli bir plaka ile kaplanmasından oluşur. Orbital sarsıntı altında 5 gün sonra (70 rpm), kuyu başına tek bir sferoid oluşur. Oluşan sferoidler kararlı boyut ve şekil sunar ve bu yöntem bir kuyuda çoklu sferoidlerin oluşumunu önler; Bu nedenle, benzer boyutlardaki sferoidleri elle seçmek gerekli değildir. Bu sferoid yöntemin kolaylığı, hızı ve tekrarlanabilirliği, yüksek verimli in vitro testler için kullanışlı olmasını sağlar.
Giriş
Sferoidler, 3D kültürde hücreler yakın hücreden hücreye temasta kültürlendiğinde oluşan küçük hücre küreleridir. Sferoidlerin in vivo doku ortamını taklit etme kapasitesi, çeşitli hücre hatlarında ve birincil hücrelerde zaten incelenmiştir 1,2. Bununla birlikte, sferoidler memeli toksisitesi çalışmaları için iyi geliştirilmiş olmasına rağmen, memeli olmayan omurgalılarla (örneğin balık) toksisite çalışmaları için sferoidlerin geliştirilmesi hala devam etmektedir3. Balık hücre hatları için, sferoidler, farklı tipte kuyu plakaları 3....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
ZFL ve ZEM2S hücre hatlarının 3D sferoidlerini yuvarlak tabanlı 96 delikli bir plakada üretmek için temel adımlar Şekil 1'de sunulmuştur.
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na ve bu protokolde kullanılan çözümler ve kültür ortamları için Tablo 1'e bakınız.
1. Hücre kültürü ortamı ve tek katmanlı kültürler
- Her iki hücre hattını da (ZFL, ZEM2S) CO2 olmadan 28 ° C'de bir inkübatörde tek katmanlı olarak büyütün ve ~% 80 birleşmeye ulaştıklarında 1: 3'lük bir alt yeti....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu yöntemle sabit bir boyut ve şekle sahip kuyu başına tek küre başı kullanılır. Şekil 2, ZFL ve ZEM2S hücrelerinin tek sferoidlerinin yörüngesel sarsıntı (70 rpm) altında bir Ula plakasının bir kuyucuğunda oluşum sürecini göstermektedir. ZFL ve ZEM2S hücre hatları 3D kültürde farklı davranışlara sahiptir. ZEM2S hücre hattı, orbital sarsıntının ilk gününden itibaren kolayca küresel bir şekil oluşturma yeteneği veren özellikler sunarken (Şekil 2E), ZFL hücre hatt.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu, zebra balığı karaciğer ve embriyo hücre hatlarının kürelerini üretmek için basit, kolay ve hızlı bir yöntemdir. Bu yöntem, bu grup tarafından, küresel oluşum ile ilgili bilimsel çalışmalarda bildirilen sorunların üstesinden gelmek için mevcut 3D sferoid yöntemlerin modifikasyonlarına ve 3D sferoid tahlillerden elde edilen veri doğruluğundaki belirsizliklere dayanarak geliştirilmiştir. Örneğin, bildirilen sorunlar, sferoidlerin üretilmesinin zaman alıcı doğası, bir tahlil yapmak için benzer boyut ve şekildeki sferoidl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışmanın ortak yazarı Dr. Márcio Lorencini'nin anısına, kozmetik alanında mükemmel bir araştırmacı ve Brezilya'da kozmetik araştırmaları teşvik etmeye adanmıştır. Yazarlar, ekipman kullanılabilirliği ve Yüksek Öğrenim Personelinin İyileştirilmesi Koordinasyonu (CAPES, Brezilya) (Finans Kodu 001) ve Grupo Boticário'nun finansal desteği için Fizyoloji Bölümü'ndeki (UFPR) Çok Kullanıcılı Laboratuvara minnettardır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 Kuyulu Şeffaf Yuvarlak Alt Ultra Düşük Bağlantılı Mikroplaka, Ayrı Ayrı Sarılmış, Kapaklı, Steril | Corning | 7007 | |
| DMEM, toz, yüksek glikoz, piruvat | Gibco | 12800-017 | |
| Jambonun F-12 Besin Karışımı, toz | Gibco | 21700026 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | |
| Java'da Görüntü İşleme ve analiz ( ImageJ) 1.52p yazılımı | Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD | Şu adresten ulaşılabilir: https://imagej.nih.gov/ij/index.html | |
| Leibovitz'in L-15 Medium, toz | Gibco | 41300021 | |
| Orbital çalkalayıcı | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm dönme çapı |
| Dulbeccos PBS (10x) kalsiyum ve magnezyum ile | Invitrogen | 14080055 | |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| RPMI 1640 Orta | Gibco | 31800-014 | |
| FBS - Fetal Sığır Serumu nitelikli, USDA onaylı bölgeler | Gibco | 12657-029 | |
| Sodyum bikarbonat, toz ve nbsp; moleküler biyoloji için biyoreaktif | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Tripan mavisi leke (%0,4) | Gibco | 15250-061 | |
| Tripsin-EDTA (%0,5), fenol kırmızısı yok | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S hücre hattı | ATCC | CRL-2147 | Bu hücre hattı, Profesör Dr. Michael J. Carvan (Wisconsin Üniversitesi, Milwaukee, ABD) |
| ZFL hücre hattı | BCRJ | 256 |
Kaynaklar
- Elje, E., et al. The comet assay applied to HepG2 liver spheroids. Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
