Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Koronavirüs-Konakçı Etkileşimlerini Karakterize Etmek için Hava-Sıvı Arayüzünde Büyütülen Primer Nazal Epitel Hücrelerinin Enfeksiyonu

2.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64868

⸱

22 Eylül 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Pennsylvania, 2Penn Center for Research on Coronaviruses and Other Emerging Pathogens, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Pennsylvania, 4Corporal Michael J. Crescenz VA Medical Center

Bu makalede

Özet

Nazal epitel, tüm solunum yolu patojenlerinin karşılaştığı birincil bariyer bölgesidir. Burada, fizyolojik olarak ilgili bir sistemde insan koronavirüs-konakçı etkileşimlerini karakterize etmek için hava-sıvı arayüz (ALI) kültürleri olarak büyütülen birincil nazal epitel hücrelerini kullanma yöntemlerini özetliyoruz.

Özet

SARS-CoV (2002), MERS-CoV (2012) ve SARS-CoV-2 (2019) olmak üzere üç yüksek patojenik insan koronavirüsü (HCoV) ortaya çıkmış ve son 20 yılda önemli halk sağlığı krizlerine neden olmuştur. Dört ek HCoV, her yıl soğuk algınlığı vakalarının önemli bir kısmına neden olur (HCoV-NL63, -229E, -OC43 ve -HKU1), bu virüslerin fizyolojik olarak ilgili sistemlerde incelenmesinin önemini vurgulamaktadır. HCoV'ler solunum yoluna girer ve tüm solunum yolu patojenlerinin karşılaştığı birincil bölge olan burun epitelinde enfeksiyon oluşturur. Bu önemli sentinel bölgedeki konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için hastadan türetilen burun örneklerinin bir hava-sıvı arayüzünde (ALI) büyütüldüğü bir birincil nazal epitel kültürü sistemi kullanıyoruz. Bu kültürler, mevcut hücre tipleri, siliyer fonksiyon ve mukus üretimi dahil olmak üzere in vivo hava yolunun birçok özelliğini özetler. HCoV enfeksiyonunu takiben nazal ALI kültürlerinde viral replikasyon, konak hücre tropizmi, virüs kaynaklı sitotoksisite ve doğuştan gelen immün indüksiyonu karakterize etmek için yöntemleri, ölümcül ve mevsimsel HCoV'leri karşılaştıran son çalışmaları örnek olarak kullanarak açıklıyoruz1. Burundaki konak-patojen etkileşimlerinin daha iyi anlaşılması, HCoV'lere ve gelecekte ortaya çıkması muhtemel diğer solunum yolu virüslerine karşı antiviral terapötikler için yeni hedefler sağlama potansiyeline sahiptir.

Giriş

Bugüne kadar yedi insan koronavirüsü (HCoV) tanımlanmıştır ve bir dizi solunum yolu hastalığına neden olmaktadır2. Yaygın veya mevsimsel HCoV'ler (HCoV-NL63, -229E, -OC43 ve -HKU1) tipik olarak üst solunum yolu patolojisi ile ilişkilidir ve yıllık soğuk algınlığı vakalarının tahminen %10-30'una neden olur. Bu, yaygın HCoV'lerle ilişkili tipik klinik fenotip olmasına rağmen, bu virüsler çocuklar, yaşlı yetişkinler ve bağışıklığı baskılanmış bireyler dahil olmak üzere risk altındaki popülasyonlarda daha önemli alt solunum yolu hastalığına neden olabilir 3,4. Son 20 yılda şiddetli akut solunum sendromu (SARS)-CoV, Orta Doğu solunum sendromu (MERS)-CoV ve SARS-CoV-2 dahil olmak üzere üç patojenik HCoV ortaya çıkmış ve önemli halk sağlığı acil durumlarına neden olmuştur. Ölümcül HCoV'ler, MERS-CoV vakalarıyla ilişkili %>34 vaka-ölüm oranı (2012'de ortaya çıkmasından bu yana 2.500'den fazla vakadan 894 ölüm) ile açıkça gösterilen daha şiddetli solunum yolu patolojisi ile ilişkilidir5,6. Ölümcül HCoV'lerin, devam eden COVID-19 pandemisinde görüldüğü gibi, asemptomatik enfeksiyonlardan ölümcül pnömoniye kadar bir dizi solunum yolu hastalığına da neden olduğunu belirtmek önemlidir7.

HCoV'ler, diğer solunum yolu patojenleri gibi, solunum yollarına girer ve burun epitelinde üretken bir enfeksiyon oluşturur8. Alt solunum yoluna yayılımın, HCoV'lerin daha önemli alt solunum yolu patolojisine neden olduğu ağız/nazal boşluktan akciğere aspirasyon ile ilişkili olduğu düşünülmektedir 9,10,11. Bu nedenle burun, viral giriş için ilk portal görevi görür ve sağlam mukosiliyer klirens mekanizması ve alt solunum yoluna daha fazla viral yayılmayı önlemeyi amaçlayan benzersiz doğuştan gelen bağışıklık mekanizmaları ile enfeksiyona karşı birincil bariyerdir12,13. Örneğin, nazal epitel hücrelerinin, antiviral interferonların ve interferon ile uyarılan genlerin ortalama bazal seviyelerinden daha yüksek eksprese ettiği bildirilmiştir, bu da nazal hücrelerin solunum yolu virüslerine erken tepkiler için hazırlanabileceğini gösterir14,15,16.

Daha önce, HCoV enfeksiyonlarının başladığı burundaki HCoV-konakçı etkileşimlerini modellemek için bir hava-sıvı arayüzünde (ALI) büyütülen hasta kaynaklı primer nazal epitel hücrelerini kullandık. Nazal ALI kültürleri hem patojenik (SARS-CoV-2 ve MERS-CoV) hem de yaygın HCoV'lere (HCoV-NL63 ve HCoV-229E) izin verir ve A549 (bir akciğer adenokarsinomu hücre hattı) gibi geleneksel hava yolu epitel hücre hatlarına göre çeşitli avantajlar sunar16,17. Farklılaşmadan sonra, nazal ALI kültürleri heterojen bir hücresel popülasyon içerir ve mukosiliyer klirens mekanizması gibi in vivo nazal epitelden beklenen fonksiyonların çoğunu sergiler18. Nazal epitel hücrelerinin sitolojik fırçalama yoluyla elde edilmesi, HBEC'lere ulaşmak için bronkoskopi gibi tekniklerin kullanılmasına kıyasla önemli ölçüde daha az invaziv olduğundan, nazal hücreler ayrıca alt solunum yolu kültür sistemlerine (insan bronşiyal epitel hücreleri, HBEC'ler gibi) göre avantajlar sunar 19,20,21.

Bu yazıda, nazal epitelde HCoV-konakçı etkileşimlerini karakterize etmek için bu nazal ALI kültür sistemini kullanma yöntemleri açıklanmaktadır. Bu yöntemleri SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 ve HCoV-229E 1,16,17'yi karşılaştırmak için yakın zamanda yayınlanan çalışmalarda uyguladık. Bu yöntemler ve temsili sonuçlar, bu nazal hücre modelinde HCoV'lerin incelenmesini vurgulasa da, sistem diğer HCoV'lere ve diğer solunum yolu patojenlerine oldukça uyarlanabilir. Ayrıca, bu yöntemler, viral replikasyon ve hücresel tropizmin yanı sıra enfeksiyonu takiben sitotoksisite ve doğuştan gelen immün indüksiyonu araştırmak için diğer ALI kültür sistemlerine daha geniş bir şekilde uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Nazal örneklerin kullanımı Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (protokol # 800614) ve Philadelphia VA Kurumsal İnceleme Kurulu (protokol # 00781) tarafından onaylanmıştır.

1. Nazal ALI kültürlerinin enfeksiyonu

NOT: Klinik örneklerin elde edilmesinin yanı sıra nazal ALI kültürlerinin büyümesi ve farklılaşması bu yazının kapsamı dışındadır. Primer nazal epitel hücrelerinin kültürlenmesi için spesifik yöntemler, bu kültürleri kullanan yakın zamanda yayınlanmış çalışmalarda bulunabilir 18,22,23. Aşağıdaki protokoller, istenirse ticari olarak temin edilebilen nazal epitelyal ALI kültürlerine ek olarak uygulanabilir. Aşağıda ayrıntıları verilen protokoller ve hacimler, 24 oyuklu plakalı transwell ekleri (6,5 mm çap, 0,33cm2 membran yüzey alanı) için geçerlidir. Daha büyük transwell'lerde (yani 12 oyuklu plakalar, 12 mm çap, 1.12cm2 yüzey alanı) yetiştirilen ALI kültürleri kullanılıyorsa, hacimleri transwell boyutunu yansıtacak şekilde orantılı olarak ayarlayın.

  1. Enfeksiyondan önceki gün:
    1. ALI kültürlerini 3x fosfat tamponlu salin (PBS) ile apikal olarak yıkayın (~ 200 μL ısıtılmış PBS ekleyin, 37 ° C inkübatöre 5 dakika koyun, PBS'yi aspire edin ve tekrarlayın).
    2. Bazal ortamı (500 μL) değiştirin.
    3. Kültürlerin, enfeksiyonların gece boyunca gerçekleştirileceği sıcaklıkta dengelenmesine izin verin (yani, 33 ° C'de enfekte oluyorsa, kültürleri PBS yıkamalarından sonra 33 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin).
      NOT: HCoV-229E ve HCoV-NL63 gibi soğuk algınlığı ile ilişkili HCoV'lerin 33 °C'de daha verimli bir şekilde çoğaldığı bildirilmektedir. Ek olarak, in vivo nazal epitelin sıcaklığı 33 °C'dir (bu, 37 °C olan akciğer sıcaklığından farklıdır).
  2. Toplam 50 μL'lik bir aşı hacminde istenen enfeksiyon çeşitliliğini (MOI) elde etmek için serumsuz Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) gerektiği kadar virüsü seyreltin.
    NOT: Enfeksiyonlar tipik olarak MOI = 5'te (yüksek MOI) gerçekleştirilmiştir; bununla birlikte, MOI = 0.5'teki (düşük MOI) enfeksiyonlar, SARS-CoV-2 ve soğuk algınlığı ile ilişkili HCoV'ler için de kullanılmıştır ve bunlar, karşılaştırılabilir pik viral titrelerle sonuçlanır, ancak değişken kinetiklerle (MOI kabul edilebilir).
  3. Apikal olarak aşı ekleyin ve kültürleri 1 saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin.
  4. Enfeksiyon sırasında her 15 dakikada bir hafifçe kaya plakaları (viral inokulumun düzgün adsorpsiyonunu sağlamak için plakayı iki elinizle sıkıca tutun, ileri ve geri ve yan yana sallayın).
  5. 1 saatlik inkübasyondan sonra, viral inokulum aspire edin ve viral inokulumun çıkarılmasını sağlamak için her enfekte kültürü 3x PBS ile yıkayın (her yıkama için 200 μL PBS ekleyin, 5 dakika inkübe edin ve bir pipetle aspire edin veya çıkarın).
  6. İstenirse, giriş virüsünün yeterli şekilde çıkarıldığını doğrulamak için üçüncü PBS yıkamasını toplayın.
  7. Enfeksiyon sırasında her 72 saatte bir enfekte ALI'lerde bazal ortamı taze ortamla değiştirin.

2. Apikal yüzey sıvısının (ASL) toplanması ve dökülen virüsün titrasyonu

  1. Enfeksiyonu takiben önceden belirlenmiş zaman noktalarında, enfekte olmuş her transwell'in apikal odasına 200 μL PBS ekleyin.
    NOT: İlgili zaman noktaları, ilgilenilen HCoV'ye bağlı olarak değişir ve enfeksiyondan 24 saat ila 192 saat sonra değişir (çeşitli HCoV'ler için viral replikasyon verileri için temsili sonuçlar bölümüne bakın).
  2. Apikal olarak dökülen virüsün maksimum toplanmasını sağlamak için PBS'yi 5 kat yukarı ve aşağı pipetleyin ve tüm hacmi bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın (bu ASL örneğidir).
    NOT: ASL, ALI kültürlerinden apikal olarak salgılanan mukus ve diğer ürünlere ek olarak dökülen viral partikülleri içerir.
  3. Standart viral plak tahlili ile ASL'deki enfeksiyöz virüsü ölçün (viral partiküllerin konsantrasyonunu ölçmek için virüs içeren numuneleri seri olarak seyreltin).
    NOT: Plak testi için kullanılan hücre tipleri ve kuluçka süresi, kullanılan virüse bağlı olacaktır: SARS-CoV-2 (VeroE6 hücreleri); MERS-CoV (VeroCCL81 hücreleri); HCoV-NL63 (LLC-MK2 hücreleri); HCoV-229E (Huh7 hücreleri). Viral plak tahlillerinin nasıl yapılacağına ilişkin ayrıntılar bu makalenin kapsamı dışındadır, ancak daha önce Journal of Visualized Experiments (JoVE) yayın24'te ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
  4. İstenirse, bazal olarak salınan virüsün olmadığını doğrulamak için enfeksiyondan sonra çeşitli zamanlarda bazal ortamı toplayın. HCoV'ler tipik olarak nazal epitel hücrelerinden apikal olarak salınır, ancak bunu seyreltilmemiş bazal ortamın plak tahlili ile doğrular.
  5. ASL numunelerini −80 °C'de saklayın, eğer toplama gününde plak tahlili ile miktar tayini yapılmayacaksa.

3. Hücre içi virüsün ölçülmesi

  1. ASL örneğini topladıktan sonra, her bir transwell'i temel olarak% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren 500 μL DMEM ile önceden yüklenmiş 24 oyuklu temiz bir plakaya taşıyın.
    NOT: %2 FBS'li DMEM, sonraki donma-çözülme döngüleri sırasında virüsü stabilize etmek için kullanılır.
  2. Apikal olarak dökülen virüsün tamamen çıkarılmasını sağlamak için her bir transwell'i apikal olarak 3x PBS ile yıkayın.
  3. Son PBS yıkamasını çıkarmayı aspire ettikten sonra, apikal bölmeye% 2 FBS ile 100 μL DMEM ekleyin.
  4. Hem apikal hem de bazal ortam içeren transwells içeren plakayı −80 °C'lik bir dondurucuya taşıyın ve hücreleri parçalamak için art arda üç donma-çözülme döngüsünü tamamlayın.
  5. Son donma-çözülme döngüsünden sonra, apikal (100 μL) ve bazal (500 μL) ortamı temiz bir tüpte toplayın.
  6. Herhangi bir hücresel kalıntıyı toplamak için 500 × g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı topla. Bu, standart plak testi yoluyla titrasyon için hücre içi virüs örneğidir.
    NOT: ASL toplamaya göre toplama işlemi sırasında üç kat seyreltme meydana gelir; ASL örnekleri 200 μL PBS'de toplanırken, hücre içi virüs örneği toplam 600 μL hacimde toplanır.

4. Transepitelyal elektrik direnci (TEER) ölçümü

NOT: TEER ölçümü için kalsiyum ve magnezyum ile desteklenmiş PBS (PBS + Ca 2+/Mg 2+) kullanılmalıdır. Ohm cinsinden okumak için ayarlanmış bir epitelyal volt/ohmmetre kullanılır (Malzeme Tablosuna bakınız).

  1. EVOM cihazını üreticinin talimatlarına göre temizleyin, dengeleyin ve boşaltın; Boşluk için burun hücresi eklenmemiş "boş" bir transwell kullanın. Boş TEER ölçümünü kaydedin.
    NOT: Birden fazla virüs kullanılıyorsa, çapraz kontaminasyonu önlemek için EVOM cihazı koşullar arasında sıkı bir şekilde temizlenmelidir (p etanol ve ardından deiyonize su ile yıkamalar yeterlidir).
  2. Enfekte olmuş her bir transwell'i, transwell'lerden kalan bazal ortamı yıkamak için temel olarak 500 μL PBS + Ca 2 + / Mg2 + içeren önceden etiketlenmiş, temiz 24 oyuklu bir plakaya taşıyın.
  3. Her bir transwell'in apikal bölmesine 200 μL PBS + Ca 2 + / Mg2 + ekleyin.
  4. Endohm-6 ölçüm odasına 1 mL PBS + Ca 2+/Mg2+ ekleyin.
  5. Her bir transwell'i Endohm-6 ölçüm odasına taşıyın ve apikal elektrot apikal bölmedeki 200 μL PBS'de duracak şekilde odanın kapağını değiştirin; bazal elektrot Endohm-6 odasının altına yerleştirilmiştir.
  6. EVOM okumasının stabilize olmasına izin verin ve ham TEER ölçümünü kaydedin.
  7. Titre isteniyorsa, TEER ölçümünü aldıktan sonra yukarıda açıklandığı gibi ASL numunesi toplayın (TEER ölçümü için eklenen 200 μL PBS + Ca 2 + / Mg2 + 'da toplayın).
    NOT: ASL numunesinin toplanması, epitel bariyerinde TEER okumalarını karıştırabilecek mikro yırtılmalara neden olabilir, bu nedenle TEER ölçümünden sonra ASL toplanmalıdır. Ayrıca, TEER değerlerini de etkileyebileceğinden, TEER okumalarından hemen önce bazal ortam değiştirilmemelidir.
  8. Ham TEER okumalarını Ohm/cm2 cinsinden son ölçümlere dönüştürmek için, boş TEER değerini çıkarın ve denklem (1)'i kullanarak bu değeri transwell membranının yüzey alanıyla çarpın:
    TEER = [TEER okuması - boş TEER değeri] × (transwell'in yüzey alanı) (1)
  9. HCoV'ler için, enfeksiyondan sonra her 24 saat veya 48 saatte bir TEER'i değerlendirin; TEER değişikliklerinin kinetiği genellikle virüsler arasında farklılık gösterir ve çeşitli zaman noktalarında sorun gidermeyi gerektirir.
  10. TEER'i ölçerken, her zaman sahte enfekte kültürleri dahil edin ve her zaman noktasında değerlendirin (negatif kontrol).
    NOT: Sahte kültürler için, TEER ölçümleri sabit kalmalıdır veya kültürlerin farklılaşması tamamlandıktan sonra taban çizgisinden biraz artabilir. Membran desteklerinin yüzey alanı, transwell'lerin boyutuna ve üreticisine bağlı olarak değişecektir; 24 kuyulu transwelller tipik olarak 0.33cm2'lik bir yüzey alanına sahiptir.

5. Laktat dehidrojenaz (LDH) testi ile enfeksiyon sırasında sitotoksisitenin ölçülmesi

NOT: Bu çalışmada, ASL numunelerindeki LDH içeriği, ticari olarak temin edilebilen bir sitotoksisite tespit kiti kullanılarak ölçülmüştür. Bazal ortamdaki LDH sinyali genellikle tespit sınırının altındaydı ve HCoV ile enfekte kültürlerden alınan ASL örneklerinde ölçülen LDH'den genellikle daha az tekrarlanabilirdi.

  1. LDH testi için gerekli ek kontrolleri hazırlayın.
    1. Arka plan kontrolü: PBS kullanın (ASL örnekleri bu şekilde toplanmışsa kalsiyum ve magnezyum içeren PBS kullanın).
    2. Pozitif kontrol (tavan değeri): ALI'leri apikal olarak Triton X-100 ile tedavi edin. Triton kontrol kuyularını toplayın (tipik olarak her zaman noktasında bunun için üç ALI kültürü kullanın).
      1. PBS'de 200 μL% 2 Triton X-100'ü doğrudan transwell'in apikal bölmesine ekleyin.
      2. Hücrelerin tamamen parçalanmasına izin vermek için 10-15 dakika inkübe edin.
      3. Tüm hacmi bir Triton tavan örneği olarak toplayın.
    3. Negatif kontrol (düşük kontrol / başlangıç LDH salınımı): enfekte kültürlerle aynı donörden türetilen sahte enfekte ALI kültürlerinden ASL toplayın.
      1. Yukarıdaki ASL toplama prosedürünü izleyerek negatif kontrol sahte ASL'yi toplayın.
        NOT: Bu negatif kontrol için tüm zaman noktaları için aynı transwell'ler kullanılabilirken, Triton kontrolü için her zaman noktası için yeni transwell'ler gerekli olacaktır.
  2. Her ASL örneğinden LDH okumalarına ek olarak dökülen virüsün miktarının belirlenmesine izin vermek için, aşağıdaki gibi optik olarak net düz tabanlı siyah 96 oyuklu bir plaka yükleyin:
    1. 45 μL numune ve 55 μL PBS (100 μL toplam hacim) kullanarak tüm numuneleri PBS'de seyreltin.
    2. Triton pozitif kontrol ve sahte arka plan kontrol örneklerini aynı şekilde tedavi edin.
      NOT: Bu seyreltme, her deneysel numunenin (45 μL x 3) üçlü yüklenmesine ve plak tahlili yoluyla titre için yeterli kalıntı ASL hacmine izin verir.
    3. LDH plakasını üç kopya halinde yükleyin: Triton tavan, sahte arka plan kontrolü, PBS kontrolü ve deneysel numuneler.
    4. Reaksiyon karışımını üretici tarafından belirtildiği gibi hazırlayın (boya çözeltisi + katalizör).
      1. Her bir oyuğa 100 μL reaksiyon karışımı ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca ışıktan koruyarak inkübe edin.
    5. 20 dakika sonra, absorbansı 492 nm'de ölçün.
    6. Denklem (2)'yi kullanarak Triton tavan değerine göre yüzde sitotoksisiteyi hesaplayın.
      Sitotoksisite (%) figure-protocol-1 (2)

6. İmmünofloresan (IF) görüntüleme için nazal ALI kültürlerinin hazırlanması

  1. Transwell'i 24 oyuklu yeni bir plakaya taşıyın ve PBS ile apikal olarak 3 kez yıkayın (titre ediyorsanız ilk PBS yıkamasını ASL olarak toplayın; daha sonra, IF kalitesini engelleyebilecek fazla dökülen virüsü çıkarmak için iki ek PBS yıkaması yapın)
  2. Son PBS yıkamasından sonra, transwell'i apikal ve bazal olarak% 4 PFA ile kaplayın.
  3. % 4 PFA'da sabitlemek için 30 dakika inkübe edin ve ardından 3x'i çıkarın ve PBS ile yıkayın.
  4. Keskinleştirilmiş bir tıraş bıçağı veya makas kullanarak hücreleri içeren transwell desteğini kesin.
  5. Her transwell için IF hedeflerinin sayısını artırmak için, her bir zarı ikiye bölün ve her bir yarıyı farklı antikor kombinasyonları ile boyayın.
  6. PBS'de% 0.2 Triton X-100 ile 10 dakika geçirgen.
  7. Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca PBST'de (PBS +% 0.2 Triton X-100) normal eşek serumu ve% 1 BSA ile bloklayın.
    NOT: S'yi koruyunampbu adımdan itibaren ışığa maruz kalmaktan.
  8. Birincil antikor çözeltisi içinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Tüm antikorları bloke edici tamponda 1: 1.000 oranında seyreltin.
    NOT: HCoV nükleokapsid boyaması için temsili antikorların yanı sıra epitel hücre tipi belirteçleri ve hücre iskeleti boyaları aşağıda listelenmiştir (üretici bilgileri ve katalog numaraları için Malzeme Tablosuna bakın).
    1. HCoV antijen boyaması için SARS-CoV-2 nükleokapsid, MERS-CoV nükleokapsid ve HCoV-NL63 nükleokapsidi hedefleyen antikorlar kullanın.
    2. Epitel hücre tiplerini tanımlamak için, goblet hücre belirteci MUC5AC ve kirpikli hücre belirteci tip IV β-tubulini hedefleyen antikorlar kullanın.
    3. Hücre iskeleti belirteçleri için, falloidine (F-aktini bağlar) ve epitel hücre adezyon belirtecine karşı yönlendirilmiş antikorlar kullanın: EpCAM (CD326).
  9. İkincil antikor çözeltisinde oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin; Bloke edici tamponda 1: 1.000 oranında seyreltilmiş ikincil antikor boyaları kullanın.
  10. Boyama tamamlandıktan sonra, membranı bir spatula ile bir cam slayt üzerine aktarın, transwell'i apikal tarafı slayta doğru yönlendirin ve montaj solüsyonu ekleyin. Kenarlara şeffaf oje sürmeden önce 15-30 dakika bekletin.
  11. Konfokal mikroskop kullanarak görüntü elde edin (Z ekseni adımı: 0,5 μm; sıralı tarama)1,16,17.
    NOT: Kültürlerin %4 PFA'da fiksasyonundan ve PBS ile yıkanmasından sonra, sabit kültürler boyama ve görüntüleme için hazırlanmadan önce haftalar ila aylar boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Membranların boyanması ve montajından sonra, numuneler karanlıkta 4 °C'de uzun süreli (>2 yıl) saklanabilir.

7. Batı immünoblotlama için hücre içi protein veya RT-qPCR analizi için RNA toplanması

  1. Viral titreleri ölçerken yukarıda açıklandığı gibi ASL'yi toplayın (protokol bölüm 2).
  2. Membranın kazınması ek parçanın kırılmasına neden olabileceğinden, transwell'i 24 oyuklu temiz bir plakaya taşıyın.
  3. Western blot analizi için, proteaz inhibitörleri ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenmiş 125 μL RIPA tamponunda (50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl,% 0.5 deoksikolat,% 0.1 SDS,% 1 NP40) toplam protein lizatı toplayın.
  4. Apikal bölmeye 125 μL RIPA tamponu ekleyin ve 5-10 dakika inkübe edin.
  5. Kalan bağlı hücreleri çıkarmak için bir P200 pipet ucu kullanarak membranı kazıyın ve tüm hacmi toplayın (membranın tüm yüzeyini kuvvetlice kazıyın ve ardından tüm numuneyi toplamak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin).
  6. Protein lizat örneklerini buz üzerinde 10 dakika inkübe edin ve ardından 4 °C'de 10 dakika boyunca maksimum hızda (20.000 × g) santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı, üretici protokollerine göre β-merkaptoetanol (indirgeyici ajan) ile 4x Laemmli numune tamponu ile karıştırın.
  8. Protein örneklerini 95 °C'de 5 dakika kaynatın ve ardından geleneksel batı kurutma protokollerini 1,16,17 kullanarak çalıştırın.
  9. Toplam RNA'nın toplanması için, piyasada bulunan bir RNA ekstraksiyon kitini kullanın.
    NOT: 24 oyuklu transwell eklerinin apikal bölmesi maksimum ~200 μL hacme sahiptir; Böylece, önerilen toplam hacme ulaşmak için her kültürde iki ardışık yıkama gerçekleştiriyoruz. Aşağıdaki ayrıntılar, 350 μL toplam hacimde önerilen RNA örneklerinin toplanmasına karşılık gelir.
  10. Enfekte transwell'in apikal bölmesine 200 μL lizis tamponu ekleyin.
  11. 5-10 dakika bekletin, bir pipet ucu kullanarak zardan kalan hücreleri kazıyın ve tüm hacmi etiketli bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
  12. Transwell'in apikal bölmesine 150 μL ek lizis tamponu ekleyin ve aynı mikrosantrifüj tüpüne toplamadan önce yukarı ve aşağı pipetleyin.
  13. RNA'yı üreticinin protokolüne göre çıkarın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Temsili rakamlar kısmen Otter ve ark.1 el yazmasında bulunabilecek verilerden uyarlanmıştır. Dört veya altı donörden türetilen nazal ALI kültürleri, yukarıda açıklanan protokollere göre dört HCoV'den (SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-NL63 ve HCoV-229E) biri ile enfekte edildi ve her virüs için ortalama apikal olarak dökülen viral titreler Şekil 1A'da gösterilmiştir. Bu HCoV'lerin dördü de nazal ALI kültürlerinde verimli bir şekilde çoğalırken, SARS-CoV-2 ve HCoV-229E en ver...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada detaylandırılan yöntemler, hasta kaynaklı nazal epitel hücrelerinin bir hava-sıvı arayüzünde büyütüldüğü ve HCoV-konakçı etkileşimlerinin incelenmesine uygulandığı bir primer epitel kültürü sistemini tanımlamaktadır. Farklılaştıktan sonra, bu nazal ALI kültürleri, siliatlı, kadeh ve bazal hücrelerin temsil edildiği heterojen bir hücresel popülasyonun yanı sıra sağlam bir şekilde atan kirpikler ve mukus sekresyonu ile bozulmamış mukosiliyer fonksiyon da dahil olmak üzere in vivo nazal epitelin birçok özell...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Susan Weiss, Ocugen'in Bilimsel Danışma Kurullarında yer almaktadır. Noam A. Cohen, GSK, AstraZeneca, Novartis, Sanofi/Regeron ve Oyster Point Pharmaceuticals'a danışmanlık yapmaktadır ve "Solunum Yolu Enfeksiyonu için Tedavi ve Teşhis" (10,881,698 B2, WO20913112865) ABD Patentine ve GeneOne Life Sciences ile bir lisans anlaşmasına sahiptir.

Teşekkürler

Bu çalışma aşağıdaki finansman kaynaklarına sahiptir: Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01AI 169537 (SRW ve NAC), NIH R01AI 140442 (SRW), VA Merit İnceleme CX001717 (NAC), VA Merit İnceleme BX005432 (SRW ve NAC), Penn Koronavirüsler ve Diğer Ortaya Çıkan Patojenler Araştırma Merkezi (SRW), Laffey-McHugh Vakfı (SRW ve NAC), T32 AI055400 (CJO), T32 AI007324 (AF).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor ikincil antikorları (488, 594, 647)InvitrogenÇeşitli
BSA (sığır serum albümini)Sigma-AldrichA7906
cOmplete mini EDTA içermeyen proteaz inhibitörüRoche11836170001
Sitotoksisite tespit kitiRoche11644793001
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Eagle Media)Gibco11965-084
DPBS (Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini)Gibco14190136
DPBS + kalsiyum + magnezyumGibco14040-117
Endohm-6G ölçüm odasıWorld Precision InstrumentsENDOHM-6G
Epitel hücre adezyon markörü (EpCAM; CD326)eBiosciences14-9326-82
Epitelyal Volt / Ohm (TEER) Metre (EVOM)Dünya Hassas Aletleri300523
FBS (Fetal Sığır Serumu)HyCloneSH30071.03
Görüntüleme için FV10-ASW yazılımıOlympusSürüm 4.02
HCoV-NL63 (İnsan koronavirüsü, NL63)BEI KaynaklarıNR-470
HCoV-NL63 nükleokapsid antikoruÇin Biyolojik40641-V07E
Hoescht boyasıThermo FisherH3570
Laemmli numune tamponu (4x)BIO-RAD1610747
LLC-MK2 hücreleriATCCCCL-7HCoV-NL63'ü titre etmek için
MERS-CoV (İnsan koronavirüsü, Orta Doğu Solunum Sendromu Koronavirüsü (MERS-CoV), EMC/2012)BEI Kaynakları NR-44260
MERS-CoV nükleokapsid antikoruÇin Biyolojik40068-MM10
MUC5AC antikoruSigma-AldrichAMAB91539
Olympus Fluoview konfokal mikroskopOlympusFV1000
Phalloidin-iFluor 647 lekeAbcamab176759
PhosStop easy pack (fosfataz inhibitörleri) & nbsp;RochePHOSS-RO
Plaka okuyucu Perkin ElmerHH34000000Herhangi bir plaka okuyucu veya ELISA okuyucu yeterlidir; 492 nm
RIPA tamponunda (50 mM Tris pH 8; 150 mM NaCl; %0.5 deoksikolat; %0.1 SDS; %1 NP40)Thermo Fisher89990Kurum içinde hazırlanabilir veya
RNeasy Plus KitQiagen74134
satın alabilir SARS-CoV-2 (SARS ile İlgili Koronavirüs 2, ABD-WA1/2020'yi İzole Edin)BEI KaynaklarıNR-52281
SARS-CoV-2 nükleokapsid antikoruGenetexGTX135357
Triton-X 100Fisher ScientificBP151100
Tip IV ve beta;- tübülin antikoruAbcamab11315
VeroCCL81 hücreleriATCCCCL-81MERS-CoV
VeroE6 hücreleriniATCCCRL-1586SARS-CoV-2'yi titre etmek için
titre etmek için

Kaynaklar

  1. Otter, C. J., et al. Infection of primary nasal epithelial cells differentiates among lethal and seasonal human coronaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (15), 2218083120(2023).
  2. Fehr, A., Perlman, S. Coronaviruses: An overview of their replication and pathogenesis. Methods in Molecular Biology. 1282, 1-23 (2015).
  3. Gaunt, E. R., Hardie, A., Claas, E. C. J., Simmonds, P., Templeton, K. E. Epidemiology and clinical presentations of the four human coronaviruses 229E, HKU1, NL63, and OC43 detected over 3 years using a novel multiplex real-time PCR method. Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2940-2947 (2010).
  4. Kesheh, M. M., Hosseini, P., Soltani, S., Zandi, M. An overview on the seven pathogenic human coronaviruses. Reviews in Medical Virology. 32 (2), 2282(2022).
  5. MERS-CoV Worldwide Overview. European Centre for Disease Prevention and Control. , Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/middle-east-respiratory-syndrome-coronavirus-mers-cov-situation-update (2022).
  6. MERS Situation Update. World Health Organization Regional Office for the Eastern Mediterranean. , Available from: http://www.emro.who.int/health-topics/mers-cov/mers-outbreaks.html (2022).
  7. Cao, Y., Liu, X., Xiong, L., Cai, K. Imaging and clinical features of patients with 2019 novel coronavirus SARS-CoV-2: A systematic review and meta-analysis. Journal of Medical Virology. 92 (9), 1449-1459 (2020).
  8. Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses. Clinical Microbiology Reviews. 24 (1), 210-229 (2011).
  9. Farzal, Z., et al. Comparative study of simulated nebulized and spray particle deposition in chronic rhinosinusitis patients. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 746-758 (2019).
  10. Gaeckle, N. T., Pragman, A. A., Pendleton, K. M., Baldomero, A. K., Criner, G. J. The oral-lung axis: The impact of oral health on lung health. Respiratory Care. 65 (8), 1211-1220 (2020).
  11. Hou, Y., et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract. Cell. 182, 429-446 (2020).
  12. Hariri, B. M., Cohen, N. A. New insights into upper airway innate immunity. American Journal of Rhinology and Allergy. 30 (5), 319-323 (2016).
  13. Hiemstra, P. S., McCray, P. B., Bals, R. The innate immune function of airway epithelial cells in inflammatory lung disease. European Respiratory Journal. 45 (4), 1150-1162 (2015).
  14. Hatton, C. F., et al. Delayed induction of type I and III interferons mediates nasal epithelial cell permissiveness to SARS-CoV-2. Nature Communications. 12 (1), 7092(2021).
  15. Sungnak, W., et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nature Medicine. 26 (5), 681-687 (2020).
  16. Li, Y., et al. SARS-CoV-2 induces double-stranded RNA-mediated innate immune responses in respiratory epithelial-derived cells and cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (16), 2022643118(2021).
  17. Comar, C. E., et al. MERS-CoV endoribonuclease and accessory proteins jointly evade host innate immunity during infection of lung and nasal epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (21), 2123208119(2022).
  18. Lee, R. J., et al. Bacterial D-amino acids suppress sinonasal innate immunity through sweet taste receptors in solitary chemosensory cells. Science Signaling. 10 (495), (2017).
  19. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385(2018).
  20. Comer, D. M., Elborn, J. S., Ennis, M. Comparison of nasal and bronchial epithelial cells obtained from patients with COPD. PLoS One. 7 (3), e32924(2012).
  21. Vanders, R. L., Hsu, A., Gibson, P. G., Murphy, V. E., Wark, P. A. B. Nasal epithelial cells to assess in vitro immune responses to respiratory virus infection in pregnant women with asthma. Respiratory Research. 20 (1), 259(2019).
  22. Lee, R. J., et al. Fungal aflatoxins reduce respiratory mucosal ciliary function. Scientific Reports. 6, 33221(2016).
  23. Patel, N. N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy and Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
  24. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. 93 (93), e52065(2014).
  25. Robinot, R., et al. SARS-CoV-2 infection induces the dedifferentiation of multiciliated cells and impairs mucociliary clearance. Nature Communications. 12 (1), 4354(2021).
  26. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Annals of the American Thoracic Society. 15, S143-S148 (2018).
  27. Gao, N., Raduka, A., Rezaee, F. Respiratory syncytial virus disrupts the airway epithelial barrier by decreasing cortactin and destabilizing F-actin. Journal of Cell Science. 135 (16), 259871(2022).
  28. Schmidt, H., et al. IL-13 impairs tight junctions in airway epithelia. International Journal of Molecular Sciences. 20 (13), 3222(2019).
  29. Huang, Z. Q., et al. Interleukin-13 alters tight junction proteins expression thereby compromising barrier function and dampens rhinovirus induced immune responses in nasal epithelium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 572749(2020).
  30. Saatian, B., et al. Interleukin-4 and interleukin-13 cause barrier dysfunction in human airway epithelial cells. Tissue Barriers. 1 (2), e24333(2013).
  31. Coles, J. L., et al. A revised protocol for culture of airway epithelial cells as a diagnostic tool for primary ciliary dyskinesia. Journal of Clinical Medicine. 9 (11), 3753(2020).
  32. Baldassi, D., Gabold, B., Merkel, O. M. Air−liquid interface cultures of the healthy and diseased human respiratory tract: Promises, challenges, and future directions. Advanced NanoBiomed Research. 1 (6), 2000111(2021).
  33. Seibold, M. A. Interleukin-13 stimulation reveals the cellular and functional plasticity of the airway epithelium. Annals of the American Thoracic Society. 15, S98-S106 (2018).
  34. Morrison, C. B., et al. SARS-CoV-2 infection of airway cells causes intense viral and cell shedding, two spreading mechanisms affected by IL-13. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (16), 2119680119(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İnsan KoronavirüsleriKonak-Patojen EtkileşimleriViral Replikasyon KinetiğiTEER ÖlçümüSitotoksisite AnaliziRNA DizilemePlak AnaliziDoğal Bağışıklık İndüksiyonu
İnsan Koronavirüs-Konakçı Etkileşimlerini Karakterize Etmek için Hava-Sıvı Arayüzünde Büyütülen Primer Nazal Epitel Hücrelerinin Enfeksiyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.