Yöntem makalesi

Sığır Monosit Kaynaklı Dendritik Hücreler Kullanılarak Aşı İmmünojenitesinin Belirlenmesi

DOI:

10.3791/64874

⸱

19 Mayıs 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Animal Production and Health Section, Joint Food and Agriculture Organization (FAO)/International Atomic Energy Agency (IAEA) Centre of Nuclear Techniques in Food and Agriculture, International Atomic Energy Agency, 2Teaching and Research Farm Kremesberg, Clinical Unit for Herd Health Management in Ruminants, Department for Farm Animals and Veterinary Public Health, University of Veterinary Medicine, Vienna

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodoloji, sığır monosit kaynaklı dendritik hücrelerin (MoDC'ler) oluşumunu ve sığırlarda potansiyel veteriner aşılarının geliştirilmesi sırasında antijenik adayların in vitro değerlendirilmesi için uygulamalarını açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dendritik hücreler (DC'ler), bağışıklık sistemi içindeki en güçlü antijen sunan hücrelerdir (APC'ler). Patojen arayan organizmayı devriye gezerler ve doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık tepkilerini birbirine bağlayarak bağışıklık sistemi içinde benzersiz bir rol oynarlar. Bu hücreler fagositleşebilir ve daha sonra yakalanan antijenleri efektör bağışıklık hücrelerine sunarak çeşitli immün yanıtları tetikleyebilir. Bu yazıda, sığır periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) izole edilen sığır monosit türevi dendritik hücrelerin (MoDC'ler) in vitro jenerasyonu ve aşı immünojenitesinin değerlendirilmesinde uygulanması için standartlaştırılmış bir yöntem gösterilmektedir.

CD14 + monositlerini PBMC'lerden izole etmek için manyetik bazlı hücre sıralama kullanıldı ve CD14 + monositlerin naif MoDC'lere farklılaşmasını indüklemek için interlökin (IL)-4 ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile tam kültür ortamının takviyesi kullanıldı. Olgunlaşmamış MoDC'lerin oluşumu, majör histokompatibilite kompleksi II (MHC II), CD86 ve CD40 hücre yüzey belirteçlerinin ekspresyonu tespit edilerek doğrulandı. Ticari olarak temin edilebilen bir kuduz aşısı, daha sonra naif lenfositlerle birlikte kültürlenen olgunlaşmamış MoDC'lerin nabzını tutmak için kullanıldı.

Antijen atımlı MoDC'lerin ve lenfosit ko-kültürünün akım sitometri analizi, Ki-67, CD25, CD4 ve CD8 belirteçlerinin ekspresyonu yoluyla T lenfosit proliferasyonunun uyarıldığını ortaya koydu. IFN-γ ve Ki-67'nin mRNA ekspresyonunun kantitatif PCR kullanılarak analizi, MoDC'lerin bu in vitro ko-kültür sisteminde lenfositlerin antijene özgü astarlanmasını indükleyebileceğini göstermiştir. Ayrıca, ELISA kullanılarak değerlendirilen IFN-γ sekresyonu, kuduz aşısı darbeli MoDC-lenfosit ko-kültüründe, antijen darbeli olmayan MoDC-lenfosit ko-kültürüne göre anlamlı derecede daha yüksek bir titre (**p < 0.01) göstermiştir. Bu sonuçlar, aşı immünojenitesini ölçmek için bu in vitro MoDC testinin geçerliliğini göstermektedir, yani bu tahlil, in vivo denemelere devam etmeden önce sığırlar için potansiyel aşı adaylarını tanımlamak ve ticari aşıların aşı immünojenisite değerlendirmelerinde kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Veteriner aşılaması, hayvancılık sektörünü küresel olarak etkileyen hastalıklara karşı koruma sağlayarak gıda güvenliğinin ve hayvan refahının iyileştirilmesine katkıda bulunduğundan, hayvancılık ve sağlığın çok önemli bir yönünü temsil etmektedir1. Olası aşı adaylarının immünojenisitesini değerlendirmek için etkili bir in vitro yöntem, aşı geliştirme ve üretim sürecini hızlandırmaya yardımcı olacaktır. Bu nedenle, immün tahliller alanını in vitro çalışmalara dayanan yenilikçi metodolojilerle genişletmek gereklidir, çünkü bu, bağışıklama ve patojen enfeksiyonu ile ilgili bağışıklık süreçlerinin karmaşıklığını ortaya çıkarmaya yardımcı olacaktır. Şu anda, periyodik örnekleme gerektiren in vivo hayvan bağışıklaması ve meydan okuma çalışmaları (örneğin, kan ve dalak), aday aşıların ve adjuvanların immünojenisitesini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu tahliller pahalı, zaman alıcı ve etik etkileri vardır, çünkü çoğu durumda hayvan ötenazisi denemelerin sonunda gerçekleştirilir.

İn vivo testlere alternatif olarak, in vitro2'de aşı kaynaklı immün yanıtları değerlendirmek için periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler) kullanılmıştır. PBMC'ler %70-90 lenfositler, %10-20 monositler ve sınırlı sayıda dendritik hücreden (DC'ler, %1-%2)3 oluşan heterojen bir hücre popülasyonudur. PBMC'ler, B hücreleri, monositler ve DC'ler gibi antijen sunan hücreleri (APC'ler) barındırır ve bunlar enfeksiyon veya doku hasarı belirtileri arayan organizmada sürekli devriye gezer. Lokal olarak salgılanan kemokinler, hücre yüzey reseptörlerine bağlanarak APC'lerin bu bölgelere alınmasını ve aktivasyonunu kolaylaştırır. Monositler söz konusu olduğunda, kemokinler kaderlerini DC'lere veya makrofajlara farklılaşmayayönlendirir 4. DC'ler bir patojenle karşılaşıp yakaladıkları anda, sekonder lenfoid organlara göç ederler, burada işlenmiş patojen peptid antijenlerini majör histokompatibilite kompleksi (MHC) sınıf I veya sınıf II yüzey proteinlerini kullanarak sırasıyla CD8 + T hücrelerine veya CD4 + T hücrelerine sunabilirler, böylece bir bağışıklık tepkisini tetiklerler 5,6.

DC'lerin çeşitli patojenlere karşı koruyucu bir bağışıklık tepkisi düzenlemede oynadığı kilit rol, özellikle enfeksiyöz ajanlara karşı aşılar ve adjuvanlar tasarlarken, onları hücre içi bağışıklık mekanizmalarını anlamak için ilginç bir araştırma hedefi haline getirmektedir7. PBMC'lerden elde edilebilecek DC'lerin fraksiyonu oldukça küçük olduğundan (% 1 -% 2), bunun yerine in vitro8'de DC'ler üretmek için monositler kullanılmıştır. Bu monosit türevi DC'ler (MoDC'ler) başlangıçta kanser immünoterapisinde olası bir tedavi stratejisi olarak geliştirilmiştir9. Daha yakın zamanlarda, MoDC'ler aşı araştırmaları için kullanılmıştır10,11,12 ve klasik monositler MoDC üretimi için baskın alt tiptir (% 89) 13. MoDC'lerin in vitro üretimi daha önce interlökin-4 (IL-4), tümör nekroz faktörü α (TNF-α) veya IL-1314,15,16 gibi diğer sitokinlerle kombinasyon halinde verilen granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktörün (GM-CSF) eklenmesiyle sağlanmıştır.

Bir in vitro MoDC testinin başarısı, antijenle uyarılmış olgun MoDC'lerin, tespit edilen antijen tipine özgü immün yanıtın kapsamını ve tipini modüle etme kapasitesine dayanır17. MoDC'ler tarafından tanınan ve sunulan patojen tipi, CD4 + T yardımcı (Th) hücrelerinin Th1, Th2 veya Th17 efektör hücrelerine farklılaşmasını belirler ve patojene özgü bir sekretuar sitokin profili ile karakterize edilir. Hücre içi patojenlere karşı bir Th1 yanıtı ortaya çıkar ve fagositik bağımlı korumayı modüle eden interferon-gama (IFN-γ) ve tümör nekroz faktörü beta'nın (TNF-β) salgılanmasıyla sonuçlanır. Paraziter organizmalara karşı bir Th2 yanıtı tetiklenir ve fagositik bağımsız humoral korumayı başlatan IL-4, IL-5, IL-10 ve IL-13 sekresyonu ile karakterizedir. Th17, IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 ve TNF-18,19,20,21 salgılanmasının aracılık ettiği hücre dışı bakteriyel ve fungal enfeksiyonlara karşı nötrofil bağımlı koruma sağlar α. Önceki çalışmalara dayanarak, tüm patojenlerin beklenen sitokin profiline girmediği belirtilmiştir. Örneğin, dermal MoDC'ler, Leishmania paraziter enfeksiyonuna yanıt olarak, CD4 + T hücrelerinden ve CD8 + T hücrelerinden IFN-γ sekresyonunu uyarır, böylece koruyucu bir proinflamatuar Th1 yanıtını indükler22.

Ayrıca, Salmonella lipopolisakkarit (LPS) ile astarlanmış tavuk MoDC'lerinde, hem Th1 hem de Th2 yanıtlarını aktive ederek Salmonella typhimurium'a karşı değişken bir yanıt indükleyebileceği, oysa Salmonella gallinarum'un tek başına bir Th2 yanıtını indüklediği gösterilmiştir, bu da ikincisinin MoDC klirensi23'e karşı daha yüksek direncini açıklayabilir. MoDC'lerin Brucella canis'e (B. canis) karşı aktivasyonu hem köpek hem de insan MoDC'lerinde de bildirilmiştir, yani bu zoonotik bir enfeksiyon mekanizmasını temsil edebilir24. B. canis ile astarlanan insan MoDC'leri, şiddetli enfeksiyona direnç kazandıran güçlü bir Th1 yanıtını indüklerken, köpek MoDC'leri, azaltılmış bir Th1 yanıtı ile baskın bir Th17 yanıtını indükler ve daha sonra kronik enfeksiyonun kurulmasına yol açar25. Sığır MoDC'leri, immünoglobulin G (IgG) ile konjuge edilmiş ayak ve ağız hastalığı virüsü (FMDV) için, tek başına konjuge olmayan FMDV'ye kıyasla gelişmiş bir afinite gösterir, çünkü MoDC'ler önceki10'a yanıt olarak bir viral-antikor kompleksi oluşturur. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar MoDC'lerin patojen enfeksiyonu sırasında bağışıklık tepkilerinin karmaşıklığını analiz etmek için nasıl kullanıldığını göstermektedir. Adaptif immün yanıtlar, lenfosit proliferasyonu ile ilişkili spesifik belirteçlerin nicelleştirilmesi ile değerlendirilebilir. Sadece bölünen hücrelerde tespit edilen hücre içi bir protein olan Ki-67, proliferasyon çalışmaları için güvenilir bir belirteç olarak kabul edilir 26 ve benzer şekilde, aktivasyonun geç fazı sırasında T hücrelerinin yüzeyinde eksprese edilen CD25, lenfosit proliferasyonunakarşılık gelir 27,28.

Bu çalışma, sığır MoDC'lerinin in vitro jenerasyonu için standartlaştırılmış bir yöntem ve ardından aşıların immünojenisitesini test etmek için kullanılan in vitro immün tahlilde uygulanmasını göstermektedir. Bu tahlilin etkinliğini doğrulamak için ticari olarak temin edilebilen bir kuduz aşısı (RV) kullanılmıştır. T lenfosit aktivasyonu ve proliferasyonu, Ki-67 ve CD25 gibi iyi bilinen hücre aktivasyon belirteçlerinin analizi ve IFN-γ28,29,30,31 sekresyonu yoluyla akım sitometrisi, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile ölçüldü. MoDC testi sırasında hiçbir hayvan veya insan deney denemesi yapılmaz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan alımı, Avusturya Sağlık ve Gıda Güvenliği Ajansı'nın (AGES) etik kurallarına ve kabul edilen hayvan refahı standartlarına uygun olarak sertifikalı bir veteriner servisi tarafından gerçekleştirilir32. Çalışma Avusturya Tarım Bakanlığı'ndan etik onay aldı. MoDC'lerin üretimi için deneysel tasarım ve sonraki uygulamaları Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Naif MoDC'lerin üretimi

NOT: Heparinize vakuminerlerle juguler ven ponksiyonu ile patojensiz tek bir buzağıdan tam kan örnekleri alındı (bu çalışma için sekiz adet 9 mL kan tüpü kullanıldı). Kanı bir buz kutusunda taşıyın. Numuneleri daha sonra kullanmak üzere 2-4 ° C'de saklayın veya hemen işleyin. Kanın pıhtılaşmasını önlemek için kanın dönmesini sağlayın. Vakumerleri% 70 etanol ile sterilize edin. Aşağıdaki deneylerin tümü bir biyolojik örnek ve altı teknik kopya ile gerçekleştirilmiştir.

  1. PBMC'leri heparinize kandan izole etmek için yoğunluk gradyanı santrifüjleme
    1. Kanı 10x ters çevirerek iyice karıştırın.
    2. 10 mL'lik bir pipet kullanarak, 20 mL heparinize kanı steril 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin.
    3. Steril 50 mL'lik bir tüpe 15 mL lenfosit izolasyon ortamı pipet.
      NOT: Pipetlemeden önce lenfosit izole edici ortamın oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin.
    4. Lenfosit izolasyon ortamını içeren 50 mL'lik tüpü 45° konuma kadar eğin. 25 mL'lik bir pipetin ucunu dik olarak doğrultun ve 30 mL'lik kan-PBS'yi lenfosit izolasyon ortamının üzerine, ikisini karıştırmadan dikkatlice katmanlayın. Çok yavaşça, 50 mL'lik tüpü dikey konuma geri getirin.
    5. 20 °C'de 35 dakika boyunca 800 × g'da santrifüj, maksimum hızlanma ile ve frenleme olmadan (yavaşlama fonksiyonu kapalı).
    6. PBMC katmanını (ilk plazma katmanından hemen sonraki ince beyaz tabaka) toplamak ve yeni bir 50 mL tüpe aktarmak için bir Pasteur pipeti kullanın.
      NOT: Yoğunluk gradyanı santrifüjleme, tam kanı farklı katmanlara ayırır. Sonuç olarak, eritrositler bir pelet olarak tabana yerleşir, mononükleer hücreler (PBMC'ler) arayüz tabakasına yerleşir ve plazma üst tabakayı oluşturur. Granülositler pelet ve PBMC tabakası arasında bulunur.
    7. Hasat edilen PBMC'leri 40 mL'lik bir hacme kadar PBS ekleyerek ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırarak 2 kat yıkayın. Daha sonra, maksimum hızlanma ve maksimum yavaşlama ile 7 dakika boyunca 4 ° C'de 500 × g'da santrifüj.
    8. Süpernatantı dekantasyonla atın, peleti 15 mL 1x amonyum-klorür-potasyum (ACK) tamponunda tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında 10-15 dakika inkübe edin.
      NOT: 15 dakikadan fazla inkübe etmeyin. Ticari olarak temin edilebilen ACK tamponu, PBMC fraksiyonunda bulunan artık kırmızı kan hücrelerinin (RBC'ler) parçalanmasını sağlamak için kullanılır.
    9. 40 mL'lik bir hacme kadar PBS ekleyin ve ardından maksimum hızlanma ve yavaşlama ile 7 dakika boyunca 500 × g ve 4 ° C'de santrifüj yapın.
    10. Süpernatantı boşaltarak atın ve adım 1.1.9'u tekrarlayın.
    11. Süpernatanı atın ve peleti 10 mL tam kültür ortamında (oda sıcaklığında) tekrar askıya alın.
      NOT: Tüm kültür ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş RPMI 1640 hücre kültürü ortamından oluşur.
  2. CD14+/− hücrelerinin PBMC popülasyonundan CD14-konjuge manyetik boncuklar kullanılarak manyetik olarak ayrılması
    1. 10 μL tripan mavisi (% 0.4) çözeltisi ile karıştırılmış 10 μL hücre süspansiyonu kullanarak temiz bir hemositometre hücre sayacı ile hücreleri sayın.
      NOT: Tripan mavisi boya toksik bir kimyasal ve potansiyel kanserojendir. Temastan kaçınmak için kişisel koruyucu ekipman (KKD) giyilirken kullanılmalı ve atıklar hava geçirmez özel bir toksik atık kabına atılmalıdır. Ölü hücreler mavi görünürken, canlı hücreler mikroskop altında net görünecektir.
    2. 500 × g'da 7 dakika boyunca santrifüj.
    3. Bir pipet kullanarak süpernatantı atın ve her 1 × 107 hücre için 40 μL'lik bir hacim kullanarak peleti floresanla aktive edilmiş hücre sıralama tamponunda (FACS) yeniden askıya alın. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
      NOT: FACS tamponu, PBS'de çözünmüş %2 FBS ve 2 mM etilendiamintetraasetik asitten (EDTA) oluşur.
    4. 1 ×10 7 hücre başına 5 μL CD14 mikroboncuk tamponu ekleyin ve bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
    5. Sığır CD14 + monositlerinin pozitif seçimi için 4-8 ° C'de 30 dakika inkübe edin33. Kuluçka döneminde her 15 dakikada bir vorteks.
    6. İsteğe bağlı adım (akış sitometri analizi için): 10 μL CD14-FITC (floresein izotiyosiyanat) boyama antikoru ekleyin ve ardından 4-8 ° C'de 15 dakika boyunca inkübasyon yapın. Ayrıntılar için adım 5'teki akış sitometrisi analizine bakın.
    7. 1 mL FACS tamponu ekleyin ve 500 × g'da 7 dakika boyunca santrifüj yapın.
    8. Süpernatanı atın ve peleti 1 × 108 hücre başına 500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
    9. İmmünomanyetik hücre ayırma kolonunu separatöre (manyetik kolon tutucu) yerleştirin ve akışı toplamak için kolon çıkışının altına 15 mL'lik bir toplama tüpü yerleştirin.
    10. Kolonu 1 mL gazdan arındırılmış FACS tamponu ile yıkayın. Durulamadan sonra, kullanılmış 15 mL tüpü yenisiyle değiştirin.
    11. Bir seferde 500 μL tamponda 1 × 10 8 hücreye pipetleme yaparak hücre süspansiyonunun (adım 1.2.8'den itibaren) kolondan geçmesine izin verin.
      NOT: Kolondan geçmesine izin vermeden önce hücreleri karıştırırken hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin.
    12. Kolonu her seferinde 3 mL gazdan arındırılmış FACS tamponu ile 3 kat durulayın.
    13. Akışı toplayın ve bu ilk salınımlı fraksiyonu CD14− hücre fraksiyonu olarak etiketleyin (PBMC'ler eksi CD14+ monositler); Bu aynı zamanda naif lenfosit fraksiyonu olarak da adlandırılır.
      NOT: CD14 hücreleri , antijen darbeli MoDC'ler üretilene kadar tam kültür ortamında tutulur.
    14. Sütunu ayırıcıdan çıkarın.
    15. Atık suyun toplanması için kolonun altına yeni bir steril 15 mL tüp yerleştirin.
    16. Pipet, 5 mL FACS tamponunu kolona yerleştirin ve bir piston kullanarak hemen itin.
    17. Akışı toplayın ve bu ikinci salınımlı fraksiyonu CD14+ hücre fraksiyonu olarak etiketleyin; Buna naif monosit fraksiyonu da denir.
    18. 1 × 106 hücre / mL'ye ulaşmak için toplanan CD14 + monositlere tam kültür ortamı ekleyin.
      NOT: İstenilen hücre sayısına ulaşmak için gereken tam kültür ortamının hacmini tahmin etmek için elütlü CD14+ hücre fraksiyonundaki canlı hücreleri sayın.
    19. Steril bir 24 delikli plaka alın ve her bir kuyucuğa 1 mL hücre süspansiyonu (1 × 106 hücre / mL) ekleyin.
  3. CD14+ naif monositlerin %3 w/v sitokin kokteyli (GM-CSF + IL-4) ilavesi ile naif MoDC'lere farklılaştırılması ve toplam 5 günlük inkübasyon
    1. CD14+ monosit içeren her bir kuyucuğu, kit içinde verilen 40 μL (%3 w/v) sitokin kokteyli ile takviye edin.
    2. Plakayı% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde ve 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    3. 2. günde, pipet kullanarak her bir kuyucuğun içeriğinin yarısını (500 μL) ayrı ayrı 1,5 mL tüplere aktarın ve 7 dakika boyunca 4 ° C'de 500 × g'da santrifüj yapın.
    4. Süpernatanı atın ve peleti 500 μL taze tam kültür ortamında yeniden askıya alın.
    5. Bu hücre süspansiyonunun 500 μL'sini adım 1.3.4'ten belirlenen her bir kuyucuğa geri aktarın, böylece son hacim 1 mL olur.
    6. Her bir kuyucuğu 20 μL sitokin kokteyli ile zenginleştirin.
    7. Kültürü% 5 CO2 ile ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 72 saat boyunca inkübe edin.
    8. 5. günde inkübasyondan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın.
      NOT: Her kuyucuk, naif MoDC'lerin hücre süspansiyonunun 1 mL'sini içerecektir. MoDC'lerin sayısı, kaplanan orijinal monositlerin bir yüzdesi (~% 20) olacaktır (1 × 106 / mL).

2. MoDC endositik aktivite testi

NOT: Antijen alım testi veya endositik aktivite testi, naif MoDC'lerin yabancı maddeleri içselleştirme yeteneğini ölçer. Tahlil, daha önce tarif edildiği gibi,% 3 w / v sitokin kokteyli ve 5 günlük inkübasyon ile kültürlenmiş naif MoDC'leri kullanarak test yapın34.

  1. Naif MoDC hücre süspansiyonunu 24 delikli plakadan toplayın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın; ayrıca kuyucukları PBS ile durulayarak artık hücreleri de toplayın.
  2. 7 dakika boyunca 500 × g santrifüj. Süpernatanı atın ve peleti% 1 FBS ile desteklenmiş 1 mL kültür ortamında yeniden askıya alın.
  3. İstenilen hücre sayısına ulaşmak için gereken ortamın hacmini tahmin etmek için canlı MoDC hücrelerini sayın (2 × 105 hücre / mL).
  4. Kültür, 2 × 105 hücre/mL nihai hücre konsantrasyonuna sahip 24 delikli bir plakada 100 μL tam kültür ortamındaki naif MoDC'ler.
  5. Her bir kuyucuğu 1 mg / mL FITC-konjuge dekstran (endositoz izleyici olarak kullanılan floresan prob) ile destekleyin.
    NOT: FITC-dekstran bir floresan probu gibi davranır ve endositoz izleyici olarak kullanılır.
  6. Plakayı örtün ve karanlıkta 60 dakika boyunca% 5 CO2 ve 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Arka plan kontrolü için, ilave MoDC hücrelerini (2 × 105 hücre / mL) buz üzerinde 1 mg / mL FITC-dekstran ile inkübe edin, çünkü bu tür bir inkübasyon, izleyici molekülün (FITC-dekstran) hücrelere girmesini önler.
  7. Kuluçkadan sonra, FITC-dekstranın endositozunu durdurmak için 24 kuyucuklu plakayı hemen buz üzerine aktarın.
  8. Hücreleri buz gibi soğuk FACS tamponu ile yıkayın.
  9. Peletleri toplayın, santrifüj edin ve 500 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
  10. Akış sitometrisini kullanarak hücreler içindeki FITC-dekstranın floresan yoğunluğunu analiz edin. Ayrıntılar için adım 5.2'deki akış sitometrisi analizine bakın.

3. Antijen darbeli MoDC'lerin üretimi

NOT: Kuduz virüsüne (RV) karşı ticari olarak temin edilebilen ve klinik olarak onaylanmış bir aşı, naif MoDC'lerin olgun antijen sunan MoDC'lere farklılaşmasını indükleyebilir. Antijen darbeli MoDC'ler üretmek için tek bir RV aşılama dozunun% 0.1'ini (~ 1 μL) kullanın. Ayrıca, naif MoDC'ler üretmek için kullanılan aynı kültür plakasında (adım 1.3.8'de) RV darbeli MoDC'lerin üretilmesi tercih edilir, çünkü naif MoDC'lerin yeni bir 24 delikli plakaya aktarılması onları olumsuz yönde etkileyecektir.

  1. Adım 1.3.8'den itibaren) 24 delikli plakada 1 mL naif MoDC kültürüne 1 μL/mL RV süspansiyonu ekleyin ve %5 CO2 ve 37 °C'de 48 saat inkübe edin.
    NOT: RV stimülasyonu olmadan kültürlenen Naif MoDC'ler arka plan kontrolü olarak kullanılır (ve sonraki adımlarda lenfositlerle ko-kültür için spesifik olmayan stimülasyon olarak).
  2. İnkübasyondan sonra, 7. günde, antijen darbeli MoDC'leri içeren 24 delikli plakayı 10 dakika boyunca buz üzerinde tutun.
  3. Kuyu başına 1 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin. Pipetleme ile her bir kuyucuğu iyice karıştırın ve süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  4. Her bir kuyucukta kalan artık hücreleri toplamak için kuyucukları 2 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
  5. İçeriği ilgili tüplerine aktarın ve hücre süspansiyonunu 7 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj edin.
  6. Süpernatanı atın, hücre peletini (antijen darbeli MoDC'ler) tam kültür ortamında yeniden askıya alın ve hacmi 1 × 105 hücre / mL'lik bir nihai hücre konsantrasyonuna ayarlayın.
    NOT: İstenen hücre sayısına ulaşmak için gereken ortam hacmini tahmin etmek için canlı hücreleri sayın. MoDC-lenfosit ko-kültür sistemi için 7. günden itibaren RV darbeli MoDC'leri kullanın.

4. MoDC-lenfosit ko-kültürü

NOT: İn vitro MoDC-lenfosit ko-kültür sistemi, MoDC'lerin asal antijene özgü lenfositlere yeteneğini belirler. 16 günlük ko-kültürden sonra hücrelerin farklı tedavi grupları spesifik, spesifik olmayan ve kontrolü içerir. Spesifik grup, RV darbeli MoDC'lerle birlikte kültürlenmiş lenfositler olarak tanımlanır; spesifik olmayan grup, antijen darbeli olmayan MoDC'lerle birlikte kültürlenmiş lenfositler olarak tanımlanır; kontrol grubu ise MoDC'ler olmadan kültüre alınan lenfositler olarak tanımlanmaktadır.

  1. 2 × 106 hücre / mL'lik bir hücre konsantrasyonuna ulaşmak için salınımlı naif lenfosit fraksiyonuna (CD14-hücreler) tam kültür ortamı ekleyin.
    NOT: İstenilen hücre sayısına ulaşmak için gereken ortamın hacmini tahmin etmek için toplandıklarından beri 24 delikli bir plakada tam kültür ortamında tutulan CD14 hücre kültüründeki canlı hücreleri sayın.
  2. 7. günde, steril bir 24 delikli plaka alın ve kuyucukları 1 mL naif lenfosit hücre süspansiyonu (2 × 106 hücre / mL) artı 1 mL antijen darbeli veya antijen darbeli olmayan MoDC süspansiyonu (1 × 105 hücre / mL) ile tohumlayın.
    NOT: Her kuyucuktaki toplam hacim, kuyu başına lenfositlere 1:20 MoDC oranı ile 2 mL olacaktır.
  3. Plakayı 37 ° C'de 48 saat ve% 5 CO2'de inkübe edin.
  4. Antijen darbeli MoDC'lerle kültür zenginleştirme ve yeniden uyarılma
    1. Antijen darbeli MoDC-lenfosit ko-kültürünün inkübasyonundan sonra, 9. günde, her bir kuyucuğu 20 ng / mL rekombinant IL-2 ile destekleyin ve 120 saat daha (5 günlük inkübasyon) inkübe etmeye devam edin.
    2. 14. günde, 1 mL ko-kültürü steril bir 1.5 mL tüpe aktarın ve 7 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj.
    3. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL antijen darbeli veya darbesiz MoDC'lerle (1 × 105 hücre / mL) yeniden askıya alın. Pipetleme ile nazikçe karıştırın ve hücre süspansiyonlarını belirlenen kuyucuklarına geri aktarın.
      NOT: Bu adımda, her bir kuyucuktaki toplam hacim 2 mL'dir.
    4. 48 saat boyunca% 5 CO2 ve 37 ° C'de inkübasyona devam edin. 16. günde inkübasyondan sonra, ko-kültür akış sitometrisi, qPCR ve ELISA kullanılarak analiz için hazırdır.
      NOT: MoDC-lenfosit ko-kültürünün her bir kuyucuğundaki her 2 mL için, akış sitometrisi için 1 mL yeniden askıya alınmış hücre, RNA ekstraksiyonu için 1 mL kullanılır ve her ikisinden de süpernatantlar ELISA için kullanılır.

5. Akış sitometrik analizi

NOT: Numuneleri bir akış sitometresinde çalıştırmadan önce hücreleri uygun belirteçler/mAb ile lekeleyin. Akış sitometrisi analizi için kullanılan reaktifler (boyama mAb ve izotip kontrolleri), kit, cihaz ve yazılım hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

  1. Akış sitometresi boyama protokolü
    NOT: Anti-CD14 mAb kullanarak PBMC'ler ve naif lenfositler ve monositler için hücre yüzeyi boyama işlemi gerçekleştirin (adım 1.2.6). Naif MoDC'lerin hücre yüzeyi boyaması için, anti-CD86'ya özgü, anti-CD40'a özgü ve anti-MHC II'ye özgü mAb kullanın. 16. gün ko-kültürlerinden hücrelerin hücre yüzeyi boyaması için, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 mAbs kullanın; hücre içi boyama için anti-Ki-67 mAb kullanın. Ayrıca, hücreleri negatif izotip kontrolü mAb ile veya mAb olmadan (FMO: floresan eksi bir) boyayın. Yüzey ve hücre içi belirteçler için boyama yaparken temel fark, hücre yüzey belirteçleri için, hücrelerin canlı / ölü (L / D) boyama veya diğer işlemlerden önce spesifik yüzey mAb ile boyanması gerektiğidir. Bununla birlikte, hücre içi boyama, L / D boyamadan sonra gerçekleştirilir ve hücre içi penetrasyona izin vermek için bir fiksasyon artı geçirgenlik adımı gerektirir.
    1. Bir pipet kullanarak 1 mL hücre süspansiyonunu steril 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın ve 500 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
      NOT: Santrifüjlemeden sonra, MoDC-lenfosit ko-kültüründen hücreleri işlerken, süpernatantı ELISA analizi için saklayın.
    2. Peletleri 1 mL PBS'de tekrar askıya alın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Artık hücreleri 1 mL PBS kullanarak toplayın ve bunu yeniden askıya alınmış pelet ile birleştirin.
    3. Hücreleri içeren 15 mL'lik tüpe 10 mL PBS ekleyin, pipetleme ile karıştırın ve 850 x g'de 7 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Supernatan'ı atın ve adım 5.1.3'ü tekrarlayın.
    5. Süpernatanı atın ve hücre peletini, süpernatanı boşalttıktan sonra kalan artık süspansiyonla (yaklaşık 180 μL) dikkatlice askıya alın.
    6. Hücre süspansiyonunu v tabanlı 96 delikli bir plakaya aktarın ve dökülmeyi önlemek için kuyucukları kapatın.
    7. Plakayı 5 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, sıvı kuyularını boşaltmak için plakayı bir atık kabının üzerine kaydırın ve fazla sıvının uzaklaştırılmasını sağlamak için plakayı emici kağıda dokunun.
    8. Kuyucuk başına 25 μL yüzey boyama ana karışımı ekleyin ve bir pipet kullanarak yavaşça karıştırın, ardından 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübasyona tabi tutun.
      NOT: Tek bir kuyucuk için yüzey boyama ana karışımını hazırlamak için, 20 μL FACS tamponuna 2,5 μL yüzey mAb ekleyin.
    9. Kuyucuk başına 200 μL FACS tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, sıvı kuyucuklarını boşaltarak boşaltın ve fazla sıvıyı çıkarmak için plakayı emici kağıda dokunun.
    10. Kuyucuk başına 100 μL L/D boyama çözeltisi ekleyin. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın, ardından karanlıkta 15 dakika boyunca 4 ° C'de inkübasyona tabi tutun.
      NOT: Tek bir kuyucuk için, 0,25 μL L/D boyayı 100 μL FACS tamponunda çözün. L / D boyası, canlı ve ölü hücreler arasında ayrım yapmaya yardımcı olur.
    11. 100 μL FACS tamponu ekleyin. Kuyucukları kapakla örtün ve plakayı 5 dakika boyunca 1.400 × g santrifüj edin. Süpernatantı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda dokunun.
    12. 5.1.11 adımını yineleyin.
    13. Kuyucuk başına 50 μL sabitleme çözeltisi ekleyin (kit ile birlikte verilir) ve plakayı karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe etmeden önce bir pipetle karıştırın.
    14. Kitle birlikte verilen 1x geçirgenleştirme-yıkama tamponundan (PW) 150 μL ekleyin ve kuyucukları kapakla örtün.
      NOT: 10 mL 1x PW tamponu hazırlamak için, 1 mL 10x perm tamponunu 10 mLdH2O içinde seyreltin.
    15. Plakayı 1.400 × g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda dokunun.
    16. 200 μL 1x PW ekleyin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüjleme yapın. Süpernatantı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda dokunun.
    17. Hücre içi boyama için, kuyucuk başına 25 μL hücre içi boyama ana karışımı (anti-insan Ki-67 mAb) ekleyin. İyice karıştırın ve plakayı 4 ° C'de 30 dakika boyunca veya karanlıkta buz üzerinde inkübe edin.
      NOT: Tek bir kuyucuk için hücre içi boyama ana karışımını hazırlamak için, 24 μL 1x PW'ye 1 μL Ki-67 mAb ekleyin. Hücre içi boyama belirteci sadece 16. gün ko-kültürden hücreleri işlerken kullanılır. PBMC'ler, naif lenfositler, monositler ve naif MoDC'ler işlenirken hücre içi boyama yapılmaz.
    18. Kuluçkadan sonra, her bir kuyucuğa 200 μL 1x PW ekleyin. Bir pipetle karıştırın ve 5 dakika boyunca 1.400 × g santrifüj yapın. Süpernatantı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda dokunun.
    19. 200 μL FACS tamponu ekleyin, ardından 5 dakika boyunca 1.400 × g'da santrifüjleme yapın. Süpernatantı boşaltarak atın ve plakayı emici kağıda dokunun.
    20. Hücre peletini 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve her bir kuyucuğun içeriğini steril akış sitometre tüplerini ayırmak için aktarın. Artık hücreleri toplamak için kuyucuk başına 300 μL FACS tamponu kullanın. Hücreler artık akış sitometrisi analizi için hazırdır.
  2. Numuneyi bir akış sitometresinde çalıştırma
    NOT: Numuneler, üreticinin el kitabına göre bir akış sitometresinde (488 nm, 638 nm ve 405 nm lazerler kullanılarak) çalıştırılmıştır35. Protokolün ayrıntıları, sorun giderme ve özelleştirme için kılavuza bakın.
    1. Numuneleri okumadan önce ve okuduktan sonra rutin temizleme prosedürlerini uygulayın.
      NOT: Tüpleri cihaza yüklerken hiçbir pozisyonu atlamayın.
      1. Temizleme döngüsü için, akış temizleme reaktifi içeren ilk tüp ve dH2O içeren kalan üç tüp ile toplam dört tüp kullanın; her tüp 3 mL'ye sahip olacaktır. Temizleme çalışması sırasında, ileri saçılma (FSC) için 330 V'un altında tüp başına 100.000 olayı, yan saçılma (SSC) için 265 V'un altında yakalayarak yaklaşık 1 dakika boyunca orta akış hızına sahip veriler elde edin.
        NOT: Temizlik sırasında hiçbir döküntü veya hücresel olay bildirilmemelidir; Bu durumda, temizleme adımını yeniden gerçekleştirin. Numuneleri çalıştırmak için, verileri almadan önce tüm numunelerin homojen bir süspansiyonda olduğundan emin olun, çünkü bu doğru bir okuma sağlar.
    2. Sitometreyi bağlamak ve açmak için, başlık çubuğunun sol köşesinde bulunan Uygulama Düğmesine tıklayın. Uygulama açılır menüsünden, Sitometri seçeneğini seçin ve Aç seçeneğine tıklayın.
      NOT: Uygulama açılır menüsünden, Aç seçeneği kullanıcıların önceden programlanmış tahlillere göz atmasına izin verirken, Yeni Protokol seçeneği kullanıcıların yeni protokoller oluşturmasına izin verir.
    3. Başlangıçta negatif kontrol numunesini çok borulu tutucuya yükleyin. Yeni Protokol'ü seçin ve çalışma alanının/ekranın sol tarafındaki iş listesine bakın.
    4. İş listesinde, numunenin çok tüplü tutucudaki konumunu tanımlayın ve tanımlama için numuneye ve protokole bir ad verin.
    5. Çalışma alanının sol tarafında bulunan Donanım Panelinden dedektörler (FSC, SSC ve 10 floresan aralığı), fotoçarpanların voltajları (V) ve kazançları ve sinyalin alan-yükseklik-genişliği (AHW) gibi birden çok parametreyi ayarlayın ve seçin.
      NOT: Dedektörler için aşağıdaki ayarlar deney ve kullanılan cihaza göre seçilmiştir: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dekstran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Flor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
    6. Başlık çubuğunun altında bulunan Enstrüman Edinme Kontrol Panelinden algılanmak istenen akış hızı (orta), Zaman (5 dakika) ve Olaylar (bkz. adım 5.2.8) seçeneklerini ayarlayın. Cihazın numuneyi çizmesine/çalıştırmasına izin vermek ve algılanan olayların gerçek zamanlı önizlemesini göstermek için Tekli Al seçeneğine tıklayın.
    7. Gerçek zamanlı önizlemeden, floresan eşiğini (voltaj ve kazanç) ve hücre boyutunu ayarlayarak sonunda herhangi bir hücresel enkazı hariç tutarken istenen hücre popülasyonunun etrafına kapılar çizin.
      NOT: FSC, hücreleri boyut bazında ayırt etmeye yardımcı olur, böylece kullanıcıların monositler ve lenfositler gibi bağışıklık sisteminin hücreleri arasında ayrım yapmalarını sağlar; monositler daha büyüktür ve lenfositlere kıyasla daha yüksek FSC yoğunluğu gösterir.
    8. Yaklaşık toplam 5.000 canlı MoDC, 50.000 canlı lenfosit ve 50.000 canlı monosit etkinliği elde edin.
    9. Tüm parametreler negatif kontrol örneğine göre ayarlandıktan sonra, Durdur'a tıklayın ve protokolü kaydedin.
    10. Şimdi tüm numuneleri çok borulu yükleyiciye yükleyin. İş listesindeki her bir örneği tanımlayın ve negatif kontrole göre ayarlanan parametreleri deneydeki tüm örneklere uygulayın. Denemedeki tüm örneklerin art arda çalıştırılmasına izin vermek için Al seçeneğine tıklayın.
    11. Tüm örneklerden elde edilen veriler alındıktan sonra, sıralı bi-parametrik ve mono-parametrik histogramların oluşturulmasına izin veren uygun bir veri analiz yazılımı kullanarak kaydedin ve okunabilir verilere dönüştürün.

6. Mesajcı RNA (mRNA) ekspresyon analizi

  1. RNA ekstraksiyonu
    NOT: Toplam RNA'yı antijen darbeli MoDC-lenfosit ko-kültüründen (spesifik), antijen darbeli olmayan MoDC-lenfosit ko-kültüründen (spesifik olmayan), MoDC'siz lenfosit kültüründen (kontrol) ve naif lenfositlerden (CD14-birlikte kültürlemeden önce izole edilen hücreler) ekstrakte edin. RNA ekstraksiyonu için, RNaz içermeyen su kullanarak etanol hazırlayın. Ekstraksiyon kiti ve reaktifleri hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
    1. MoDC-lenfosit ko-kültür plakasından (~1 × 106 hücre/mL) 1 mL hücre süspansiyonunu pipet kullanarak steril 1,5 mL steril bir tüpe aktarın ve 500 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    2. Süpernatantı ELISA için saklayın. Hücre peletini 1 mL PBS'de yeniden askıya alın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 1 mL PBS kullanarak kalan hücreleri toplayın.
    3. 500 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj.
      NOT: Tüm numuneler, kit içinde sağlanan lizis tamponu kullanılarak hücre lizisi yapılana kadar canlı hücreler olarak hassas bir şekilde ele alınmalıdır. Hücre ölümü, aşağı akış ölçümü için gerekli RNA şablonlarını hızlı bir şekilde hidrolize eden RNazları serbest bırakır. RLT tamponu, RNazları inhibe eden bir çözelti içindeki hücreleri lize eder.
    4. Her boş kuyucuğa 350 μL lizis tamponu ekleyin ve önceki adımlarda hasat edilmeyen yapışkan hücreleri lize etmek için 2-3 dakika inkübe edin.
    5. Adım 6.1.3'teki santrifüjleme tamamlandıktan sonra, süpernatanı atın ve hücre peletini adım 6.1.4'te eklenen 350 μL lizis tamponu ile birleştirin.
      NOT: Bu noktada, tüpleri -80 ° C'de saklamak veya RNA ekstraksiyonuna devam etmek mümkündür (aşağıdaki adımlar).
    6. Adım 6.1.5'te lizata 350 μL% 70 etanol pipet. Numune başına son hacim 700 μL'dir.
    7. Ekstraksiyon sütununu 2 mL'lik bir toplama tüpüne yerleştirin (kit ile birlikte verilir).
    8. Ekstraksiyon kolonu başına 700 μL numuneyi aktarın ve 15 s boyunca 10.000 × g'da santrifüj. Akış akışını toplama tüpüne atın ve tekrar döndürme sütununa yerleştirin.
    9. Ekstraksiyon sütununa 350 μL sıkı yıkama tamponu (kit içinde verilir) ekleyin ve 15 s boyunca 10.000 × g'dan fazla santrifüj yapın. Akışı atın.
    10. Ekstraksiyon kolonunun membranına numune başına 80 μL DNaz I inkübasyon karışımı ekleyin ve 20-30 ° C'de 15 dakika bekletin.
      NOT: Numune başına DNaz I inkübasyon karışımı hazırlamak için, 80 μL'lik son hacim için 70 μL DNaz tamponuna 10 μL DNaz I stok çözeltisi ekleyin. tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın, ardından santrifüjde kısa bir dönüş yapın.
    11. Ekstraksiyon kolonunu 350 μL sıkı yıkama tamponu ile yıkayın, ardından 15 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüjleme yapın. Santrifüjlemeden sonra toplama borusundaki akışı atın.
    12. Ekstraksiyon kolonunu her seferinde 500 μL hafif yıkama tamponu ile 2 kez ve santrifüjleme ile 10.000 × g'da 15 s ve ikinci kez 2 dakika boyunca yıkayın. Her santrifüjlemeden sonra akışı atın.
    13. Membranı kurutmak için kolonu 1 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj edin ve toplama tüpünü atın.
    14. Ekstraksiyon sütununu yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne yerleştirin.
    15. 50 μL RNaz içermeyen suyu kolon zarına pipet edin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika inkübe edin.
      NOT: 100 ng'nin altındaki RNA konsantrasyonları için, elüsyon hacmini 30 μL'ye düşürün ve nihai ürünü konsantre etmek için ürünü ilk elüsyondan itibaren kullanarak ekstraksiyon kolonu membranını yeniden boşaltın.
    16. RNA'yı açığa çıkarmak için 1 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüj.
    17. 0.5-2 μL numune kullanarak 260 nm'de absorbansı tespit ederek RNA konsantrasyonunu ölçün. RNaz içermeyen su kullanarak nihai RNA konsantrasyonunu 0.1-1 μg / μL'ye ayarlayın.
    18. RNA alikotlarını daha sonra kullanmak üzere -80 ° C'de saklayın.
  2. Tamamlayıcı DNA sentezi
    1. Ekstrakte edilen şablon RNA'dan tamamlayıcı DNA'yı (cDNA), üreticinin kit ile birlikte verilen protokolüne göre sentezleyin (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Reaktiflerin ve kullanılan hacimlerin bir özeti Tablo 1 ve Tablo 2'de gösterilmiştir. Tam bir protokol Ek Dosya 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
  3. Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu
    1. qPCR için, cDNA örneklerini üçlü olarak çalıştırın. Ki-67 ve IFN-γ için sığır mRNA transkript seviyelerini, Tablo 3'te gösterildiği gibi, GAPDH genine referans olarak spesifik primer setleri kullanarak sayısallaştırın.
      NOT: Tam bir protokol Ek Dosya 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

7. Enzime bağlı immünosorbent testi

  1. IFN-γ'nin ELISA aracılığıyla nicelleştirilmesi için salgı proteinleri bakımından zengin toplanan kültür süpernatantlarını işleyin.
    NOT: Kit kullanımıyla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Tam bir protokol Ek Dosya 1'de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

8. İstatistiksel analiz

  1. Verileri analiz edin ve ticari yazılım kullanarak deneysel tasarımın grafiksel illüstrasyonlarını yapın. Karşılaştırmalı analiz için eşlenmemiş parametrik olmayan bir test kullanın. 0,05 < P değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı olduğunu düşünün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu metodoloji, in vivo çalışmalar yapılmadan önce aday aşı antijenlerinin değerlendirilmesi için sığır MoDC'lerinin in vitro jenerasyonunu açıklamaktadır. Şekil 1, sığır MoDC üretiminin deneysel şemasını ve MoDC'lerin in vitro tahlil için uygulanmasını göstermektedir. Manyetik bazlı hücre sıralama tekniğini kullanarak, daha önce 50 mL sığır kanından izole edilen hasat edilen PBMC'lerden yaklaşık 26 milyon CD14 + miyosit toplamak mümkündü. CD14+ monosit i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, sığır MoDC'lerinin üretilmesi ve fenotiplenmesi için standartlaştırılmış bir in vitro yöntemi ve bunların ticari bir aşının (örneğin, RV) aşı immünojenitesini ölçmede daha sonraki kullanımlarını göstermektedir. Sığır MoDC'leri, sığır hastalıklarına karşı potansiyel aşı antijenlerini taramak ve in vivo hayvan deneylerine geçmeden önce bağışıklık tepkilerine dayanarak potansiyel klinik etkilerini tahmin etmek için bir araç olarak kullanılabilir. Üretilen MoDC'ler morfolojik, fenotipik ve fonks...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanların sağlık durumlarını belirleme ve BTV'yi sağlama konusundaki destekleri için Dr. Eveline Wodak ve Dr. Angelika Loistch (AGES), sığır kanı sağladığı için Dr. Bernhard Reinelt'e ve IAEA'dan Dr. Bharani Settypalli ve Dr. William Dundon'a gerçek zamanlı PCR deneyleri ve dil düzenleme konusunda yararlı tavsiyeler için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ACK Lysing TamponuGibco, Thermo FisherA1049201Hasat edilmiş PBMC Fraksiyonunda kalıntı RBC'lerin parçalanması için Amonyum-Klorür-Potasyum tamponu
BD Vacutainer Heparin TüpleriBecton, Dickinson (BD) ve Şirket36648010 mL, katkı maddesi sodyum heparin 158 USP birimleri, cam tüp, 16 x 100 mm boyutunda
Sığır Dendritik Hücre Büyüme KitiBio-Rad, İngilterePBP015KZZRekombinant sığır IL-4 ve GM-CSF
Sığır IFN-&gama'dan oluşan sitokin kokteyli; ELISA KitiBio-RadMCA5638KZZKiti IFN-&gama ölçümü için kullanın; kültür süpernatant
CD14 AntikoruBio-RadMCA2678FFare anti-sığır CD14 monoklonal antikor, klon CC-G33, izotip IgG1
CD25 AntikoruBio-RadMCA2430PEFare anti sığır CD25 monoklonal antikor, klon IL-A11, izotip IgG1
CD4 AntikoruBio-RadMCA1653A647Fare anti sığır CD4 monoklonal antikoru, klon CC8, izotip IgG2a
CD40 AntikoruBio-RadMCA2431FFare anti-sığır CD40 monoklonal antikoru, klon IL-A156, izotip IgG1
CD8 AntikoruBio-RadMCA837FFare anti sığır CD8 monoklonal antikor, klon CC63, izotip IgG2a
CD86 AntikoruBio-RadMCA2437PEFare anti-sığır CD86 monoklonal antikoru, klon IL-A190, izotip IgG1
CFX96 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit SistemiBio-Rad-Termaldöngüleyici PCR makinesi
Corning Santrifüj TüpüFalcon Corning 352096 & 35207015 mL ve 50 mL, yüksek berraklıkta poypropilen konik tabanlı, dereceli, steril, contalı vidalı kapak, şahin tüpü
Cytofix/Cytoperm PlusBD Bio Sciences555028BD golgiPlug ile fiksasyon/geçirgenlik kiti, akış sitometresi hücre boyama için kullanın
EtanolSigma Aldrich1009832500Analiz için mutlak EMSURE  ACS, ISO, Reag. Ph Eur
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco, Thermo Fisher10500064Nitelikli, ısıyla inaktive edilmiş
Ficoll Plak PLUSGE Health care Yaşam Bilimleri, ABD341691Lenfosit izolasyon ortamı
FlowClean Temizlik MaddesiBeckman Coulter, Yaşam BilimleriA64669500 mL
FlowJoFlowJo, Becton, Dickinson (BD) ve Company, LLC, ABD-Akış sitometresi Histogram yazılımı
FlowTubes/ FACS  (Floresanla aktive edilen tek hücreli sıralama) TüpŞahin Corning 3522355 mL, steril, hücre süzgeci geçmeli kapaklı yuvarlak tabanlı polistiren test tüpü, akış sitometrisi analizinde kullanım
Floreseinizotiosinat-DekstranSigma Aldrich, Almanya60842-46-8FITC-dextran MW
Gallios Akış SitometresiBeckman Coulter-Flowsitometre makinesi
Sert Kabuklu 96 Kuyulu PCR PlakalarıBio-RadHSP960196 kuyulu, düşük profilli, ince duvarlı, etekli, beyaz/berrak
İnsan CD14 MicroBeadsMiltenyi Bioteck, Almanya130-050-201PBMC'lerden sığır monositlerinin seçimi için kullanılan monoklonal anti-insan CD14 antikor izotipi IgG2a'ya konjuge 2 mL mikroboncuklar
KaluzaBeckman Coulter,Almanya-Flowsitometre çok renkli veri analiz yazılımı
MACS SütunuMiltenyi Bioteck, Almanya130-042-401Hücre yüzeyi antijenlerine dayalı olarak çeşitli CD14 hücre popülasyonunun ayrılması için manyetik aktive hücre sınıflandırması veya immün macentik hücre ayırma sütunu
MHC Sınıf II DQ DR Polimorfik AntikorBio-RadMCA2228FFare anti-koyun MHC Sınıf II DQ DR Polimorfik: FITC, klon 49.1, izotip IgG2a, sığır ile çapraz reaktif
Mikrosantrifüj TüpüSigma AldrichHS43251.5 mL, konik tabanlı, dereceli, steril tüp
Microsoft Power PointMicrosoft-Deneyseltasarımın grafiksel çizimleri
Fare IgG1 Negatif Kontrol: CD14, CD40 Antikoru için FITCBio-RadMCA928Fİzotip kontrolü CD14 ve CD40 monoklonal antikor 
Fare IgG1 Negatif Kontrol: CD86 AntikoruBio-RadMCA928PEİzotip kontrolü CD86 monoklonal antikoru için PE 
Fare IgG1 Negatif Kontrolü: CD25 AntikoruBio-RadMCA928PEİzotip kontrolü CD25 monoklonal antikoru için RPE 
Fare IgG2a Negatif Kontrolü: MHC Sınıf II AntikorBio-Rad içinMCA929FMHC sınıf II monoklonal antikor için izotip kontrolü 
Nobivac KuduzMSD Hayvan Sağlığı, UK-1& > 2 IU/mL Kuduz virüsü suşu içeren L / mL hücre kültürü inaktive aşı
Optik contalarBi0-RadTCS08030.2 mL düz PCR tüpü 8 kapaklı şeritler, optik, ultra şeffaf, qPCR makinesi için uyumlu
Penisilin-StreptomisinGibco, Thermo Fisher15140122100 mL
Fosfat Tampon Salin (PBS)Gibco, Thermo Fisher10010023pH 7.4, 1x konsantrasyon
Prizma - GraphPad 5 Yazılımı Dotmatics-İstatistikselyazılım
Saflaştırılmış Anti-insan Ki-67 antikoruBiolegend, ABD350501Monoklonal antikor, inekle çapraz reaktif, klon ki-67
Saflaştırılmış Fare IgG1 k İzotip Ctrl AntikorBiolegend400101Ki-67 monoklonal antikor için izotip kontrolü
READIDROP Probidium İyodürBD Bio Sciences1351101Akış sitometrisi, amin reaktif boya
Rekombinant İnsan IL-2 Protein R& için kullanılan canlı / ölü hücre belirteci D Sistemi, ABD202-IL-010 / CFİnterlökin-2, 20 ng / ml
RNeasy Mini KitQiagen74106Toplam RNA'nın ekstraksiyonu için kit kullanımı; RLT tamponu = lizis tamponu; RW1 tamponu = sıkı guanidin içeren yıkama tamponu; RDD tamponu = DNaz tamponu; RPE tamponu = hafif yıkama tamponu; RNaseOUT = RNase inhibitörü.
RPMI 1640 OrtaSigma AldrichR8758L-glutamin ve sodyum bikarbonat içeren hücre kültürü ortamı
SMART-servier medical art Commons Attribution 3.0 unported lisansı altındaLes Laboratories Servier-Lisanslı
SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-52702x qPCR karışım conatins dNTP'ler, Ss07d füzyon polimeraz, MgCl2, SYBR Green I supermix = süpermiks, ROX normalizasyon boyaları.
SuperScript III Birinci İplikli Sentez SistemiInvitrogen,cDNA sentezi için18080051
Doku Kültürü Test plakası 24TPP, İsviçre9202424 oyuklu plaka, radyasyonla sterilize edilmiş, büyümesi arttırılmış, hacim 3.18 mL
Tripan Mavisi ÇözeltisiGibco, Thermo Fisher15250061%0.4, 100 mL, hücre canlılığını
değerlendirmek için boyaUltraPure DNase / RNase İçermeyen Damıtılmış Suİnvitrojeni, Thermo Fisher109770230.1 & m membran filtrelenmiş damıtılmış su
VACUETTE Heparin Kan Alma TüpleriThermo Fisher Scientific15206067VACUETTE Heparin Kan Alma Tüpleri yeşil bir üst kısma sahiptir ve iç duvarlarında püskürtülerek kurutulmuş lityum, sodyum veya amonyum heparin içerir ve klinik kimya, immünoloji ve serolojide kullanılır. Antikoagülan heparin, pıhtılaşma kaskadını bloke eden ve böylece bir tam kan/plazma örneği üreten antitrombini aktive eder.
WaterSigma AldrichW3500-1LSteril filtreli, hücre kültürüne uygun bioReagent
FITC Creative Thermo Fisher Kiti

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roth, J. A., Sandbulte, M. R. The role of veterinary vaccines in livestock production, animal health, and public health. In Veterinary Vaccines: Principles and Applications. Metwally, S., El Idrissi, A., Viljoen, G. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1-10 (2021).
  2. Roberts, N. J., Douglas, R. G., Simons, R. M., Diamond, M. E. Virus-induced interferon production by human macrophages. The Journal of Immunology. 123 (1), 365-369 (1979).
  3. Kleiveland, C. R. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health: In Vitro and Ex Vivo Models. Verhoeckx, K., Cotter, P., López-Expósito, I., Kleiveland, C., Lea, T., Mackie, A., Requena, T., Swiatecka, D., Wichers, H. , Springer. Cham, Switzerland. 161-167 (2015).
  4. Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 762-774 (2011).
  5. Domínguez, P. M., Ardavín, C. Differentiation and function of mouse monocyte-derived dendritic cells in steady state and inflammation. Immunological Reviews. 234 (1), 90-104 (2010).
  6. Steinman, R. M. Linking innate to adaptive immunity through dendritic cells. Novartis Foundation Symposium. 279, 101-109 (2006).
  7. Vandebriel, R. J., Hoefnagel, M. H. N. Dendritic cell-based in vitro assays for vaccine immunogenicity. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 8 (9), 1323-1325 (2012).
  8. Hopewell, E. L., Cox, C. Manufacturing dendritic cells for immunotherapy: Monocyte enrichment. Molecular Therapy. Methods and Clinical Development. 16, 155-160 (2020).
  9. Morse, M. A., Zhou, L. -J., Tedder, T. F., Lyerly, H. K., Smith, C. Generation of dendritic cells in vitro from peripheral blood mononuclear cells with granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor, interleukin-4, and tumor necrosis factor-alpha for use in cancer immunotherapy. Annals of Surgery. 226 (1), 6-16 (1997).
  10. Robinson, L., et al. Foot-and-mouth disease virus exhibits an altered tropism in the presence of specific immunoglobulins, enabling productive infection and killing of dendritic cells. Journal of Virology. 85 (5), 2212-2223 (2011).
  11. Kangethe, R. T., Pichler, R., Chuma, F. N. J., Cattoli, G., Wijewardana, V. Bovine monocyte derived dendritic cell based assay for measuring vaccine immunogenicity in vitro. Veterinary Immunology and Immunopathology. 197, 39-48 (2018).
  12. Harwood, L. J., Gerber, H., Sobrino, F., Summerfield, A., McCullough, K. C. Dendritic cell internalization of foot-and-mouth disease virus: Influence of heparan sulfate binding on virus uptake and induction of the immune response. Journal of Virology. 82 (13), 6379-6394 (2008).
  13. Hussen, J., et al. Phenotypic and functional heterogeneity of bovine blood monocytes. PLoS One. 8 (8), 71502(2013).
  14. Shi, Y., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and don't know. Cell Research. 16 (2), 126-133 (2006).
  15. Zhou, L. -J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (6), 2588-2592 (1996).
  16. Bautista, E. M., Nfon, C., Ferman, G. S., Golde, W. T. IL-13 replaces IL-4 in development of monocyte derived dendritic cells (MoDC) of swine. Veterinary Immunology and Immunopathology. 115 (1-2), 56-67 (2007).
  17. León, B., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells in innate and adaptive immunity. Immunology and Cell Biology. 86 (4), 320-324 (2008).
  18. Berger, A. Th1 and Th2 responses: What are they. British Medical Journal. 321 (7258), 424(2000).
  19. Romagnani, S. Th1/th2 cells. Inflammatory Bowel Diseases. 5 (4), 285-294 (1999).
  20. Kaiko, G. E., Horvat, J. C., Beagley, K. W., Hansbro, P. M. Immunological decision-making: How does the immune system decide to mount a helper T-cell response. Immunology. 123 (3), 326-338 (2008).
  21. Duckworth, B. C., Groom, J. R. Conversations that count: Cellular interactions that drive T cell fate. Immunological Reviews. 300 (1), 203-219 (2021).
  22. León, B., López-Bravo, M., Ardavín, C. Monocyte-derived dendritic cells formed at the infection site control the induction of protective T helper 1 responses against Leishmania. Immunity. 26 (4), 519-531 (2007).
  23. Singh, D., et al. Differential responses of chicken monocyte-derived dendritic cells infected with Salmonella gallinarum and Salmonella typhimurium. Scientific Reports. 11, 17214(2021).
  24. Pujol, M., et al. Variability in the response of canine and human dendritic cells stimulated with Brucella canis. Veterinary Research. 48, 72(2017).
  25. Pujol, M., Borie, C., Montoya, M., Ferreira, A., Vernal, R. Brucella canis induces canine CD4+ T cells multi-cytokine Th1/Th17 production via dendritic cell activation. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 62, 68-75 (2019).
  26. Lašťovička, J., Rataj, M., Bartůňková, J. Assessment of lymphocyte proliferation for diagnostic purpose: Comparison of CFSE staining, Ki-67 expression and 3H-thymidine incorporation. Human Immunology. 77 (12), 1215-1222 (2016).
  27. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: An in vitro model to monitor cellular immune function. Journal of Immunological Methods. 293 (1-2), 127-142 (2004).
  28. Shatrova, A. N., et al. Time-dependent regulation of IL-2R α-chain (CD25) expression by TCR signal strength and IL-2-induced STAT5 signaling in activated human blood T lymphocytes. PLoS One. 11 (12), 0167215(2016).
  29. Shedlock, D. J., et al. Ki-67 staining for determination of rhesus macaque T cell proliferative responses ex vivo. Cytometry, Part A. 77 (3), 275-284 (2010).
  30. Yen, H. -R., et al. Tc17 CD8 T cells: Functional plasticity and subset diversity. Journal of Immunology. 183 (11), 7161-7168 (2009).
  31. Kawamura, I., et al. IFN-gamma-producing ability as a possible marker for the protective T cells against Mycobacterium bovis BCG in mice. Journal of Immunology. 148 (9), 2887-2893 (1992).
  32. Federal Ministry Republic of Austria. Agriculture, Forestry, Regions and Water Management. The Federal Act on Animal Welfare (Tierschutzgesetz - TSchG). Federal Law Gazette I 2004/118. , Available from: https://info.bml.gv.at/en/topics/agriculture/agriculture-in-austria/animal-production-in-austria/animal-welfare-act.html (2005).
  33. Corripio-Miyar, Y., et al. Phenotypic and functional analysis of monocyte populations in cattle peripheral blood identifies a subset with high endocytic and allogeneic T-cell stimulatory capacity. Veterinary Research. 46, 112(2015).
  34. Wijewardana, V., et al. Generation of canine dendritic cells from peripheral blood monocytes without using purified cytokines. Veterinary Immunology and Immunopathology. 114 (1-2), 37-48 (2006).
  35. Gallios Flow Cytometer with Kaluza for Gallios Software. Instructions for Use. Beckman Coulter. , Available from: http://www.cytometrie-imagerie-saint-antoine.org/media/3924/Kaluza.Gallos.pdf (2014).
  36. Švajger, U., Jeras, M. Optimal dendritic cell differentiation in rpmi media requires the absence of HEPES buffer. Immunological Investigations. 40 (4), 413-426 (2011).
  37. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), 0231132(2020).
  38. Blanco, F. C., et al. Semi-stable production of bovine IL-4 and GM-CSF in the mammalian episomal expression system. Journal of Veterinary Research. 65 (3), 315-321 (2021).
  39. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. Journal of Experimental Medicine. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  40. Cho, K. -J., Roche, P. A. Regulation of MHC class II-peptide complex expression by ubiquitination. Frontiers in Immunology. 4, 369(2013).
  41. Sansom, D. M., Manzotti, C. N., Zheng, Y. What's the difference between CD80 and CD86. Trends in Immunology. 24 (6), 313-318 (2003).
  42. Han Lee, G., et al. The role of CD40 expression in dendritic cells in cancer biology; a systematic review. Current Cancer Drug Targets. 14 (7), 610-620 (2014).
  43. Tanaka, H., Demeure, C. E., Rubio, M., Delespesse, G., Sarfati, M. Human monocyte-derived dendritic cells induce naive T cell differentiation into T helper cell type 2 (Th2) or Th1/Th2 effectors: Role of stimulator/responder ratio. Journal of Experimental Medicine. 192 (3), 405-412 (2000).
  44. Klechevsky, E., et al. Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR. Blood. 116 (10), 1685-1697 (2010).
  45. Schlienger, K., Craighead, N., Lee, K. P., Levine, B. L., June, C. H. Efficient priming of protein antigen-specific human CD4+ T cells by monocyte-derived dendritic cells. Blood. 96 (10), 3490-3498 (2000).
  46. Soares, A., et al. Novel application of Ki67 to quantify antigen-specific in vitro lymphoproliferation. Journal of Immunological Methods. 362 (1-2), 43-50 (2010).
  47. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2009).
  48. Bachmann, M. F., Oxenius, A. Interleukin 2: From immunostimulation to immunoregulation and back again. EMBO Reports. 8 (12), 1142-1148 (2007).
  49. Koup, R. A., Douek, D. C. Vaccine design for CD8 T lymphocyte responses. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 1 (1), 007252(2011).
  50. Sassu, E. L., et al. Development and evaluation of a real-time PCR panel for the detection of 20 immune markers in cattle and sheep. Veterinary Immunology and Immunopathology. 227, 110092(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

S r Dendritik H creleriPeriferik Kan Monon kleer H creleriManyetik H cre Ay rmaAk SitometrisiLenfosit ProliferasyonuAntijen SunumuKantitatif PCRnterferon Gama

İlgili makaleler