Mitokondriyal Morfolojinin Simülasyon Denetimli Öğrenme Yoluyla Analiz Edilmesi

Bu yazıda, floresan mitokondri belirteçlerini eksprese eden sabit kardiyomiyoblastların floresan mikroskopi görüntülerinde hücre altı segmentasyon¹ için fizik tabanlı bir makine öğrenme aracının faydasını göstereceğiz.

Mitokondri, memeli hücrelerinde ana enerji üreten organellerdir. Spesifik olarak, mitokondri oldukça dinamik organellerdir ve genellikle uzunluk ve dallanma bakımından sürekli değişen ağlarda bulunur. Mitokondrinin şekli işlevlerini etkiler ve hücreler ortamdaki bir değişikliğe uyum sağlamak için mitokondriyal morfolojilerini hızla değiştirebilir². Bu fenomeni anlamak için, mitokondrinin noktalar, çubuklar veya ağlar olarak morfolojik sınıflandırması oldukça bilgilendiricidir³.

Mitokondrinin segmentasyonu, hücrelerdeki mitokondriyal morfolojinin analizi için çok önemlidir. Mitokondrinin floresan mikroskopi görüntülerini segmentlere ayırmak ve analiz etmek için mevcut yöntemler, manuel segmentasyona veya geleneksel görüntü işleme yaklaşımlarına dayanmaktadır. Otsu⁴ gibi eşik tabanlı yaklaşımlar, mikroskopi görüntülerindeki yüksek gürültü seviyeleri nedeniyle daha az doğrudur. Tipik olarak, mitokondrinin morfolojik analizi için görüntüler çok sayıda mitokondri içerir ve bu da manuel segmentasyonu sıkıcı hale getirir. MorphoLibJ⁵ gibi matematiksel yaklaşımlar ve Weka⁶ gibi yarı denetimli makine öğrenimi yaklaşımları oldukça talepkardır ve uzman bilgisi gerektirir. Mitokondri⁷ için görüntü analizi tekniklerinin gözden geçirilmesi, derin öğrenme tabanlı tekniklerin görev için yararlı olabileceğini göstermiştir. Gerçekten de, kendi kendine sürüş gibi uygulamalar için günlük yaşam görüntülerinde görüntü segmentasyonu, derin öğrenme tabanlı modellerin kullanılmasıyla devrim yarattı.

Derin öğrenme, büyük miktarda veriden öğrenen algoritmalar sağlayan makine öğreniminin bir alt kümesidir. Denetimli derin öğrenme algoritmaları, temel doğruluk (GT) etiketleriyle açıklama eklenmiş büyük görüntü kümelerinden ilişkileri öğrenir. Floresan mikroskopi görüntülerinde mitokondrileri segmentlere ayırmak için denetimli derin öğrenmenin kullanılmasındaki zorluklar iki katlıdır. İlk olarak, denetimli derin öğrenme, büyük bir eğitim görüntüleri veri kümesi gerektirir ve floresan mikroskobu durumunda, bu büyük veri kümesini sağlamak, daha kolay kullanılabilir geleneksel kamera tabanlı görüntülerin kullanıldığı zamana kıyasla kapsamlı bir görev olacaktır. İkincisi, floresan mikroskopi görüntüleri, eğitim görüntülerindeki ilgili nesnelerin GT ek açıklamalarını gerektirir; bu, uzman bilgisi gerektiren sıkıcı bir iştir. Bu görev, floresan olarak etiketlenmiş hücre altı yapılara sahip hücrelerin tek bir görüntüsü için uzmanın zamanının saatlerini veya günlerini kolayca alabilir. Ayrıca, ek açıklamalar arasındaki farklılıklar bir sorun teşkil eder. Manuel ek açıklama ihtiyacını ortadan kaldırmak ve derin öğrenme tekniklerinin üstün performansından yararlanabilmek için, burada simüle edilmiş görüntüler üzerinde eğitilmiş derin öğrenme tabanlı bir segmentasyon modeli kullanılmıştır. Fizik tabanlı simülatörler, mikroskopta görüntü oluşum sürecini taklit etmek ve kontrol etmek için bir yol sağlar ve bilinen şekillerin görüntülerinin oluşturulmasına izin verir. Fizik tabanlı bir simülatör kullanarak, bu amaçla mitokondrinin simüle edilmiş floresan mikroskopi görüntülerinden oluşan büyük bir veri kümesi oluşturuldu.

Simülasyon, şekil oluşturma için parametrik eğriler kullanarak geometri oluşturma ile başlar. Yayıcılar, şeklin yüzeyine, yoğunluk deneysel değerlerle eşleşecek şekilde eşit olarak dağıtılmış bir şekilde rastgele yerleştirilir. Mikroskobun 3B nokta yayılma fonksiyonu (PSF), Gibson-Lanni model^9'un hesaplama açısından verimli bir yaklaşımı⁸ kullanılarak hesaplanır. Simüle edilmiş görüntüleri deneysel görüntülerle yakından eşleştirmek için, hem karanlık akım hem de çekim gürültüsü, fotoğraf gerçekçiliği elde etmek için taklit edilir. Fiziksel GT, ikili bir harita şeklinde oluşturulur. Veri kümesini oluşturma ve simülasyon modelini eğitme kodu¹⁰ kullanılabilir ve bu sanal veri kümesini oluşturma adımı Şekil 1'de özetlenmiştir.

Sabit kardiyomiyoblastların konfokal mikroskopi görüntülerini analiz ederek tamamen simüle edilmiş bir veri kümesi üzerinde eğitilmiş derin öğrenme tabanlı segmentasyonun faydasını sergiliyoruz. Bu kardiyomiyoblastlar, mitokondriyal dış zarda bir floresan belirteci ifade ederek, floresan mikroskobu görüntülerinde mitokondrinin görselleştirilmesine izin verdi. Burada örnek olarak verilen deneyi yapmadan önce, hücreler glikozdan mahrum bırakıldı ve kültürde 7 gün boyunca galaktoza adapte edildi. Büyüme ortamındaki glikozun galaktoz ile değiştirilmesi, kültürdeki hücreleri daha oksidatif olmaya zorlar ve böylece enerji üretimi için mitokondrilerine bağımlı hale gelir^11,12. Ayrıca, bu hücreleri mitokondriyal hasara karşı daha hassas hale getirir. Mitokondriyal morfoloji değişiklikleri, hücre kültürü ortamı^13'e karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) gibi bir mitokondriyal ayırma ajanı eklenerek deneysel olarak indüklenebilir. CCCP, mitokondriyal membran potansiyeli (ΔΨm) kaybına yol açar ve böylece mitokondride daha tübüler (çubuk benzeri) bir morfolojiden daha küresel (nokta benzeri) bir morfolojiye¹⁴ kadar değişikliklere neden olur. Ek olarak, mitokondri CCCP tedavisi sırasında şişme eğilimindedir¹⁵. Galaktoza adapte olmuş kardiyomiyoblastlar mitokondriyal uncoupler CCCP ile tedavi edildiğinde mitokondri değişikliklerinin morfolojik dağılımını gösteriyoruz. Mitokondrinin derin öğrenme segmentasyonları, onları noktalar, çubuklar veya ağlar olarak sınıflandırmamızı sağladı. Daha sonra farklı mitokondriyal fenotiplerin dal uzunluklarını ve bolluğunu değerlendirmek için nicel metrikler elde ettik. Analizin adımları Şekil 2'de özetlenmiştir ve hücre kültürü, görüntüleme, derin öğrenme tabanlı segmentasyon için veri kümesi oluşturma ve mitokondrinin nicel analizinin ayrıntıları aşağıda verilmiştir.

NOT: Bölüm 1-4, bilinen deneysel koşullara sahip mitokondrinin mevcut mikroskopi görüntüleriyle çalışıyorsa atlanabilir.

1. Hücre kültürü

1. DMEM'deki H9c2 hücrelerini, 2 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 10 mM galaktoz,% 10 FBS,% 1 streptomisin / penisilin ve 1 μg / mL puromisin ile desteklenmiş glikoz takviyesi olmadan büyütün. Deneylerden önce hücrelerin kültürde en az 7 gün boyunca galaktoza adapte olmasına izin verin.
   NOT: Burada kullanılan H9c2 hücreleri, floresan mitokondrileri eksprese etmek için genetik olarak modifiye edilmiş ve ayrıca bir puromisin direnç geni edinmiştir. Bu antibiyotiğin eklenmesi, direnç geni ve dolayısıyla floresan mitokondri ile hücrelerin büyümesini sağlar.
2. Hücre akıcılığı yaklaşık% 80'e ulaştığında deney için H9c2 hücrelerini tohumlayın (parlak alan mikroskobu ile değerlendirilen T75 kültür şişesi). Devam etmeden önce ortamı ve tripsin miktarını en az 15 dakika boyunca 37 ° C'ye ısıtın.
   NOT: Deneyi iki veya daha fazla farklı hücre kültürü koşuluna paralel olarak gerçekleştirmek mümkündür. Miyoblastik hücrelerin kaybını önlemek için H9c2 hücre akıtması% 80'in üzerinde olmamalıdır. % 100 akıcılıkta, hücreler miyotüpler oluşturur ve farklılaşmaya başlar.
3. Steril bir laminer akış başlığında çalışan hücreleri, 12 kuyucuklu bir plakanın kuyusuna her deneysel durum için #1.5 cam bir kapak parçası yerleştirerek tohumlamaya hazırlanın. Her koşulu ve deneysel ayrıntıları 12 delikli plaka üzerinde etiketleyin.
4. Hücre kültürü şişesini inkübatörden davlumbazdaki çalışma yüzeyine taşıyın. Bir aspirasyon sistemi veya elektronik pipet kullanarak ortamı aspire edin ve ardından 5 mL PBS (oda sıcaklığı) ile iki kez yıkayın.
5. Önceden ısıtılmış tripsini çalışma yüzeyine taşıyın ve son PBS yıkamasını aspire edin; Daha sonra, hücreleri ayırmak için önceden ısıtılmış tripsin ekleyin (T75 kültür şişesi için 1 mL). Kültür şişesini 37 ° C'de 2-3 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin.
6. Önceden ısıtılmış ortamı, inkübasyonun sonuna doğru çalışma yüzeyine taşıyın. Hücrelerin parlak alan mikroskobu kullanarak ayrıldığını doğrulayın.
   1. Tüm hücreler ayrılmamışsa, kalan hücreleri ayırmak için şişenin yan tarafına birkaç dikkatli ama sağlam musluk uygulayın.
7. Kültür şişesini çalışma yüzeyine geri döndürün. Tripsin hareketini durdurmak için elektronik pipet kullanarak kültür şişesine 4 mL hücre kültürü ortamı ekleyin. Şişeye kültür ortamı eklerken, hücreleri ayırmak ve bir hücre süspansiyonuna toplamak için ortamı yüzey boyunca tekrar tekrar dağıtmak için pipeti kullanın.
8. Şişeden hücre süspansiyonunu (5 mL) 15 mL'lik bir tüpe pipetleyin.
9. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj yapın. Tüpü davlumbazda açın, süpernatantı aspirasyonla çıkarın ve hücre peletini 5 mL hücre kültürü ortamında yavaşça yeniden askıya alın.
10. Otomatik bir hücre sayacında hücre süspansiyonunun küçük bir hacmini analiz ederek hücre sayısını değerlendirin. Kültür ortamının mililitresi başına canlı hücre sayısına dikkat edin.
11. Yaklaşık 2 x 10⁴ hücre^/cm2'lik bir tohumlama yoğunluğu için hesaplanan hücre süspansiyonunun istenen hacmini (örneğin, kuyucuk başına 150 μL), önceden etiketlenmiş 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne taşıyın. Önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamını, kuyu sayısına bağlı olarak önceden hesaplanmış bir hacimde 15 mL santrifüj tüpüne ekleyin. 12 kuyucuklu plakalar için, her kuyucuk için toplam 1 mL hacim kullanın.
12. Her bir kuyucuğa uygun hacmi dağıtmadan önce santrifüj tüpünün içeriğini birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek seyreltilmiş hücre süspansiyonunun düzgün bir şekilde karıştırıldığından emin olun. Hücre süspansiyonu kuyuya dağıtıldıktan sonra, hücreleri kuyucuklar boyunca daha iyi dağıtmak için plakayı her yönde dikkatlice kontrol edilen bir şekilde sallayın. 12 delikli plakayı ertesi güne kadar 37 ° C'de inkübatöre yerleştirin.
13. Büyümeyi değerlendirmek için hücreleri parlak alan mikroskobu ile kontrol edin. Hücreler yaklaşık% 80 akıcılığa kadar yeterli büyüme sağlamışsa, sonraki adımlara geçin; aksi takdirde, yeterli büyümeye ulaşılana kadar değerlendirmeyi günlük olarak tekrarlayın.

2. Deneysel prosedür

1. Stok çözeltisi konsantrasyonlarına göre deney için gerekli malzemelerin miktarlarını hesaplayın. Dondurulmuş malzemeleri (30 mM CCCP stok çözeltisi) 37 ° C'de çözün ve hücre kültürü ortamını 37 ° C'de ön ısıtmaya ayarlayın.
2. Çözüldükten sonra, stok çözeltisini (1:3.000) hücre kültürü ortamında seyrelterek 10 μM CCCP'lik bir çalışma çözeltisi oluşturun.
   NOT: Pipet hacimleri 1 μL'den küçük olmamalıdır.
3. Gerekli tüm malzemeler hazırlandıktan ve önceden ısıtıldıktan sonra deneysel tedavilere başlayın. Hücre kültürü ortamını 12 delikli plakanın kuyucuklarından aspire edin ve ardından taze önceden ısıtılmış ortamı kontrol kuyularına ve önceden ısıtılmış ortamı 10 μM CCCP çözeltisi ile test durumu kuyularına hızlı bir şekilde uygulayın.
4. 12 delikli plakayı 37°C hücre inkübatöründe 2 saat boyunca inkübe edin. Kuluçka döneminde, fiksasyon çözeltisini hazırlayın.
5. Fiksasyon çözeltisinin hazırlanması için,% 25 glutaraldehit (GA) stok çözeltisini% 0.2'ye (1: 125) seyreltmek için önceden yapılmış% 4 paraformaldehit (PFA) kullanın. Çözeltiyi 37°C'de ön ısıtmaya ayarlayın. 12 delikli bir plaka için, kuyu başına 500 μL yeterlidir.
   DİKKAT: PFA ve GA toksik kimyasallardır. Koruyucu donanıma sahip kimyasal bir başlıkta çalışın. Ayrıntılar için ilgili SDS'lerine bakın.
6. Kuluçka süresi tamamlandığında, 12 delikli plakayı inkübatörden çıkarın ve çalışma yüzeyine yerleştirin.
   NOT: İş artık steril bir ortam gerektirmez.
7. Hücre kültürü ortamını kuyucuklardan aspire edin ve önceden ısıtılmış fiksasyon çözeltisini uygulayın. 12 delikli plakayı 20 dakika boyunca 37°C inkübatöre geri koyun.
8. Kuluçkayı tamamladıktan sonra fiksasyon çözeltisini aspire edin ve her bir kuyucuğu oda sıcaklığında PBS ile iki kez yıkayın. Protokolün bu aşamasında deneyi duraklatmak ve daha sonra devam etmek mümkündür.
   1. Deney duraklatılırsa, kuyu başına 1 mL PBS ekleyin, 12 delikli plakayı plastik film (parafilm) ile kapatın ve 4 ° C'de saklayın.

3. Hücrelerin örtü kapaklarına boyanması ve monte edilmesi

1. DAPI (nükleer leke) stoğunu çözün ve açmadan önce mini bir santrifüjde döndürün. PBS'de DAPI stoğunu seyrelterek DAPI boyama çözeltisi hazırlayın (1:1.000).
2. PBS'yi 12 delikli plakadan aspire edin ve her bir oyuğa 1 mL DAPI boyama çözeltisi uygulayın. Karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
3. DAPI boyama solüsyonunu aspire edin. Kuyu başına 2 mL PBS ile iki kez yıkayın.
4. Buzlu cam mikroskop slaytlarını (cam slaytlar) %70 etanolde yıkayarak hazırlayın, ardından PBS'de üç yıkama yapın. Tüy bırakmayan kağıt havlular kullanarak slaytları dikkatlice kurutun ve toz veya yağ izlerini kontrol etmek için ışığa doğru yönlendirin.
   NOT: Bu adım için eldiven gereklidir.
5. Cam slaytları deneysel ayrıntılarla etiketleyin. Montaj ortamını bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve mini bir santrifüjde aşağı doğru döndürün.
6. Çalışma alanını düzenleyerek kapak fişlerini monte etmeye hazırlanın. Kapakları, etiketli cam slaytları, montaj ortamı, pipeti, 10 μL pipet uçları, tüy bırakmayan kağıt havluları ve cımbızları olan 12 delikli bir plakayı hazır bulundurun.
7. Bir kapak kapağını monte etmek için hazırlanmış bir cam slaydına 10 μL montaj ortamı (ProLong Glass) uygulayın.
8. Cımbız kullanarak 12 delikli plakadan kapak fişini alın ve hazırlanan tüy bırakmayan kağıt havluya kapak kapağının kenarına ve arkasına kısaca dokunarak örtü kapağındaki nemi alın. Kapak kaymasını montaj ortamının damlacığının üzerine yavaşça indirin.
9. Her kapak kapağı için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın. Cam slayt başına bir ila dört kapak kaymasına izin vermek için montaj ortamı damlacıklarını yerleştirin.
10. Monte edilmiş kapakların hareket etmesini önlemek için cam kızakların düz bir yüzeyde olduğundan emin olun. Montaj ortamının ayarlanmasına izin vermek için cam slaytları gece boyunca oda sıcaklığında karanlık bir yere yerleştirin. Örnekler artık görüntüleme için hazırdır. Deney, protokolün bu aşamasında duraklatılabilir ve daha sonra devam ettirilebilir.
11. Deney bu aşamada duraklatılırsa, numunelerin gece boyunca oda sıcaklığında ayarlanmasına izin verdikten sonra, ışıktan korumak için alüminyum folyo ile örtün ve 4 ° C'de saklayın.

4. Mikroskopi ve görüntüleme

1. Numuneleri nakliye için alüminyum folyo içinde örtün (zaten yapılmamışsa).
2. Mikroskopi tesisine vardığınızda, PBS kalıntılarını cam slaytlardaki kapak fişlerinden temizlemek için mikroskop filtre kağıdı ile çift damıtılmış_H2O kullanın. Cam slaytları parlak bir ışığa doğru tutarak kapak kapaklarında leke olmadığından emin olun.
3. Mikroskop için başlangıç prosedüründen geçin. Uygun hedefi seçin (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27) ve daldırma ortamı ekleyin.
4. Numuneyi numune tutucuya yerleştirin. Mikroskop yazılımında, EGFP floresan aydınlatmasını etkinleştirmek için "Bul" sekmesini kullanın ve oküler kullanarak, numunenin odaklanması için z seviyesini manuel olarak ayarlayın. Odağı bulduktan sonra floresan aydınlatmayı kapatın.
5. Mikroskop yazılımındaki "Al" sekmesine geçin. Görüntüleme için kullanılacak floresan kanallarını seçmek için "Akıllı Kurulum" u kullanın. Bu deney için EGFP ve DAPI kanal hazır ayarları seçilmiştir.
6. Optimize edilmiş sinyal gücü için bir kılavuz olarak yoğunluk histogramını kullanarak her kanal yoğunluğunu başlangıç ayarlarından ayarlayın. Görüntüleme artık başlayabilir.
7. Görüntüleme için, görüntüleme konumlarının bir diziye yerleştirilmesi için yazılımın seçeneğini kullanın ve diziyi kapak fişinin ortasında, görüntülenecek toplam 12 konumla ortalayın. Dizideki her konumun hücreler içerdiğini doğrulayın. Hücre yoksa, konumu hücreli bir alana ayarlayın.
8. Mikroskop yazılımının otomatik odaklamasını kullanarak dizideki her konumun odağını ayarlayın ve mümkün olduğunca çok sayıda mitokondrinin odakta olduğundan emin olmak için bunu manuel bir ince ayar ile takip edin.
   NOT: Bu manuel ayarlamalar için EGFP kanalı kullanılır.
9. Her kapak fişi için bu yöntemi kullanarak görüntüleri elde edin. Görüntü dosyalarını kaydedin ve morfolojik analiz adımlarına geçin.

5. Simüle edilmiş eğitim verileri oluşturma

1. ¹⁰ kodunu indirin ve içeriği açın. Gerekli ortamı ayarlamak için README.md'daki yönergeleri izleyin.
2. Bu projenin giriş klasörü olan "src" adlı klasöre gidin. İçindeki numaralı klasörler, aracı kullanmanın farklı adımlarına özgü kodlar içerir.
   Not: Kodun herhangi bir alt klasörüne gitmek için "cd <>" komutunu kullanın. Herhangi bir python dosyasını çalıştırmak için "python <>.py" komutunu kullanın. "Öğretici.pptx" adlı sunu, segmentasyon modelini kullanmak için eksiksiz bir yönergeler kümesi içerir.
3. Bir kopyasını oluşturun veya "2. Mitokondri Simülasyonu Airy" yi yeniden adlandırın ve yeniden adlandırın (Airy, mevcut mikroskop olarak kullanılan konfokal bir mikroskoba en yakın PSF fonksiyonu olduğu için burada kullanılır). "Simülatör" adlı klasöre gidin.
   NOT: Bu klasör, eğitim verilerinin simülasyonuyla ilgili tüm dosyaları içerir. Simülasyon için ayarlanacak üç parametre kümesi vardır.
4. İlk olarak, "simülatör / parti / bxx.csv" toplu yapılandırma dosyasındaki simülatör için, mitokondri sayısı, çapların aralığı ve yapıların uzunlukları, yapının sergilediği z ekseninin aralığı ve floroforların yoğunluğu dahil olmak üzere numune hakkında parametreleri ayarlayın.
5. Ardından, optik sistemle ilgili parametreleri ayarlayın.
   1. Bu set, mikroskop türünü (hangi PSF modelinin seçileceğini belirleyen), sayısal diyafram açıklığını (N.A.), büyütmeyi (M), piksel boyutunu (μm cinsinden), floroforların emisyon dalga boyunu ve arka plan gürültü parametresini vb. İçerir.
   2. N.A.'nın optik parametrelerini, büyütmeyi ve veri kümesinin minimum dalga boyunu "simülatör/microscPSFmod.py" dosyasında ayarlayın.
   3. Piksel boyutu için istenen değeri ayarlayın ve veri kümesinin emisyon dalga boyunu parametre olarak "simülatör/process_matrix_all_z" dosyasındaki "generate_batch_parallel.py" işlevine ayarlayın.
   4. "Simülatör/save_physics_gt" dosyasındaki "generate_batch_parallel.py" fonksiyonunun son üç parametresini ayarlayın. Parametreler piksel boyutu (nm cinsinden), çıktı görüntüsünün boyutu ve max_xy.
6. "Simülatör/generate_batch_parallel.py" dosyasında, çıktı görüntülerinin boyutu, her görüntüdeki kutucuk sayısı ve toplam görüntü sayısı gibi çıktı veri kümesiyle ilgili üçüncü parametre kümesini ayarlayın.
7. Simülasyonu başlatmak için "simulator/generate_batch_parallel.py" dosyasını çalıştırın.
8. Son boyutlu görüntüyü elde etmek için, "5. Veri Hazırlama ve Eğitim/veri hazırlama" ana klasöründedir ve bu klasöre gidin.
   NOT: Sentetik veri kümesinin her görüntüsü, 256 piksel x 256 piksellik son görüntü boyutunu veren 128 piksel x 128 piksellik dört simüle edilmiş görüntünün bir montajı oluşturularak oluşturulur. Bu ilk önce hem mikroskop görüntüleri ("çıktı" klasöründe) hem de zemin doğruluğu segmentasyonları ("çıktı / physics_gt" klasöründe) için birçok bireysel karo (yaklaşık 12.000) üretir.
   1. Toplu iş numarasının parametrelerini, parti başına görüntü sayısını ve gürültü aralığını "data_generator.py" olarak ayarlayın.
   2. Montaj görüntülerini oluşturmak için "data_generator.py" dosyasını çalıştırın.
   3. "Resim" ve "segment" adlı klasörleri "5. Veri Hazırlama ve Eğitim/datatrain/train" klasöründen "5. Veri Hazırlama ve Eğitim/veri hazırlama/veri".

6. Derin öğrenme tabanlı segmentasyon

1. Simüle edilmiş görüntülerde segmentasyon modelini aşağıdaki gibi eğitin:
   1. Yeni bir mikroskop için segmentasyon modelini eğitmek için, "5. Veri Hazırlama ve Eğitim/Eğitim" klasörünü oluşturur ve "train_UNet.py" dosyasında toplu iş boyutunun parametrelerini, segmentasyon için omurga modelini, çağ sayısını ve eğitim için öğrenme hızını ayarlar.
   2. Eğitime başlamak için "train_UNet.py" komutunu çalıştırın. Eğitim süreci, simüle edilmiş doğrulama kümesindeki segmentasyonun performansına ilişkin metriği görüntüler.
      NOT: Eğitim tamamlandıktan sonra, model best_model"5. Veri Hazırlama ve Eğitim/Eğitim" klasörü.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek modeli, eğitilen model için istenen bir boyuta bölünmüş gerçek mikroskop görüntülerinde test edin.
   1. "6. Test Verilerini Hazırla", ve ". png" formatındaki veri dosyaları "png" klasörüne yerleştirilir.
   2. Görüntüleri eğitilen model için istenen bir boyuta bölmek üzere "split_1024_256.py" dosyasını çalıştırın. Bu, "veri" klasöründeki görüntülerin 256 piksel x 256 piksel boyutunda kırpmalarını oluşturur.
   3. Oluşturulan "veri" klasörünü "7. Test Segmentasyonu" klasörü.
   4. Klasöre gidin "7. Test Segmentasyonu"nu seçin ve kullanılacak kaydedilen modelin adını ayarlayın.
   5. Kırpmaları segmentlere ayırmak için "segment.py" dosyasını çalıştırın. Segmentlere ayrılmış görüntüler "çıktı" klasörüne kaydedilir.

7. Morfolojik analiz: "Glikoz" ve "CCCP" olmak üzere iki veri grubunun mitokondriyal morfolojisinin analizi

1. Analiz edilecek verileri düzenleyin (her görüntü için bir klasör, her klasör bir görüntünün segmentlere ayrılmış çıktı kırpmalarını içerir).
2. "make_montage.py" adlı ek dosyayı indirin ve "7. Test Segmentasyonu".
3. Parçalanmış çıktıyı görüntünün orijinal boyutuna geri dikmek için "make_montage.py" dosyasını çalıştırın.
4. "9. Morfolojik Analiz", "src" klasörünün içinde.
5. "pip install seaborn[stats] skan" komutunu kullanarak Skan¹⁶ ve Seaborn Python paketlerini ortama yükleyin.
   NOT: Segmentasyon maskeleri, her bir mitokondrinin topolojisinin analizini sağlamak için Skan adlı kütüphane kullanılarak iskeletleştirilir.
6. Ek dosya " analyze_mitochondria.py " dosyasını "9. Morfolojik Analiz".
7. Denemenin farklı gruplarının görüntülerini "7" klasörünün içindeki farklı klasörlere yerleştirin. Test Segmentasyonu".
8. "analyze_mitochondria.py" dosyasındaki "piksel boyutu" ve "giriş yolu " parametrelerini ayarlayın.
9. Analizi iskeletleştirmek ve grafiklerini oluşturmak için kodu çalıştırmak için " analyze_mitochondria.py" dosyasını çalıştırın.

Floresan mitokondri belirteçlerini eksprese eden sabit kardiyomiyoblastların konfokal görüntülerinde mitokondrinin derin öğrenme segmentasyonlarından elde edilen sonuçlar, bu yöntemin faydasını göstermektedir. Bu yöntem, sadece yeniden eğitim gerektiren diğer hücre tipleri ve mikroskopi sistemleri ile uyumludur.

Floresan mitokondrili galaktoza adapte H9c2 kardiyomiyoblastları 2 saat boyunca CCCP ile veya CCCP olmadan tedavi edildi. Hücreler daha sonra sabitlendi, nükleer bir boya ile boyandı ve floresan mikroskobu analizi için cam slaytlara monte edildi. Hem kontrol hem de CCCP ile tedavi edilen hücrelerin görüntülerini elde etmek için bir konfokal mikroskop kullanıldı. Analizimizi, koşul başına yaklaşık 60 hücre ile 12 konfokal görüntü üzerinde gerçekleştirdik. Her görüntüdeki mitokondrinin morfolojik durumu daha sonra belirlendi ve ölçüldü. Eğitilen modelden elde edilen segmentasyon maskeleri, bu deney için her bir mitokondrinin topolojisinin analizini sağlamak için iskeletleştirildi. Bireysel mitokondrinin dal uzunluğu sınıflandırma için parametre olarak kullanıldı. Bireysel mitokondriler aşağıdaki kuralla morfolojik sınıflara ayrıldı. Spesifik olarak, uzunluğu 1.500 nm'den az olan herhangi bir mitokondriyal iskelet bir nokta olarak kabul edildi ve daha uzun mitokondri ayrıca ağ veya çubuk olarak kategorize edildi. İki veya daha fazla dalın kesiştiği en az bir kavşak varsa, bu bir ağ olarak tanımlandı; Aksi takdirde, mitokondri bir çubuk olarak sınıflandırıldı. Morfoloji sınıflarıyla etiketlenmiş mitokondriyal iskeletlerin yer aldığı örnek bir görüntü Şekil 3'te gösterilmiştir.

Şekil 4A'daki mitokondriyal morfoloji kategorizasyonu, CCCP 2 saat boyunca uygulandığında önemli değişiklikleri tespit etmenin mümkün olduğunu göstermektedir; Bu, CCCP ile tedavi edilen hücreler için noktalardaki artışla en açık şekilde gösterilmiştir.

Şekil 4B'deki ortalama dal uzunluğu, morfolojideki saptanabilir ve önemli değişiklikleri göstermek için başka bir yoldur. Hem çubuklar hem de ağlar, beklendiği gibi, hücreler CCCP ile tedavi edildiğinde kontrole göre önemli ölçüde azaldı. Noktaların ortalama dal uzunluklarındaki önemli artış, mitokondrinin CCCP'ye maruz kaldığında maruz kaldığı şişlik göz önüne alındığında da bekleniyordu.

Şekil 1: Floresan mikroskopi görüntülerinin simülasyonu için boru hattı. İşlem hattı (i) 3B geometri üretimi, (ii) yayıcılar ve fotokinetik öykünme, (iii) 3B PSF evrişimi, (iv) gürültü toplama ve (v) ikileştirmeyi içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mitokondriyal morfolojinin makine öğrenimi tabanlı analizinin adımları . (1) Bölümlendirilecek görüntüler önce segmentasyon modeli için kabul edilebilir boyutlarda kırpılır. (2) Derin öğrenme tabanlı segmentasyon, görüntü kırpmalarına uygulanır. (3) Parçalanmış çıktı mahsulleri orijinal boyutlarına geri dikilir. (4) Montajlı segmentasyonlar iskeletleştirilmiştir. (6) Morfolojik analiz, iskeletleştirmelerden elde edilen topolojiye göre yapılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Mitokondriyal iskelet, mikroskopi görüntülerinin segmentasyon çıktısı üzerine bindirilmiştir. (A) Segmentasyon çıktısı. (B) Düz çizgi iskeleti (bir dalın başlangıç ve bitiş noktaları arasındaki Öklid mesafesi) segmentasyon çıktısının üzerine bindirilir. İskeletin renk kodlaması mitokondri sınıfını tasvir eder. Ağlar kırmızı, çubuklar yeşil ve noktalar mor renklidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Mitokondriyal morfolojinin analizi. (A) Toplam mitokondriyal uzunluğa dayanan farklı morfolojik kategorilerin göreceli yüzdesine genel bir bakış. (B) Deney koşulları ile morfolojik kategoriler arasındaki ortalama mitokondriyal dal uzunluğunun karşılaştırılması. X ekseni morfolojik kategorizasyonları görüntüler ve y ekseni mitokondri ortalama dal uzunluğunu nanometre (nm) cinsinden görüntüler. P-değerleri biçimindeki istatistiksel anlamlılık * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 ve **** p 0,0001 < olarak gösterilmiştir . Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Segmentasyonun başarısızlığı durumu. Yüksek yoğunluklu mitokondri, segmentasyon modeli için zorlu bir senaryodur. Renkli iskelet, görüntüde tespit edilen en uzun tek mitokondri gösterir. Uzunluk ölçümlerinden geçerek, bu senaryolar tespit edilebilir ve morfolojik operatör aşındırıcısını kullanarak segmentasyon sonuçlarını iyileştirmek için üzerinde çalışılabilir (tespit edilen iskeleti zayıflatır). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar bu makale ile ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.