$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Son on yılda, hücre ve doku görüntüleme 1,2'ye tutarlı Raman mikroskobu (CRM) uygulanmasına olan ilgide bir artış olmuştur. CRM, iki popüler çeşidi olan güçlü bir kimyasal görüntüleme tekniğidir: tutarlı anti-Stokes Raman saçılımı (CARS) mikroskobu ve uyarılmış Raman saçılımı (SRS) mikroskobu. SRS, CARS'a kıyasla giderek daha popüler hale geliyor çünkü Raman dışı arka plan girişiminden daha az etkileniyor ve konsantrasyon3'e doğrusal bir bağımlılığa sahip. CRM, Raman spektroskopisine benzer moleküler titreşim bilgisi elde eder, ancak önemli ölçüde geliştirilmiş toplama hızı sunar4. Bu, yüksek tepe yoğunluğuna sahip bir çift darbeli lazer aracılığıyla tutarlı titreşimsel uyarımla elde edilir. CRM, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte uzamsal olarak çözümlenmiş kimyasal haritalama sağladığından, kanser teşhisi, lipid metabolizması, hücre metabolizması, ilaç taşınması ve diğer birçok alanda önemli uygulamalar bulmuştur 5,6,7,8. Bununla birlikte, tekniğin yaygın olarak benimsenmesini engelleyen önemli bir darboğaz, teknik karmaşıklığı ve standartlaştırılmış protokollerin eksikliğidir. Ticari lazerler ve mikroskoplar halihazırda mevcut olmasına rağmen, şu anda bu alanda kullanılan hemen hemen tüm sistemler, alana girmek veya bu teknolojiyi benimsemekle ilgilenen araştırmacılar için önemli bir engel oluşturan lazerlerin, optiklerin, mikroskopların ve dedektörlerin çeşitli düzeylerde özelleştirilmesini içerir. Erişim eksikliği biyolojik uygulamaları daha da engellemektedir. Bu yöntem koleksiyonunun amacı, enstrümantasyon, yeni görüntüleme yaklaşımları ve in vitro/in vivo hücre veya doku görüntüleme uygulamaları hakkında ayrıntılı örnekler ve rehberlik sağlamaktır. Alanında uzman kişilerin burada özetlenen yedi yayınına yer verdik.
Clark ve ark. hiperspektral SRS ve CARS'ın duyarlılık, uzamsal çözünürlük ve spektral çözünürlük9 açısından yan yana bir karşılaştırmasını sunar. Her iki teknik de, dar bant Raman çözünürlüğü elde etmek için spektral olarak cıvıl cıvıl geniş bant femtosaniye lazerleri kullanan, yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olan femtosaniye lazerlerin spektral odaklanması ile uygulanır. Doğrudan bir karşılaştırma, algılama farklılıklarının değerlendirilmesine ve farklı kimyasal görüntüleme uygulamaları için modalitenin optimum seçimine olanak tanır.
De la Cadena ve ark. geniş bant SRS görüntülerini hızlı bir şekilde elde edebilen yeni bir multipleks SRS yöntemi yayınladı10. Teknik, aynı anda 32 kanala kadar algılamaya izin veren özel bir diferansiyel çok kanallı kilitli amplifikatör algılamasına dayanmaktadır. Ek olarak, ayrıntılı gürültü karakterizasyonu gösterilir ve lazer gürültüsünü ortadan kaldırmak için dengeli bir algılama yöntemi gösterilir. Bu protokol, multipleks SRS sistemleri oluşturmakla ilgilenen kullanıcılar için pratik rehberlik sağlar.
Shi ve ark. SRS görüntülemede yüksek oranda çoğullanmış Raman boyalarının kullanımını göstermektedir11. Rezonans öncesi güçlendirme ile SRS'nin standart immünofloresan ile karşılaştırılabilir hassasiyet sağlayabileceğini gösterdiler. Bu yöntem, geleneksel immünofloresanda spektral olarak çözülebilir kanalların sınırını aşar ve birçok proteinin aynı anda izlenmesine ve etkileşimlerinin incelenmesine olanak tanır. Bu güçlü yöntemin benimsenmesini kolaylaştırmak için numune işleme ve Raman boya boyama hakkında ayrıntılı rehberlik sağlanmaktadır.
Miao ve ark. SRS'yi genişleme mikroskobu12 ile birleştiren süper çözünürlüklü bir görüntüleme tekniği olan şişmiş doku ve analizin (VISTA) titreşimsel görüntülemesini sunar. VISTA, floresan görüntüleme ile ilgili engelleri aşar ve biyolojik numunelerde 78 nm'ye kadar uzamsal çözünürlükle etiketsiz süper çözünürlüklü hacimsel görüntüleme sağlar. Ayrıca, hücrelerdeki ve beyin dokularındaki protein kümeleri de dahil olmak üzere çok bileşenli segmentasyon elde etmek için derin öğrenme algoritmasından yararlanırlar.
Espinoza ve ark. doku teşhis uygulamaları için proteinlerin ve lipidlerin gerçek zamanlı iki renkli SRS görüntülemesinin kullanımını sunar13. İki renkli SRS görüntüleme, patoloji uygulamaları için H&E-eşdeğer görüntüler oluşturabilir. Bu protokol, eşzamanlı iki renkli SRS görüntüleme için ortogonal modülasyon tekniğinin ve spektral odaklamanın uygulanmasının ayrıntılarını açıklar. İki renkli SRS görüntülerinin pseudo-H&E görüntülerine dönüştürülmesi, doku teşhis uygulamalarını göstermek için fare beyin dokusu ile de gösterilmiştir.
Yuan ve ark. canlı hücrelerin uzun süreli SRS görüntülemesi için esnek bir oda sistemi yayınlayın14. Mevcut canlı hücre gözlem odalarının çoğu, parlak alan ve floresan görüntüleme için tasarlanmıştır. Yüksek NA objektif ve kondansatör gereksinimi nedeniyle SRS tespiti ile uyumsuzdurlar. Yazarlar, sabit sıcaklık, CO2 ve nemi koruyan esnek oda ile 24 saatlik hızlandırılmış SRS görüntülemeyi göstermektedir.
Son olarak, Wu ve ark. eşzamanlı in vivo iki fotonlu floresan (TPEF) ve SRS görüntüleme15'i gösterir. Tamamlayıcı bilgi sağlamak için her iki görüntüleme yöntemi için optimum hassasiyeti elde etmek için iki ayrı lazer sistemi birleştirilir. İn vivo Dokunun SRS görüntülemesi, depolarize, geri saçılan ışığın epi-tespiti ihtiyacı nedeniyle benzersiz zorluklara sahiptir. Bu protokol, bir TPEF-SRS mikroskobunun optimal kurulumunun ayrıntılarını ve farenin omuriliğinin in vivo görüntülenmesi için nasıl kullanılabileceğini tartışır.
Bu yayın koleksiyonu, CRM enstrümantasyonu ve teknik gelişmelerdeki mevcut en son teknolojiyi temsil etmektedir. Hem yöntem geliştirme hem de uygulamalarla ilgilenen araştırmacılar, bu koleksiyonu kurulumları karşılaştırmak ve kendi sistemlerini oluşturmak veya optimize etmek için kıyaslamalar (hassasiyet, çözünürlük vb.) oluşturmak için yararlı bulacaktır. Bu protokollerde sağlanan kılavuzlar ve en iyi uygulamalar, mevcut ve gelecekteki in vitro ve in vivo uygulamaları bilgilendirecektir. CRM teknolojisinin geniş çapta benimsenmesi, hala önemli ve yenilikçi uygulamaları ve eksiksiz CRM çözümlerinin ticarileştirilmesini beklemektedir. Bununla birlikte, tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği sağlamak ve CRM16'nın daha geniş bir şekilde uygulanmasını kolaylaştırmak için görüntüleme yaklaşımlarının ve kıyaslamalarının standardizasyonu esastır.
CRM alanı hızla büyüyor. Hassasiyet, özgüllük ve çözünürlük sınırını zorlayan teknik gelişmeler, teknolojiyi yeni alanlara taşımaya devam ediyor. Örneğin, SRS'nin uzamsal çözünürlüğü kırınım sınırını17,18 aşmaya başlıyor. Elektronik rezonans öncesi SRS'nin duyarlılığı artık floresan19'unkine yaklaşıyor. Floresan ile karşılaştırıldığında, CRM'nin belirgin avantajları vardır. Örneğin, döteryum izlemenin kullanılması, küçük moleküllerin metabolik dinamiklerinin ilk kez hücre altı çözünürlükte in vivo çalışmasına izin verdi20. Küçük etiketlerle, 24 veya daha fazla etiketli hedefin21 yüksek oranda çoğullanmış Raman tespitini gerçekleştirmek mümkündür. Yapay zekadaki gelişmeler, ince uzamsal ve spektral özellik farklılıklarına sahip nesneleri segmentlere ayırmak ve sınıflandırmak için yüksek bilgi içeriğinden ve molekülere özgü özelliklerinden yararlanarak CRM için yeni yetenekler sağlar22. CRM'deki bu teknik gelişmeler hep birlikte hem biyolojik hem de biyomedikal görüntülemedeki uygulamaları hızlandırmaya ve genişletmeye hazırlanıyor.