Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Döteryum (2H) Etiketleme Yaklaşımını Kullanarak İnsanlarda İn Vivo Yağ Dokusu Kinetiğinin Ölçülmesi

721 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64883

⸱

21 Temmuz 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, 2University of California at Berkeley

Bu makalede

Özet

Burada, döteryum (2H) etiketleme yöntemini kullanarak insanlarda in vivo yağ dokusu kinetiğini ölçmek için bir protokol sunulmaktadır.

Özet

Beyaz yağ dokusu, tüm vücut enerji homeostazını korumak için gerekli olan oldukça plastik bir organdır. Yağ dokusu kütlesi ve yağ kütlesi veya dağılımındaki değişiklikler, yağ hücrelerinin ve triaçilgliserollerin sentezi ve parçalanmasındaki (yani ciro) değişikliklerle düzenlenir. Kanıtlar, subkutan yağ dokusu genişlemesinin (yani, hipertrofi ve hiperplazi) ve cironun şekli ve büyüklüğünün, adipogenez obezite ve ilgili hastalıkların patogenezinde rol oynadığından, metabolik sağlığı etkileyebileceğini göstermektedir. Yağ döngüsünün insan sağlığındaki potansiyel rolüne rağmen, adipoz hücrelerin in vivo kinetiği hakkında bilgi eksikliği vardır. Bu, kısmen, yağ dokusundaki hücrelerin yavaş devir hızından ve metabolik öncüllerini in vivo olarak doğrudan etiketlemenin pratik karmaşıklığından kaynaklanmaktadır. Burada, döteryum (2H) etiketli su tüketimi yoluyla insanlarda in vivo adipoz kinetiği ve devir oranlarını ölçme yöntemlerini açıklıyoruz. 2H'nin pre-adipositlerde ve adipositlerde DNA'nın deoksiribonükleotid kısımlarına dahil edilmesi, hücre oluşumu ve ölümünün (yağ döngüsü) doğru bir ölçümünü sağlar. Genel olarak, bu, in vivo yağ kinetiği ölçümüne yönelik yenilikçi bir yaklaşımdır ve diğer in vitro değerlendirmelerden önemli bir sapmayı temsil eder.

Giriş

Obezite, aşırı beyaz yağ dokusu (AT) ile karakterize bir hastalıktır ve Tip II diyabet ve kardiyovasküler hastalık gelişimi için önemli bir risk faktörüdür1. Beyaz AT, enerjiyi triaçilgliseroller (TG'ler) şeklinde depolayan ve metabolik homeostaz2 için gerekli olan oldukça plastik bir organdır. Beyaz AT, yetişkinlikdöneminde 3 genişleme, azaltma ve yeniden şekillenme yeteneğini korur ve AT kütlesi, adiposit hacmindeki dinamik değişiklikler (TG sentezi ve parçalanması yoluyla ), pre-adipositlerin çoğalması ve farklılaşması yoluyla sürekli adiposit oluşumu (yani, hiperplazi veya adipogenez) ve yağ hücresi ölümü4.

Kanıtlar, subkutan AT döngüsü (örneğin, adiposit oluşumu ve ölümü) ile kardiyometabolik sağlık 5,6,7,8 arasında önemli bir bağlantı olduğunu ve obezite ile ilişkili bozuklukların patogenezinde adipogenezin rolünün tartışmalıdır4. Bununla birlikte, kısmen AT'nin hücresel bileşenlerinin yavaş devir hızı ve metabolik öncüllerini in vivo olarak doğrudan etiketlemenin karmaşıklığı nedeniyle insanlarda in vivo AT cirosu hakkında çok az şey bilinmektedir. İn vitro yöntemler bazı bilgiler sağlamış olsa da, bu yaklaşımlar AT'nin doğal ortamı içinde kapsamlı bir in vivo değerlendirme sağlamamaktadır.

Hellerstein laboratuvarı9 tarafından, kararlı izotop döteryumun (2H) ağır sudan (2H2O) AT'ye dahil edilmesini kullanarak in vivo AT cirosunu değerlendirmek için bir yöntem geliştirilmiştir (Şekil 1)10. Farelerde ve insanlarda doğrulanmış olan protokol, vücut suyunun 2Hzenginleştirmesiniartırmak için 2H 2 O'luk bir başlangıç artışını ve ardından stabil, platoya yakın zenginleştirme değerlerini korumak için yeterli günlük alımı içerir. 2H2O'dan (yani ağır su) gelen 2H, adipoz hücrelerin DNA'sındaki deoksiribonükleotidlerin deoksiriboz (dR) kısmına dahil edilir ve izotop zenginleşmesi, kütle spektrometresi ve kütle izotopomer dağılım analizi (MIDA) uygulaması yoluyla DNA'da ölçülür9,10,11. DNA'daki pürin deoksiribonükleotidlerinin deoksiriboz kısmının kararlı izotop öncüleri ile etiketlenmesi, pirimidin nükleotid baz kısımları (örneğin, 3H-timidin veya bromo-deoksiüridinden) ile etiketlemeyi içerenler gibi önceki yöntemlere göre çeşitli avantajlara sahiptir. Dikkat çekici bir şekilde, bazların, özellikle pirimidinler için, ancak dR'nin değil, DNA'nın kopyalanmasında endojen olarak yeniden dahil edilmesi, daha önce etiket birleştirme12'nin yorumunu karıştırdı. Ek olarak, kararlı bir izotop etiketinin dR'ye dahil edilmesi, 3H (trityum) veya bromo-deoksiuridin gibi radyoaktif veya genotoksik ajanların dahil edilmesinin aksine, genotoksisiteye neden olmaz. Bu nedenle, bu tekniğin hayvan modellerinde ve insanlarda uzun süreli kullanımı güvenlidir.

2H etiketli DNA sentezinin ölçümü, bir hücrenin hücre bölünmesinin S fazından geçişini gösterir ve yeni oluşan pre-adipositleri ve adipositleri (pre-adiposit farklılaşması yoluyla) veya adipogenezi13 tanımlar. Hızlı dönüşüm geçiren hücreler (örneğin, monositler) DNA'larını hızlı bir şekilde değiştirir ve 2H-zenginleştirmede bir platoya ulaşır, böylece test için dahili bir referans sağlar. Adipoz hücrelerden DNA'nın 2H-zenginleştirmesinin monositlere (referans hücreler) veya entegre vücut 2H2O ölçümüne oranı, yeni sentezlenen yağ hücrelerinin fraksiyonunun hesaplanmasına izin verir. Burada, bu protokol, negatif immün seleksiyon yoluyla adipositleri saflaştırmak ve pre-adiposit popülasyonunu zenginleştirmek için rafine teknikler de dahil olmak üzere, 2H metabolik etiketleme protokolü aracılığıyla insanlarda in vivo adipoz hücre döngüsü (adipogenez) oranlarını ölçme yöntemlerini açıklar14.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Pennington Biyomedikal Araştırma Merkezi'nin Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tüm prosedürleri onayladı (# 10039-PBRC) ve tüm insan denekler yazılı bilgilendirilmiş onay verdi.

1. Sekiz hafta 2H2O-etiketleme periyodu

  1. Steril plastik kaplarda% 70 veya% 99.9 döteryum etiketli su (2H2O) alikotlarını uygulayın.
  2. Katılımcılara% 99.9 zenginleştirilmiş 2H2O veya% 70 zenginleştirilmiş 2H2O 40 mL doz 35 mL doz içmelerini söyleyin 1. haftada (hazırlama dönemi) ve iki 35 mL veya 50 mL doz, 2-8 haftalarda günde sırasıyla.
    NOT: Geçici baş dönmesi veya baş dönmesi, 2H2O alımının bilinen tek olumsuz etkisidir ve iç kulağın kıl folikülleri tarafından algılanan toplu su akışındaki hızlı değişikliklerle ilgilidir. Bu nedenle, nadir görülen geçici baş dönmesi veya baş dönmesi15'in ortaya çıkmasını önlemek için katılımcılara dozları en az ~ 2 saat arayla almalarını söyleyin. Aynı nedenle, tek bir dozu ikiye katlayarak kaçırılan dozları telafi etmeyin. Dozun yukarıda tarif edildiği gibi uygulanması (≥2 saat ile ayrılmış), bu olumsuz etkiyi insan deneklerde son derece nadir görülür (birkaç yüz deneğin% <1'i).
  3. Vücut suyundaki 2H zenginleştirmeyi ölçmek için idrar toplama yoluyla 2H2O alımına uyumu ve ayrıca sayım için boş şişelerin haftalık dönüşünü izleyin.
    1. İdrar örneklerini aktif karbon ve bir filtre kullanarak temizleyin.
      1. 1 mL aktif kömür içeren 10 mL'lik bir tüpe 8 mL idrar ekleyin.
      2. Numuneyi 10 dakika boyunca bir külbütöre yerleştirin ve kömürün tüpün dibine hareket etmesi için 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Numuneyi 0,2 μm'lik bir şırınga filtresi ile filtreleyin.
    2. İzotop oranı kütle spektrometresi (IRMS) ile vücut suyundaki (idrar) 2H2O zenginleşmesini ölçün.
      NOT: 2H2O zenginleştirme, gaz kromatografisi-kütle spektrometresi16, IRMS17 ile birleştirilmiş yüksek sıcaklık dönüştürme element analizörü (TC/EA), boşluk halkalı kızılötesi spektroskopisi (IRIS)18 veya bir kütle spektrometresine (örneğin, IRMS)19 bağlı bir H/Cihazı dahil olmak üzere farklı yöntemlerle analiz edilebilir.
    3. Öncü 2H2O maruziyetini ve yeni sentezlenen AT hücrelerinin fraksiyonunu hesaplamak için 8 haftalık etiketleme periyodu boyunca idrarda ölçülen ortalama 2H2O zenginleştirmelerini kullanın (aşağıdaki bölüm 7 ve bölüm 8'e bakınız).

NOT: 2H2O etiketleme protokolü, 8 haftalık etiketleme süresi boyunca vücut suyunda% 1.0 -% 2.5 aralığında plato 2H zenginleştirmesini korur (Şekil 2) 10.

2. İnsan deneklerden yağ dokusu biyopsisi koleksiyonları

  1. Cildi povidon-iyot solüsyonu ile temizledikten sonra, topikal anestezi uygulayın (ör.% 2 lidokain /% 0.5 bupivakain), ciltte ~ 0.75 cm'lik bir kesi yapın ve steril koşullar altında iğne lipoaspirasyon tekniği ile deri altı AT biyopsileri toplayın13.
  2. 5 mL oda sıcaklığında (RT) 1 M HEPES tamponu, pH 7.3 içeren steril 50 mL'lik bir tüpü tartın. AT'yi işleme için hemen HEPES tamponu ile tüpe yerleştirin.
  3. AT'yi içeren 50 mL'lik tüpü tartın ve ağırlığı kaydedin.

3. Saflaştırılmış adipositlerin izolasyonu

  1. 2 g / mL AT'ye bir tip 1 kollajenaz / HEPES (2 mg / mL) çözeltisi ekleyin.
  2. AT'yi, birkaç büyük, sağlam AT parçası ile homojen bir karışım elde edene kadar 37 ° C'de 1 saat çalkalayarak (100 rpm) bir su banyosunda inkübe ederek sindirin.
  3. Adipositleri ve stromal-vasküler fraksiyonu (SVF) ayırmak için tüpü RT'de 8 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
  4. Üst yağ tabakasını (adipositler) yavaşça çıkarın ve ayrı bir tüpe aktarın. Tüpün altındaki peleti (SVF) bozmayın.
  5. Daha önce tarif edildiği gibi14, immünomanyetik hücre ayrımı kullanarak adipositleri saflaştırın.
    NOT: Hematopoietik, endotel ve kök hücreler dahil olmak üzere hızlı hücre döngüsüne sahip diğer hücre tipleri yüzen adipositlere yapışabileceğinden ve ölçümleri etkileyebileceğinden, bu önemli adım adipositleri "temizlemek" için yapılır.
    1. Negatif immüno-saflaştırma için ~ 400 μL adipositleri 5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
    2. FcR bloke edici antikor (100 μL/mL) ekleyin.
    3. Endotel hücrelerinin belirteçlerine karşı bir biyotinillenmiş antikor kokteyli ekleyin (anti-insan CD31; 1:100), hematopoietik hücreler (anti-insan CD45; 1:400) ve mezenkimal kök hücreler (anti-insan CD34; 1:100) RT'de 15 dakika boyunca adiposit çözeltisine.
    4. Adiposit çözeltisine bir biyotin seçim kokteyli (100 μL / mL) ekleyin, iyice karıştırın ve hafif eğme / döndürme ile RT'de 15 dakika inkübe edin.
    5. Manyetik nanopartikülleri yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın, partikülleri (50 μL / mL) adiposit çözeltisine ekleyin, iyice karıştırın ve hafif rotasyonla (10 rpm) RT'de 10 dakika inkübe edin.
    6. Toplam 1 mL hacim için adiposit çözeltisine PBS /% 2 FBS / 1 mM EDTA tamponu ekleyin.
    7. Tüpü mıknatısın içine yerleştirin ve 5 dakika bekletin.
    8. Mıknatısı alın ve sürekli bir hareketle, tüpü içeren mıknatısı ters çevirin ve içindekileri 5 mL'lik yeni bir tüpe dökün. Dökerken tüpe dokunmayın. Antikorlara bağlanan hücreler manyetik nanopartiküller tarafından bağlanır ve çıkarılırken, immüno-saflaştırılmış adipositler tutulur.
    9. Saflaştırılmış adipositleri sıvıN2 içinde hızlı dondurun ve DNA ekstraksiyonuna kadar -80 ° C'de saklayın.

4. Ön adipositlerin izolasyonu

  1. Zenginleştirilmiş bir pre-adiposit popülasyonunu izole etmek için, SVF20'nin kısa süreli bir kültüründen sonra plastiğe yapışma yeteneklerinden yararlanmak için bir protokol kullanın.
  2. Laminer akış başlığında, SVF peletini 5 mL eritrosit lizis tamponu içinde RT'de 5-10 dakika boyunca yeniden süspanse edin (iyice karıştırın) ve 800 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti alfa (α)MEM'de% 10 FBS'de yeniden süspanse edin.
  3. Hücreleri, 37 ° C'de ve% 5 CO2 atmosferinde bir doku kültürü inkübatöründe ~ 8-12 saat boyunca plastik bir kültür kabı üzerinde plakalayın.
  4. ~ 8-12 saat sonra, yapışmayan hücreleri kültür plakasından bir laminer akış başlığı içinde PBS ile nazikçe yıkayın.
  5. PBS'yi aspire ettikten sonra, yapışık hücreleri (zenginleştirilmiş pre-adiposit popülasyonu) ayırmak için kültür kabına 1-1.5 mL% 0.25 tripsin / 1 mM EDTA ekleyin. Hücrelerin kaldırılmasına yardımcı olmak için kültür kabını ~ 5-8 dakika boyunca 37 ° C'de inkübatöre yerleştirin.
  6. Plakaya% 10 FBS / αMEM ekleyin ve plakadaki tüm hücreleri toplamak için plakayı iyice yıkayın. Hücre çözeltisini 15 mL veya 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 8 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı çıkarın ve peleti (ön adipositler) DNA ekstraksiyonuna kadar -80 ° C'de saklayın.

5. Kan monositlerinin izolasyonu

NOT: Monositler, (neredeyse) tamamen çevrilmiş bir hücre popülasyonunu temsil edecek şekilde analiz edilir ve monositlerdeki 2H zenginleşmesinin ölçümü, her bireyde 2H2O maruziyetinin bir referans belirteci olarak kullanılabilir. Alternatif olarak, gövde 2H2O zenginleştirmesi ölçülebilir ve 2H2O maruziyetini hesaplamak için kullanılabilir.

  1. İnsan deneklerden alınan taze, tam kanı EDTA içeren vakum tüplerine alın.
  2. Kanı 1.000-2.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüj edin.
    NOT: Freni kullanmayın.
  3. Plazmanın üst tabakasını çıkarın. Plazmanın hemen altındaki beyaz kabarık kaplamaya dokunmamaya dikkat edin.
  4. Beyaz buffy ceketi bir transfer pipeti kullanarak aspire edin ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Buffy cekete ~ 10 mL PBS ekleyin.
  5. Buffy kaplamayı katmanlamak için yavaşça 10 mL yoğunluk gradyan ortamı ekleyin.
    NOT: Pipetin ucunun tüpün altına temas ettiğinden emin olun ve altta net bir yoğunluk gradyan ortamı tabakası olacak şekilde dikkatlice çıkarın. Baloncukları tanıtmaktan kaçının.
  6. Tüpü fren kapalıyken 30 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin.
  7. Beyaz tabakayı (mononükleer fraksiyon) pipetle boşaltın (~ 10 mL), transfer pipetinin ucu sınıra yakın ancak üst tabakaya değmeyecek şekilde dairesel hareketler yapın. 50 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve 10 mL PBS ekleyin. 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin (freni kullanmayın) ve süpernatanı atın.
  8. Pelete 5 mL eritrosit lizis tamponu ekleyin. Karıştırın ve RT'de 2 dakika bekletin.
  9. Eritrosit lizis tamponuna/pelet çözeltisine% 0.1 BSA ile 5 mL PBS ekleyin, 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
  10. İmmüno-manyetik boncuklar kullanarak monositleri CD14+ hücreleri olarak izole edin. Üreticinin protokolünü izleyerek CD14+ hücrelerinin izolasyonunu gerçekleştirin.
  11. İzole edilmiş monositleri DNA ekstraksiyonuna kadar -80 ° C'de saklayın.

6. DNA hazırlama (izolasyon, hidroliz ve türevlendirme)

  1. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak DNA'yı ön adipositlerden, adipositlerden ve kan monositlerinden izole edin.
  2. Deoksiribonükleozitleri serbest bırakmak için, DNA'yı (~ 200 μL) gece boyunca (en fazla 24 saat) 37 ° C'de 1 mL S1 nükleaz, 1 mL fosfataz enzimi ve 16 mm x 100 mm (10 mL) vidalı cam tüplerde 36.8 mL 5x hidroliz tamponu içeren 50 μL enzim hidroliz kokteylinde enzimatik olarak hidrolize edin. Ek olarak, aşağıdaki örnekleri ekleyin: bir su boşluğu, bir hidroliz kokteyli boşluğu, DNA ekstraksiyon kitinden boş bir sütun ve 500 ng DNA standardı.
    1. 5x hidroliz tamponunu hazırlamak için 94 mL moleküler biyoloji sınıfı saf suyu steril bir behere koyun. 3.08 g sodyum asetat ve 21.5 mg çinko sülfatı tartın, su ekleyin ve eriyene kadar karıştırın. Buzlu asetik asit ile pH'ı 5.0'a ayarlayın ve pH kağıdı kullanarak test edin. Toplam 100 mL hacme ulaşmak için su ekleyin.
    2. Fosfataz enzimini hazırlamak için, 1 mL saf su içinde bir şişe asit fosfatazı yeniden süspanse edin.
    3. 0.5 U / μL S1 nükleaz enzimini hazırlamak için, 2.5 μL S1 nükleazı 2 mL 1x hidroliz tamponuna seyreltin (4 mL saf suya 1 mL 5x hidroliz tamponu ekleyin).
  3. Hidrolizatları pentaflorobenzilhidroksilamin (PFBHA) türevlerine türevlendirin. Spesifik olarak, 16 mm x 100 mm (10 mL) vidalı kapaklı tüplerde, standartlar ve boşluklar dahil olmak üzere sindirilmiş DNA örneklerine doğrudan aşağıdakileri ekleyin: 100 μL pentaflorobenzil hidroksilamin hidroklorür (PFBHA; 1 mg / mL) ve 75 μL buzlu asetik asit. Vorteks (kısaca), şişeleri kapatın ve hidrolizat numunelerini 30 dakika boyunca 100 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğuna yerleştirin.
  4. Örnekleri çıkarın ve RT'ye kadar ~ 5 dakika soğumaya bırakın. Soğuduktan sonra, çeker ocak altındaki her tüpe 2 mL asetik anhidrit ve 100 μL 1-metilimidazol ekleyin. Tüpleri 5 dakika boyunca 100 ° C'lik bir ısı bloğuna ayarlayın.
  5. Örnekleri çıkarın ve ardından ~15-20 dakika soğumaya bırakın. Soğuduktan sonra, her numuneye 3 mL moleküler biyoloji sınıfı su ekleyin, kısa bir süre vorteksleyin ve 10 dakika bekletin.
  6. Tüplere 2 mL diklorometan (DCM) ekleyin ve türevi organik faza çıkarmak için numuneleri 15 saniye kuvvetlice girdaplayın.
  7. Fazları ayırmak için 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Alt diklorometan tabakasını dikkatlice temiz bir 1.6 mL GC şişesine aktarın.
    NOT: Arka planı artıracağı için sulu fazın hiçbirini aktarmayın.
  8. DCM'yi ve artık asetik asidi çıkarmak için nitrojen ile ~ 20 dakika kuruyana kadar buharlaştırın, ardından reaktiflerin tüm izlerini gidermek için RT'de hızlı bir vakumda ~ 10 dakika kurutun.

7. DNA'nın gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) analizi

  1. Kuruduktan sonra, PFBHA türevlerini 150 μL etil asetat içinde yeniden süspanse edin ve kapatın. Daha sonra, metan negatif kimyasal iyonizasyonu kullanarak bir DB-225 sütunu ile donatılmış bir gaz kromatografisi (GC)/kütle spektrometresi (MS) cihazında 2H'nin DNA'ya dahil edilmesini analiz edin ve iyonları seçici iyon izleme modunda m/z 435, m/z 436 ve m/z 437'de (M0, M1 veM2 kütle izotopomerlerini temsil eder, Sırasıyla). Kullanılan cihaz için üreticinin talimatlarına uyun.
    1. GC koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: sütun: 30 m x 0,25 mm İç çap x 0,25 μm film kaplama; kromatograf: 1.0 mL/dk sabit akışta helyum taşıyıcı gaz; darbeli bölünmez enjeksiyonlar; enjektör sıcaklığı: 250 °C; MS transfer hattı: 325 °C; fırın koşulları: başlangıç sıcaklığı 100 °C, 2 dakika tutun, 40 °C/dk'da 220 °C sıcaklığa kadar rampa, 7,5 dakika tutun, ikinci rampa 40 °C/dk'da 320 °C, 1 dakika tutun. Toplam çalışma süresi 16,0 dakikadır. Tipik dR elüsyon süreleri, birinci ve ikinci zirveler için sırasıyla 10.5 dakika ve 10.8 dakikadır.
    2. MS koşullarını aşağıdaki gibi ayarlayın: tek iyon izleme modunda algılamalı metan negatif kimyasal iyonizasyon kaynağı; dR için toplanan iyonlar: m/z 435, m/z 436 ve m/z 437 (sırasıyla M0, M1 veM2 kütle izotopomerlerini temsil eder).
      NOT: Açık cam astarı, astarın alt kısmında küçük bir silikonlu cam yünü tapası ile silisyonlaştırın. Bu astarı sık sık değiştirin (her ~ 100 enjeksiyonda bir).
  2. Zenginleştirilmemiş (doğal bolluk) dR türevindeki kütle izotopomer bolluğu M1 oranlarını aşağıdaki gibi hesaplayın:
    M1 oranı = M1 bolluğu/(M0, M1 ve M2 bolluklarının toplamı)
    Ardından, zenginleştirmeleri hesaplamak için etiketli numunelerin dR'sindeki M1 oranlarından doğal bolluk M1 oranlarını çıkarın (fazla izotop bollukları veya% EM1)21.
  3. Analiz edilen numunelerde M0 iyon bolluğu aralığını kapsayan bir M0 iyon bolluğu aralığı boyunca aynı anda temel (zenginleştirilmemiş) DNA standartlarının kütle izotopomer bolluklarını ölçün.
    NOT: Bu adım, GC/MS22 ile ölçülen izotop oranlarının "bolluk hassasiyetini" düzeltmek için gereklidir.
  4. M1 kütle izotopomeri için en doğru olan kolon üzerindeki numune konsantrasyonunu belirlemek için etiketlenmemiş standartlarda ölçülen kütle izotopomer M1 oranlarına karşı ölçülen M0 iyon bolluğunun bir grafiğini oluşturun (yani, bilinen, hesaplanan doğal bolluk M1 oranına en yakın olduğu yer veya "tatlı nokta"). Bu zenginleştirilmemiş dR türevi için M1 oranı 0.1669'dur.
  5. Deney numunelerini, M0 tepe bölgesinde bu "tatlı noktaya" mümkün olduğunca yakın olacak şekilde enjekte edin. Her numune için kendi belirli M1 konsantrasyonunda "düzeltilmiş doğal bolluk" M1 oranını tahmin etmek için zenginleştirilmemiş standartların M0 tepe alanına karşı M0 oranının ikinci dereceden bir regresyonunu kullanın. Doğal bolluğun veya %EM1'in üzerindeki zenginleştirme yüzdesini elde etmek için bunu yağ hücresi numunesi M1 oranından çıkarın (Şekil 3)23.
  6. Kütle izotopomer dağılım analizi (MIDA) denklemleri24 kullanarak yağ hücrelerinde teorikmaksimum M 1 zenginleştirmesini (EM1*) hesaplayın, vücut 2H2O maruziyetine (idrarda ölçülür) dayalı olarak 8 haftalık süre boyunca entegre edilmiştir (Şekil 4) veya ara ölçülen monosit zenginleştirmeleri (adım 7.5).

8. Yeni sentezlenen hücrelerin fraksiyonunun hesaplanması veya in vivo adipogenez

  1. Aşağıdaki formülü kullanarak, in vivo adipogenezin veya yeni sentezlenmiş pre-adipositlerin veya adipositlerin oluşumunun bir ölçüsü olan yeni hücrelerin fraksiyonunu (%) hesaplayın:
    Yeni hücrelerin fraksiyonu (%) = [(örnek [adipoz] hücrelerde M1 zenginleşmesi)/EM1 * (teorik maksimum M1 zenginleştirme)] x 100
    NOT: * Monositlerdeki 2H zenginleşmesi, denklemin paydası olarak da kullanılabilir. Monositlerdeki bu ölçüm, her bireyde 2H2O maruziyetinin bir referans hücre markörünü temsil eder ve ölçülen vücut 2H2O değerlerinden teorik maksimum M1zenginleştirme hesaplamalarını doğrulamak için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

2H2O etiketleme protokolü (bölüm 1), Şekil 2'degösterildiği gibi, 8 haftalık etiketleme periyodu 10 boyunca vücut suyunda%1.0 -% 2.5 aralığında plato 2 H zenginleştirmesini korur. Önceki bir çalışma, bölüm 2-8'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, 2 H'nin yağ hücrelerinin DNA'sına dahiledilmesi yoluyla yağ kinetiğini değerlendirmek için 2H2O etiketleme protokolünü kullanmış ve in vivo ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İn vivo değerlendirmeler, beyaz AT döngüsünün dinamikleri ve obezite ve ilgili metabolik hastalıklardaki rolü hakkında yeni bilgiler sağlamak için gereklidir, çünkü in vitro değerlendirmeler AT'nin doğal ortamını kapsamaz. Yağ dinamiklerini değerlendirmek için retrospektif radyokarbon tarihlemesinin kullanılması bilgilendirici olmasınarağmen 7,25, bu yaklaşım prospektif müdahale çalışmaları sırasında dinamik değ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Pennington Biyomedikal Araştırma Merkezi'ndeki Kütle Spektrometresi Çekirdeğine teşekkür ediyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-metilimidazolMilliporeSigma336092
2< / sup>H 2 < / sub>OSigma Aldrich
Asetik anhidritAldridge539996
ACK Parçalama Tamponu (eritrosit lizis tamponu)Quality Biological Inc (VWR)10128-802
Agilent 6890/5973 GC / MS & nbsp;Agilent
Anti-insan CD31 (PECAM-1) BiotinInvitrogen13-0319-82
Anti-insan CD34 BiotinInvitrogen13-0349-82
Anti-insan CD45BioLegend304004
Antibiyotik Antimikotik SolüsyonMilliporeSigmaA5955
Kollajenaz tip 1Worthington Biyokimyasal CorporationLS004196
Deoksiriboz (2-deoksi d-riboz)MilliporeSigma31170
Döteryum OksitMilliporeSigma756822
DB-225 sütunu (30m, 0.25mm, 0.25um)J& W Scientific122-2232
Diklorometan (DCM)MilliporeSigma34856
DNA standardı (buzağı timus DNA)MilliporeSigmaD4764
Dneasy Kan ve Doku Kiti (DNA ekstraksiyon kiti)Qiagen69504
Easy Sep İnsan Biyotin kitiKök Hücre Teknolojileri17663
EasySep İnsan CD14 Pozitif Seçim KokteylKök Hücre Teknolojileri18058C
Etil asetatFisherEX0241-1
Falcon 5 mL Yuvarlak Alt Polistiren Test TüpüVWR60819-295
Ficoll-Paque PlusMilliporeSigmaGE17-1440-02
GC şişeleri (2 mL)FisherC-4011-1W
GC şişe ekleriFisherC-4011-631; C-4012-530
Buzlu asetik asitFisherAC14893-0010
Cam tüpler (hidroliz için)Fisher14-959-35AA
HEPES tamponuThermoFisher15630080
Hyclone Su, moleküler biyoloji sınıfıThomas ScientificSH30538.02
MEM alfaFisher Scientific32561-037
PFBHA (o-(2, 3, 4, 5, 6)-penatflorobenzilhidroksilamin hidroklorür)MilliporeSigma194484
pH indikatör şeritleriFisher987618
Fosfataz asitCalbiochem (VWR)80602-592
S1 nükleaz (Aspergillus oryzae'den)MilliporeSigmaN5661
Sodyum sülfatMilliporeSigma23913

Kaynaklar

  1. Cypess, A. M. Reassessing human adipose tissue. The New England Journal of Medicine. 386 (8), 768-779 (2022).
  2. Cinti, S. The adipose organ at a glance. Disease Models & Mechanisms. 5 (5), 588-594 (2012).
  3. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  4. White, U., Ravussin, E. Dynamics of adipose tissue turnover in human metabolic health and disease. Diabetologia. 62 (1), 17-23 (2019).
  5. Danforth, E. Failure of adipocyte differentiation causes type II diabetes mellitus. Nature Genetics. 26 (1), 13(2000).
  6. Virtue, S., Vidal-Puig, A. Adipose tissue expandability, lipotoxicity and the metabolic syndrome--An allostatic perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1801 (3), 338-349 (2010).
  7. Arner, E., et al. Adipocyte turnover: relevance to human adipose tissue morphology. Diabetes. 59 (1), 105-109 (2010).
  8. Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
  9. Busch, R., Neese, R. A., Awada, M., Hayes, G. M., Hellerstein, M. K. Measurement of cell proliferation by heavy water labeling. Nature Protocols. 2 (12), 3045-3057 (2007).
  10. Neese, R. A., et al. Measurement in vivo of proliferation rates of slow turnover cells by 2H2O labeling of the deoxyribose moiety of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (24), 15345-15350 (2002).
  11. Strawford, A., Antelo, F., Christiansen, M., Hellerstein, M. K. Adipose tissue triglyceride turnover, de novo lipogenesis, and cell proliferation in humans measured with 2H2O. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 286 (4), E577-E588 (2004).
  12. Macallan, D. C., et al. Measurement of cell proliferation by labeling of DNA with stable isotope-labeled glucose: Studies in vitro, in animals, and in humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (2), 708-713 (1998).
  13. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Differences in in vivo cellular kinetics in abdominal and femoral subcutaneous adipose tissue in women. Diabetes. 65 (6), 1642-1647 (2016).
  14. Tchoukalova, Y. D., et al. In vivo adipogenesis in rats measured by cell kinetics in adipocytes and plastic-adherent stroma-vascular cells in response to high-fat diet and thiazolidinedione. Diabetes. 61 (1), 137-144 (2012).
  15. Jones, P. J., Leatherdale, S. T. Stable isotopes in clinical research: Safety reaffirmed. Clinical Science. 80 (4), 277-280 (1991).
  16. Bacchus-Souffan, C., et al. Relationship between CD4 T cell turnover, cellular differentiation and HIV persistence during ART. PLoS Pathogens. 17 (1), e1009214(2021).
  17. Simonato, M., et al. Disaturated-phosphatidylcholine and surfactant protein-B turnover in human acute lung injury and in control patients. Respiratory Research. 12 (1), 36(2011).
  18. Tremoy, G., et al. Measurements of water vapor isotope ratios with wavelength-scanned cavity ring-down spectroscopy technology: New insights and important caveats for deuterium excess measurements in tropical areas in comparison with isotope-ratio mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (23), 3469-3480 (2011).
  19. dos Santos, T. H. R., Zucchi, M. D., Lemaire, T. J., de Azevedo, A. E. G., Viola, D. N. A statistical analysis of IRMS and CRDS methods in isotopic ratios of H-2/H-1 and O-18/O-16 in water. Sn Applied Sciences. 1, 664(2019).
  20. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nature Protocols. 4 (1), 102-106 (2009).
  21. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic, and experimental considerations. The American Journal of Physiology. 276 (6), E1146-E1170 (1999).
  22. Patterson, B. W., Zhao, G., Klein, S. Improved accuracy and precision of gas chromatography/mass spectrometry measurements for metabolic tracers. Metabolism. 47 (6), 706-712 (1998).
  23. Mazzarello, A. N., Fitch, M., Hellerstein, M. K., Chiorazzi, N. Measurement of leukemic B-cell growth kinetics in patients with chronic lymphocytic leukemia. Methods in Molecular Biology. 1881, 129-151 (2019).
  24. Hellerstein, M. K., Neese, R. A. Mass isotopomer distribution analysis: A technique for measuring biosynthesis and turnover of polymers. The American Journal of Physiology. 263, E988-E1001 (1992).
  25. Spalding, K. L., et al. Dynamics of fat cell turnover in humans. Nature. 453 (7196), 783-787 (2008).
  26. Allerton, T. D., et al. Exercise reduced the formation of new adipocytes in the adipose tissue of mice in vivo. PLoS One. 16 (1), e0244804(2021).
  27. White, U. A., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Association of in vivo adipose tissue cellular kinetics with markers of metabolic health in humans. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 102 (7), 2171-2178 (2017).
  28. White, U., Fitch, M. D., Beyl, R. A., Hellerstein, M. K., Ravussin, E. Adipose depot-specific effects of 16 weeks of pioglitazone on in vivo adipogenesis in women with obesity: A randomised controlled trial. Diabetologia. 64 (1), 159-167 (2021).
  29. Steele, R. Influences of glucose loading and of injected insulin on hepatic glucose output. Annals of the New York Academy of Sciences. 82, 420-430 (1959).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

In Vivo EtiketlemeD teryum EtiketlemesiAdipoz Dola mBeyaz Adipoz DokuH cre Dola mAdipogenez l mnsan Ya MetabolizmasAdiposit Olu umuMetabolik Sa l k

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.