Yöntem makalesi

Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Hücre Analizi Kullanılarak Viral Enfeksiyon Üzerine İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücrelerindeki Değişikliklerin İzlenmesi

1.1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64887

⸱

5 Mayıs 2023

 ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) sistemi kullanarak viral enfeksiyon sırasında insan umbilikal ven endotel hücrelerindeki (HUVEC'ler) değişiklikleri izlemek için bir protokol açıklamaktadır.

Özet

Endotel hücreleri, tüm kan ve lenfatik damarların iç yüzeyini kaplayarak, kan veya lenf ile çevresindeki dokular arasında sıvı ve çözünen madde değişimini düzenleyen yarı geçirgen bir bariyer oluşturur. Bir virüsün endotel bariyerini geçme yeteneği, virüsün insan vücudunda yayılmasını kolaylaştıran önemli bir mekanizmadır. Birçok virüsün endotel geçirgenliğini değiştirdiği ve/veya enfeksiyon sırasında endotel hücre bariyerinin bozulmasına neden olduğu ve bunun da vasküler sızıntıya neden olabileceği bildirilmektedir. Bu çalışma, insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC'ler) Zika virüsü (ZIKV) enfeksiyonu sırasında endotel bütünlüğünü ve geçirgenlik değişikliklerini izlemek için ticari bir gerçek zamanlı hücre analizörü kullanan gerçek zamanlı bir hücre analizi (RTCA) protokolünü açıklamaktadır. ZIKV enfeksiyonu öncesi ve sonrası kaydedilen empedans sinyalleri hücre indeksi (CI) değerlerine çevrildi ve analiz edildi. RTCA protokolü, viral bir enfeksiyon sırasında hücre morfolojik değişiklikleri şeklinde geçici etkilerin saptanmasına izin verir. Bu test, diğer deney düzeneklerinde HUVEC'lerin vasküler bütünlüğündeki değişiklikleri incelemek için de yararlı olabilir.

Giriş

Endotel hücreleri (EC'ler) tüm kan ve lenfatik damarların iç yüzeyini kaplar. Kan veya lenf ile çevre dokulararasında yarı geçirgen bir bariyer oluşturan aderenler, sıkı boşluk bağlantıları ile bağlanırlar 1,2. Sağlam endotel hücre-hücre bağlantıları, karşılık gelen doku ve organların fizyolojik aktiviteleri için çok önemli olan makromoleküllerin, çözünen maddelerin ve sıvıların taşınmasını düzenlemek için kritik öneme sahiptir3. Endotel bariyeri dinamiktir ve spesifik uyaranlarlamodüle edilir 4. Endotel bariyeri fonksiyonunun bozulması veya kaybı, viral enfeksiyon 8,9,10,11 dahil olmak üzere birçok hastalığın5,6,7 patogenezinde akut ve kronik inflamasyonda hastalık patofizyolojisinin ayırt edici bir özelliğidir. Flavivirüsler için, yapısal olmayan protein NS1'in, örneğin katepsin L, sialidaz ve endoglikozidazheparinaz 9'un artan ekspresyonu ve aktivasyonunun bir sonucu olarak endotelyal glikokaliks benzeri tabakanın bozulması yoluyla endotel geçirgenliğini değiştirebileceği bulunmuştur. Hastalık durumunda, endotel tek tabakasının bütünlüğü etkilenir ve hücre-hücre bağlantıları bozulur, bu da endotel hasarına ve işlev bozukluğuna12 ve sonunda çoklu organ sistemlerinde yaygın patolojik belirtilereyol açabilir 13,14. EC'lerin viral enfeksiyonu, hücre sinyal yolaklarında ve hücresel gen ekspresyon profilinde sıvı bariyer fonksiyonlarını etkileyebilen, EC'lerin bozulmasına neden olabilen ve vasküler sızıntıya neden olabilen değişikliklere neden olur10,15. EC'lerin Zika virüsü (ZIKV) enfeksiyonunun, vasküler geçirgenlikte değişikliklere neden olan ve endotel bariyeri disfonksiyonuna yol açan ve vasküler sızıntıya neden olan eklem bütünlüğünü bozduğu bulunmuştur10,15. Çalışmalar, ZIKV'nin ciddi doğum kusurlarıyla bağlantılı olduğunu göstermiştir; Bununla birlikte, bunun gerçekleştiği kesin mekanizma hakkında pek bir şey bilinmemektedir 16,17. Bu nedenle, bir enfeksiyon sırasında endotel bariyeri değişikliklerini anlamak, hastalık mekanizmasını anlamak için kritik öneme sahiptir.

EC'ler şu anda çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçler için önemli bir deneysel in vitro vasküler model sistem olarak kullanılmaktadır 18,19,20,21. İnsan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC'ler), vasküler endotel ve vasküler biyolojiyi in vitroolarak incelemek için birincil, ölümsüzleştirilmemiş bir hücre sistemi olarak yaygın bir şekilde kullanılmıştır 22,23,24,25. HUVEC'ler ilk olarak 1970'lerin başında insan göbek kordonunun göbek damarından in vitro kültür için izole edildi26. HUVEC'ler, laboratuvarda kolayca çoğalması için yapılan parke taşı benzeri bir morfolojiye sahiptir. Birleşme durumunda uzun süre tutulduktan sonra kayma gerilmesi nedeniyle hücre şeklinin uzaması gözlenir. HUVEC'ler, Weibel ve Palade cisimciklerinin (WPB), pinositik veziküllerin, çekirdeğin yakınında bulunan az miktarda fibrillerin, nadiren dallanma gösteren tübüler şekilli mitokondrilerin, ince tanecikli yoğunlaştırılmış kromatin desenine sahip bir elipsoid çekirdeğin ve her çekirdekte bulunan bir ila üç nükleolün varlığı ile karakterize edilebilir27. HUVEC'ler çok sayıda morfolojik özellik göstermesine rağmen, HUVEC'lerin tanımlanması tek başına optik muayene ile sağlanamaz. Vasküler endotelyal (VE)-kaderinin immünofloresan boyaması gibi tahliller, HUVEC'lerde vasküler bütünlüğün izlenmesi için yaygın olarak kullanılır 28,29,30,31.

Bu çalışma, HUVEC'lerin enfeksiyonunun gerçek zamanlı hücre analizi (RTCA) protokolünü açıklamaktadır. RTCA sistemi, hücre bağlantısı için iletken bir yüzey sağlayan mikroelektrotlar içeren özel altın kaplı plakalar kullanır. Hücreler mikroelektrot yüzeyine yapıştığında, mikroelektrotlardan elektron akışını engelleyen bir bariyer oluşur. Mikroelektrotlar tarafından üretilen empedansın ölçümü, hücre ekleri, proliferasyon ve göç dahil olmak üzere bazı hücresel süreçler hakkında bilgi edinmek için kullanılabilir32. Rapor edilen test, gerçek zamanlı bir hücre analizörü ile birleştiğinde, canlı hücre proliferasyonunun, morfoloji değişikliklerinin (hücre küçülmesi gibi) ve hücre bağlanma kalitesinin noninvaziv ve etiketsiz bir şekilde sürekli ölçümünü sağlayan empedans tabanlı bir hücresel testtir. Bu çalışmada, ZIKV enfeksiyonu sırasında HUVEC'lerin endotel bütünlüğünü ve morfolojik değişikliklerini izlemek için gerçek zamanlı hücre analizörü kullanılmıştır. Kısaca cihaz, bir kültür ortamı (elektriksel olarak iletken çözelti) varlığında özel altın-mikroelektrot kaplı mikrotitre plakalarında iletilen elektron akışını ölçer. Hücre yapışması veya hücre sayısı ve morfolojisindeki değişiklikler elektron akışını bozar ve cihaz tarafından yakalanabilen empedans varyasyonlarına neden olur (Ek Şekil 1). ZIKV enfeksiyonundan önce ve sonra HUVEC büyümesi, proliferasyonu ve uyumu arasındaki fark, bir elektrik empedans sinyali ile gerçek zamanlı olarak kaydedilir ve daha sonra hücre indeksi (CI) değerine çevrilir. Enfeksiyon öncesinden alınan CI değeri, CI değeri normalleştirmesi için temel olarak kullanılır. CI değerlerindeki değişiklikler, enfeksiyon üzerine hücresel morfolojik değişiklikleri veya hücre aderans kaybını yansıtır33. Çalışma sonuçları, RTCA protokolünün, VE-kaderinin immünofloresan boyaması gibi bir son nokta testine kıyasla viral enfeksiyon sırasında geçici etkilerin veya hücre morfolojik değişikliklerinin saptanmasına izin verdiğini göstermektedir. RTCA yöntemi, diğer virüsler tarafından enfekte edildikten sonra HUVEC vasküler bütünlük değişikliklerini analiz etmek için yararlı olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre hazırlığı

  1. HUVEC'lerin Hazırlanması
    1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 12 mL endotel hücre ortamı (ECM) içeren 75cm2 (20 μg/mL kollajen tip 1 ile kaplanmış) hücre kültürü şişesinde 7,5 x 105 HUVEC hücresi/mL büyütün, HUVEC'lerin kültürü için gerekli büyüme faktörleri, hormonlar ve proteinleri içeren %0,01 endotel hücre büyüme takviyesi (EKGS), ve% 0.01 penisilin-streptomisin (P / S). Hücreleri bir hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de% 5 CO2 ile inkübe edin (Şekil 1).

2. RTCA deneyinin kurulumu

  1. RTCA'da çalışan direnç doğrulama
    1. Uygulamayı başlatmak için masaüstündeki RTCA yazılım simgesine çift tıklayın. Bir oturum açma penceresi görünecektir, oturum açmak için kullanıcı adını ve şifreyi yazın.
    2. Hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna A96 kuyucuğu içe bakacak şekilde 1 oyuklu bir RTCA direnç plakası yerleştirin.
    3. RTCA yazılımının Exp Notes (Deneyim Notları ) sekmesinde deney adını, cihaz SN'sini ve cihaz tipini (QC plakası) yazın.
    4. RTCA yazılımının Hücre sekmesi altındaki Düzen sekmesinde, tüm kuyuları vurgulayın ve tüm kuyuların açık olduğundan (gri) emin olmak için vurgulanan kuyulara sağ tıklayın.
    5. RTCA yazılımının Schedule (Zamanlama ) sekmesinde Step_1 tıklatın. Süpürme: 10 ve Aralık: 30 s'yi girin. Apply (Uygula) seçeneğini tıklayın. Doğrulama çalıştırmasını başlatmak için yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın.
      NOT: "Plaka Tarandı. Bağlantılar Tamam" sayfanın alt kısmında.
  2. Veri analizi için direnç doğrulama çalıştırması
    1. Hücre Dizini sekmesinde, çalıştırmanın tamamlanmasının ardından verileri kontrol edin. Tüm CI değerleri 0,063'ten küçük olmalıdır.
    2. Hücre Dizini sekmesinin alt kısmında, ham tarama verilerini kontrol edin. Ham tarama verileri, 40,0 ± 2,0 (A ve H satırları), 67,5 ± 2,5 (B ve G satırları), 93,6 ± 2,9 (C ve F satırları) ve 117,6 ± 3,2 (D ve E satırları) yinelenen değer desenleri göstermelidir.
    3. Doğrulama çalıştırmasını durdurmak için Plaka > Serbest Bırakma Plakası'na tıklayın. 96 kuyulu RTCA direnç plakası artık RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır.
  3. RTCA'da arka plan okuması elde etme
    1. Kollajen tip 1 kaplı özel altın-mikroelektrot plakasını (20 μg/mL kollajen tip 1 ile kaplanmış) 60 μL/kuyu Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS; sodyum bikarbonat ile, kalsiyum klorür ve magnezyum sülfat olmadan) 2x ile yıkayın.
    2. Kalan HBSS'yi atın ve 50 μL/kuyucuk ECM ekleyin. ECM içeren özel altın-mikroelektrot plakasını, A1 kuyusu içe bakacak şekilde hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna yerleştirin.
    3. RTCA yazılımının Exp Notes sekmesinde deney adını, cihaz SN'sini ve cihaz türünü (96 kuyucuklu format) yazın.
    4. RTCA yazılımının Hücre sekmesi altındaki Düzen sekmesinde, kullanılacak kuyuları vurgulayın ve tüm kuyuların açık olduğundan (gri) emin olmak için vurgulanan kuyulara sağ tıklayın.
    5. RTCA yazılımının Zamanlama sekmesinde, Step_1'ye tıklayın ve bir arka plan okuması elde etmek için yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın.
      NOT: "Plaka Tarandı. Bağlantılar Tamam" sayfanın alt kısmında.
    6. Arka plan okuması elde edildikten sonra, özel altın-mikroelektrot plakası artık hücre tohumlama için hazırdır ve RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır.
  4. Özel altın-mikroelektrot plakasında HUVEC hazırlığı
    1. HUVEC'leri özel altın-mikroelektrot plakasına 50 μL/kuyucuk şartlandırılmış ortam, 1 x 104 hücre/kuyucuk (şartlandırılmış ortam: %10 FBS, %0.01 EKGS ve %0.01 P/S ile desteklenmiş ECM) ile tohumlayın. %5 CO 2 ile 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe gece inkübasyonu için A1 kuyusu içe bakacak şekilde plakayı tekrar RTCA istasyonunayerleştirin.
      NOT: Bir hemositometre kullanılarak iki seyreltme faktörü ile hücre süspansiyonu üzerinde bir hücre sayımı yapıldı.
    2. Zamanlama sekmesinde, sol üst köşedeki Adım Ekle'ye tıklayın. Step_2'e tıklayın ve Süpürmeler: 601 ve Aralık: 2 dk'yı değiştirin. Step_2'e tıklayın ve yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın.
    3. 20 saatlik inkübasyondan sonra ve Kuyu Grafiği sekmesindeki CI değerleri bir plato gösterdiğinde, plaka enfeksiyona hazırdır. RTCA yazılımının Zamanlama sekmesinde Abort Step'i tıklatın.
    4. Özel altın-mikroelektrot plakası artık sonraki adımlar için RTCA istasyonundan çıkarılmaya hazırdır.

3. HUVEC'lerde viral enfeksiyon

  1. Virüs seyreltme
    1. ZIKV stok kültürü -80 °C'de tutulur. Bu çalışma için, kriyojenik şişelerde tutulan virüs stoğunu çıkarın ve 0,1 ve 1'lik çok sayıda enfeksiyon (MOI) elde etmek için ZIKV stoğunu 1,5 mL santrifüj tüplerinde serumsuz ECM ile seyreltin.
      NOT: ZIKV stoğu daha önce Vero hücrelerinde çoğaltma gerçekleştirilerek ve ZIKV süpernatantı34'ün hasat edilmesiyle hazırlanmıştı.
  2. Hücre tek tabakasının enfeksiyonu
    1. Her bir oyuktan şartlandırılmış ortamı (%10 FBS, %0.01 EKGS ve %0.01 P/S ile desteklenmiş ECM) çıkarın ve atın. Her birini 60 μL HBSS 2x ile iyice durulayın. HBSS'yi kuyu kenarının yardımıyla yerleştirin; Hücre tek tabakasını çekmeyin.
    2. En yüksekten en düşüğe doğru çalışarak, serumsuz ECM'de seyreltilmiş her virüs örneğinden 40 μL'yi kuyucuğa ekleyin. Her seyreltme için kuyucuğu üç katına çıkarın ve altı kuyuyu enfeksiyon olmadan koruyun (negatif kontrol ve pozitif kontrol trombin). Hücre tek tabakasını çekmeyin; Bunun yerine, seyreltilmiş virüsü kuyu kenarının yardımıyla ekleyin. Her yerleştirme için yeni bir pipet ucu kullanın.
      NOT: Trombin, HUVEC'lerin endotel geçirgenliğini hızla artırabildiği için pozitif kontrol olarak seçilmiştir.
    3. Virüs adsorpsiyonuna izin vermek için plakayı 37 ° C'de% 5 CO2 ile bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin. Hücre tek tabakası boyunca virüs adsorpsiyonuna izin vermek için plakayı her 15 dakikada bir 5 kez çevirin.
  3. Kaplama hücre kültürü ortamının eklenmesi
    1. 1 saatlik inkübasyondan sonra, virüs süspansiyonunu en düşük konsantrasyondan en yükseğe çıkarın ve atın.
    2. Enfekte olmuş hücreleri 60 μL HBSS 2x ile yıkayın. Kuyuyu% 2 FBS ile desteklenmiş ECM ile kaplayın. Pozitif kontrol kuyucukları için, trombini %2 FBS ile takviye edilmiş ECM ile 20 U/mL'ye seyreltin ve oyukları trombin içeren ECM ortamı ile kaplayın. Hücre tek tabakasını çekmeyin; Bunun yerine, kuyu kenarının yardımıyla bindirme ortamı ekleyin.
  4. Enfekte olmuş özel altın-mikroelektrot plakasının RTCA istasyonuna geri yerleştirilmesi
    1. Zamanlama sekmesinde, sol üst köşedeki Adım Ekle'ye tıklayın. Step_3'e tıklayın ve Süpürmeler: 3.601 ve Aralık: 2 dk. Uygula'yı tıklayın.
    2. Görüntülenen açılır pencerede Tamam'a tıklayın. Enfekte olmuş özel altın-mikroelektrot plakasını, A1 kuyusu içe bakacak şekilde hücre kültürü inkübatöründe bulunan RTCA istasyonuna yerleştirin.
    3. Step_3'ye tıklayın ve yazılımın sol üst köşesindeki Başlat/Devam Et'e tıklayın.

4. Veri analizi ve verilerin dışa aktarılması

  1. Her kuyucuğun deneysel bilgilerinin eklenmesi
    1. Düzen sekmesinde, Hücre sekmesini tıklatın (Şekil 2A). Hedef hücre bilgilerini girmek ve her kuyu için kuyu tipini belirlemek için kuyuyu vurgulayın ve yazılımın altındaki hedef hücre adını, numarasını ve rengini yazın. Apply (Uygula) öğesine tıklayın (Şekil 2B).
    2. Hücre sekmesinde her bir kuyu için kuyu tipini seçmek ve belirlemek için, kuyu tipini vurgulayın, kuyu tipini (örnek, pozitif kontrol veya negatif kontrol) seçin ve Ayarla'yı tıklatın.
    3. Düzen sekmesinde, Tedavi sekmesine tıklayın (Şekil 2C). Tedavi bilgilerini girmek için, kuyuyu ve tedavi adını, tedavi konsantrasyonunu, üniteyi ve rengi vurgulayın. Apply (Uygula) (Uygula) düğmesini tıklatın (Şekil 2D).
    4. Tedavi sekmesinde her kuyu için kuyu tipini seçmek ve belirlemek için kuyuyu vurgulayın, kuyu tipini seçin (örnek, pozitif kontrol veya negatif kontrol) ve Ayarla'ya tıklayın.
      NOT: Her seçim için aynı anda birden fazla kuyu vurgulanabilir.
  2. CI değerinin normalleştirilmesi
    1. Veri analizi sekmesinin sağına sağ tıklayın ve Y Ekseni açılır kutusundan Normalleştirilmiş Hücre Dizini'ni seçin (Şekil 3A). Alttaki X Ekseni bölümünde, özel altın-mikroelektrot plakasının enfeksiyon nedeniyle çıkarıldığı son ölçülen zaman noktası olarak normalleştirilmiş zamanı seçin (Şekil 3B).
      NOT: Yazılım tarafından gerçekleştirilen normalleştirme işlemi, seçilen normalizasyon noktası virüs ve/veya tedavinin eklenmesinden önce olduğu sürece, kuyu tohumlama ve bağlanmadaki farklılıklardan kaynaklanan değişkenliğin çoğunu ortadan kaldırır. Bu nedenle, optimal normalizasyon zaman noktası, virüs ve/veya tedavi ilavesinden önceki son zaman noktası olmalıdır. Normalleştirilecek zaman noktası, Step_2 altındaki Zamanlama sekmesinden kontrol edilebilir. Belirtilen toplam süre, normalleştirilecek zaman noktasıdır (Şekil 3C).
  3. RTCA yazılımı kullanılarak elde edilen verilerin grafiği
    1. Veri analizi sekmesinde, kuyucukları vurgulayarak ve Ekle'<< tıklayarak grafiğe eklenecek kuyuları seçin. Zaman grafiğine göre normalleştirilmiş hücre dizini artık kopyalanmaya ve dışa aktarılmaya hazırdır. Ortalama onay kutusunu işaretlediğinizden emin olun.
  4. RTCA yazılımını kullanarak verileri dışa aktarma
    1. RTCA yazılımının sol üst köşesinde, Plaka > Deney Bilgilerini Dışa Aktar...'a tıklayın. Dışa aktarılacak verileri seçmek için kutuyu işaretleyin. Tamam'a tıklayın.
      NOT: Ham veriler (ham CI değerleri), Hücre dizini > Tümü işaretlendiğinde dışa aktarılabilir.
    2. Dışa aktarma dosyasının kaydedileceği klasörü seçin. KAYDET'e tıklayın. Deneysel bilgilerin dışa aktarıldığını gösteren bir açılır pencere görünecektir. Dışa aktarma işlemi tamamlandıktan sonra, dışa aktarılan deneme bilgilerinin görüntülenmeye hazır olduğunu belirten başka bir pencere açılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

ZIKV enfeksiyonundan önce, özel bir altın-mikroelektrot kaplı mikrotitre plakası üzerinde kültürlenen HUVEC tek tabakası için kaydedilen CI, 8'in üzerindeydi ve bu da güçlü yapışma özelliklerini düşündürüyordu. CI indeksi 8'den az olan plakalar veya oyuklar atılmalıdır. HUVEC'ler daha sonra 0.1 ve 1'lik bir MOI'de ZIKV ile enfekte edildi ve hücre empedansı 7 gün boyunca kaydedildi. ZIKV P6-740 ile enfekte olmuş HUVEC'lerin CI değeri, 0.1'lik bir MOI'de (açık mavi çizgi), negatif enfeksiyon kontrolüne (kahverengi çizgi; <...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İzin verilen hücrelerde sitosidal viral enfeksiyon genellikle hücre morfolojisi ve biyosentezindeki önemli değişikliklerle ilişkilidir36. Hücre küçülmesi, hücre büyümesi ve/veya sinsitya oluşumu gibi virüsün neden olduğu hücresel morfolojik değişiklikler, bazı viral enfeksiyonlara özgü sitopatik etkiler (CPE'ler) olarak da bilinir37. EC'lerde CPE, hücrelerin yıkımı ve her bir EC arasındaki sıkı bağlantıların bozulması olarak tanımlandı, bu nedenle endotel bariyerinin

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu araştırma, Malezya Yüksek Öğrenim Bakanlığı'ndan Yüksek Kurum Mükemmeliyet Merkezi (HICoE) programı (MO002-2019) kapsamında destek ve Uzun Vadeli Araştırma Hibe Programı (LRGS MRUN Faz 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) kapsamında fon almıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL mikrosantrifüj tüpüYuva615601
37 derece; % 5 CO2 içeren C inkübatörüSanyoMCO-18AIC
75 cm2< / sup> doku kültürü şişesi Corning430725U
Antibiyotik çözeltisi penisilin-streptomisin (P / S)Sciencell0503
Biyolojik güvenlik kabini, Sınıf IIHoltenHB2448
Kollajen Tip 1SIgma-AldrichC3867
Endotel hücre büyüme takviyesi (EKGS)Sciencell1052
Endotel hücre ortamı (ECM)Sciencell1001
E-plaka 96Agilent Teknolojileri, Inc.
Fetal sığır serumu (FBS)Sciencell0025
Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Sigma-AldrichH9394
HemositometreLaboroptik LTDNeubauer İnsan
8000
Ters mikroskopZEISSTELAVAL 31
Latitude 3520 Dizüstü BilgisayarDell -
Çok kanallı mikropipet (10 - 100 & mikro; L)Eppendorf3125000036
Çok kanallı mikropipet (30 - 300 & mikro; L)Eppendorf3125000052
Reaktif tutucuTarsonsT38-524090
RTCA direnç plakası 96Agilent Technologies, Inc.
RTCA Software Pro (Sürüm 2.6.1)Agilent Technologies, Inc.
Tek kanallı pipetler (10 - 100 & mikro; L)Eppendorf3123000047
Tek kanallı pipetler (100 - 1000 & mikro; L)Eppendorf3123000063
Tek kanallı pipetler (20 - 200 & mikro; L)Eppendorf3123000055
xCELLigence Gerçek zamanlı hücre analizörü SP (Model: W380)Agilent Technologies, Inc.00380601030https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232
05232368001 Umbilikal Ven Endotel Hücrelerini (HUVEC'ler) geliştirdiSciencell 052323500015454433001

Kaynaklar

  1. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
  2. Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-340 (2000).
  3. Stevens, T., Garcia, J. G., Shasby, D. M., Bhattacharya, J., Malik, A. B. Mechanisms regulating endothelial cell barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (3), L419-L422 (2000).
  4. Wu, M. H. Endothelial focal adhesions and barrier function. The Journal of Physiology. 569, 359-366 (2005).
  5. Boueiz, A., Hassoun, P. M. Regulation of endothelial barrier function by reactive oxygen and nitrogen species). Microvascular Research. 77 (1), 26-34 (2009).
  6. Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. Endothelial cells in emerging viral infections. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 619690(2021).
  7. Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. International Journal of Biological Sciences. 9 (10), 1057-1069 (2013).
  8. Iyer, S., Ferreri, D. M., DeCocco, N. C., Minnear, F. L., Vincent, P. A. VE-cadherin-p120 interaction is required for maintenance of endothelial barrier function. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (6), L1143-L1153 (2004).
  9. Puerta-Guardo, H., et al. Flavivirus NS1 triggers tissue-specific vascular endothelial dysfunction reflecting disease tropism. Cell Reports. 26 (6), 1598-1613 (2019).
  10. Rastogi, M., Singh, S. K. Zika virus NS1 affects the junctional integrity of human brain microvascular endothelial cells. Biochimie. 176, 52-61 (2020).
  11. Soe, H. J., et al. High dengue virus load differentially modulates human microvascular endothelial barrier function during early infection. Journal of General Virology. 98 (12), 2993-3007 (2017).
  12. Krouwer, V. J., Hekking, L. H. P., Langelaar-Makkinje, M., Regan-Klapisz, E., Post, J. A. Endothelial cell senescence is associated with disrupted cell-cell junctions and increased monolayer permeability. Vascular Cell. 4 (1), 12(2012).
  13. Aird, W. C. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 101 (10), 3765-3777 (2003).
  14. Bryce, C., et al. Pathophysiology of SARS-CoV-2: targeting of endothelial cells renders a complex disease with thrombotic microangiopathy and aberrant immune response. The Mount Sinai COVID-19 autopsy experience. MedRxiv. , (2020).
  15. Khaiboullina, S., et al. Transcriptome profiling reveals pro-inflammatory cytokines and matrix metalloproteinase activation in Zika virus infected human umbilical vein endothelial cells. Frontiers in Pharmacology. 10, 642(2019).
  16. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. The Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  17. Sarno, M., et al. Zika virus infection and stillbirths: a case of hydrops fetalis, hydranencephaly and fetal demise. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (2), e0004517(2016).
  18. Dalrymple, N. A., Mackow, E. R. Virus interactions with endothelial cell receptors: implications for viral pathogenesis. Current Opinion in Virology. 7, 134-140 (2014).
  19. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (1), 64-75 (2014).
  20. Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212 (1), 173-179 (2013).
  21. Vozzi, F., Bianchi, F., Ahluwalia, A., Domenici, C. Hydrostatic pressure and shear stress affect endothelin-1 and nitric oxide release by endothelial cells in bioreactors. Biotechnology Journal. 9 (1), 146-154 (2014).
  22. Gallinat, A., Badimon, L. DJ-1 interacts with the ectopic ATP-synthase in endothelial cells during acute ischemia and reperfusion. Scientific Reports. 12 (1), 12753(2022).
  23. Jiménez, N., Krouwer, V. J. D., Post, J. A. A new, rapid and reproducible method to obtain high quality endothelium in vitro. Cytotechnology. 65 (1), 1-14 (2013).
  24. Latifi-Navid, H., et al. Network analysis and the impact of Aflibercept on specific mediators of angiogenesis in HUVEC cells. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (17), 8285-8299 (2021).
  25. Poulet, M., et al. PRL-2 phosphatase is required for vascular morphogenesis and angiogenic signaling. Communications Biology. 3 (1), 603(2020).
  26. Laurens, N., van Hinsbergh, V. W. Isolation, purification and culture of human micro- and macrovascular endothelial cells. Methods in Endothelial Cell Biology. , Springer. 3-13 (2004).
  27. Haudenschild, C. C., Zahniser, D., Folkman, J., Klagsbrun, M. Human vascular endothelial cells in culture: lack of response to serum growth factors. Experimental Cell Research. 98 (1), 175-183 (1976).
  28. Cenni, E., Perut, F., Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacologica Sinica. 32 (1), 21-30 (2011).
  29. Lau, S., Gossen, M., Lendlein, A., Jung, F. Venous and arterial endothelial cells from human umbilical cords: potential cell sources for cardiovascular research. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 978(2021).
  30. Marquez-Curtis, L. A., Sultani, A. B., McGann, L. E., Elliott, J. A. W. Beyond membrane integrity: Assessing the functionality of human umbilical vein endothelial cells after cryopreservation. Cryobiology. 72 (3), 183-190 (2016).
  31. Park, H. -J., et al. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Reviews. 2 (2), 93-102 (2006).
  32. Dowling, C. M., Herranz Ors, C., Kiely, P. A. Using real-time impedance-based assays to monitor the effects of fibroblast-derived media on the adhesion, proliferation, migration and invasion of colon cancer cells. Bioscience Reports. 34 (4), e00126(2014).
  33. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  34. Tan, J. Y., Wong, J. E., Zainal, N., AbuBakar, S., Tan, K. K. Virus propagation and cell-based colorimetric quantification. Journal of Visualized Experiments. , (2023).
  35. Kustermann, S., et al. A real-time impedance-based screening assay for drug-induced vascular leakage. Toxicological Sciences. 138 (2), 333-343 (2014).
  36. Albrecht, T., Fons, M., Boldogh, I., Rabson, A. S. Effects on cells. Medical Microbiology. 4th Edition. , (1996).
  37. Hematian, A., et al. Traditional and modern cell culture in virus diagnosis. Osong Public Health and Research Perspectives. 7 (2), 77-82 (2016).
  38. Friedman, H. M. Infection of endothelial cells by common human viruses. Reviews of Infectious Diseases. 11, S700-S704 (1989).
  39. Friedman, H. M., Macarak, E. J., MacGregor, R. R., Wolfe, J., Kefalides, N. A. Virus infection of endothelial cells. The Journal of Infectious Diseases. 143 (2), 266-273 (1981).
  40. Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  41. Marlina, S., Shu, M. -H., AbuBakar, S., Zandi, K. Development of a Real-Time Cell Analysing (RTCA) method as a fast and accurate screen for the selection of chikungunya virus replication inhibitors. Parasites & Vectors. 8, 579(2015).
  42. Liu, S., DeLalio, L. J., Isakson, B. E., Wang, T. T. AXL-mediated productive infection of human endothelial cells by Zika virus. Circulation Research. 119 (11), 1183-1189 (2016).
  43. Souf, S. Recent advances in diagnostic testing for viral infections. Bioscience Horizons: The International Journal of Student Research. 9, (2016).
  44. Sun, M., et al. A dynamic real-time method for monitoring epithelial barrier function in vitro. Analytical Biochemistry. 425 (2), 96-103 (2012).
  45. Stefanowicz-Hajduk, J., Ochocka, J. R. Real-time cell analysis system in cytotoxicity applications: Usefulness and comparison with tetrazolium salt assays. Toxicology Reports. 7, 335-344 (2020).
  46. Kho, D., et al. Application of xCELLigence RTCA biosensor technology for revealing the profile and window of drug responsiveness in real time. Biosensors. 5 (2), 199-222 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Empedans zlemeZika Vir s EnfeksiyonuH cre ndeksiVask ler Ge irgenlikMorfolojik De i ikliklerRTCA Protokol

İlgili makaleler