Yöntem makalesi

Protein Yapısı Tayini için Cryo-EM Analizinde Son Gelişmeler ve En İyi Uygulamalar

2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64907

⸱

10 Şubat 2023

 , 
1Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, King’s College London, 2Bio Structure and Biophysics (BSB), Sanofi

Bu makalede

Özet

TARTIŞILAN MAKALELER:

de Martin Garrido, N., Ramlaul, K., Aylett, C. H. S. Bir destek yüzdürme bloğu kullanılarak transmisyon elektron mikroskobunda örnek destek filmlerinin hazırlanması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (170), doi:10.3791/62321 (2021).

Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. Zamanla çözülen kriyo-elektron mikroskobu için hızlı ızgara hazırlığı. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (177), doi:10.3791/62199 (2021).

Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Yeni bir robotik sistem olan Spotiton kullanılarak zaman çözümlü çalışmalar için kriyo-elektron mikroskobik ızgara hazırlığı. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (168), doi:10.3791/62271 (2021).

Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A., Jr. Tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskobu için biyolojik örneklerin manuel leke ve daldırma dondurması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (180), doi:10.3791/62765 (2022).

Martynowycz, M. W., Gonen, T. Küçük moleküllerin mikrokristal elektron kırınımı. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (169), doi:10.3791/62313 (2021).

Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Fleck, R. A. Kriyo-elektron tomografisi için çift ışınlı taramalı elektron mikroskobu kullanarak camsı biyolojik örneklerden lamel hazırlama. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (174), doi:10.3791/62350 (2021).

Wypych, D., Kierecki, D., Golebiowski, F. M., Rohou, A. gP2S, CryoEM deneyleri için bir bilgi yönetim sistemi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (172), doi:10.3791/62377 (2021).

Editöryal

Doğrudan elektron dedektörlerinin ortaya çıkmasından ve yazılım ve donanımın geliştirilmesinden bu yana, kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM), araştırmacıların makromoleküllerin yapısını atomik ayrıntılara yakın 1,2'ye kadar belirlemelerine rutin olarak izin veren bir teknik haline geldi. Bu hızlanma, numune hazırlamadan veri toplama ve işlemeye kadar son derece hızlı tempolu bir dizi yeni gelişme tarafından katalize edilmiştir. Bu tekniğin uzman olmayanlar için geniş bir demokratikleşmesine izin vermek için daha verimli ve erişilebilir boru hatları oluşturulmuştur. Çarpıcı bir şekilde, "çözünürlük devriminden" 10 yıldan kısa bir süre sonra, kriyo-EM hem akademide hem de endüstride protein karakterizasyonu için temel bir teknik haline geldi 3,4.

Kriyo-EM araştırma topluluğunun en dikkat çekici yönlerinden biri, protokolleri, stratejileri ve yazılımları açıkça paylaşma isteği olmuştur5. Teknolojinin ve uzmanlığın bu açıklığı, gelişimin çok hızlı temposuna önemli ölçüde katkıda bulundu, ancak bazı darboğazlar bunun tam olarak erişilebilir olmasını engellemeye devam ediyor. Bu yöntem koleksiyonunda, veri analizi donanımına erişimle birlikte birçok proje için en büyük darboğaz olan kriyo-EM ile yapısal analize uygun ızgaraların hazırlanmasındaki son gelişmelerden bazılarını açıklamayı amaçlıyoruz. Ayrıca, kriyo-EM analizlerinde yeni yaklaşımlar için bu alanda şu anda geliştirilmekte olan yeni protokolleri de tartışıyoruz.

Yukarıda belirtildiği gibi, kriyo-EM'nin laboratuvarda rutin uygulaması için mevcut darboğazlardan biri numune hazırlamadır. Izgaralara numune uygulama düzeyinde çeşitli sorunlarla karşılaşılabilir: en yaygın olarak, numunenin buzda tercih edilen oryantasyonu ve hava-su arayüzünde denatürasyonu. Numuneyi hava-su arayüzünden korumak, numunenin hava ile temas etmesini fiziksel olarak önleyen karbon veya grafen destek filmleri kullanarak bu soruna bir çözümdür. İnce filmlerin ızgaralara uygulanmasını kolaylaştırmak için de Martin Garrido ve ark.6 , küçük su damlalarının ve numunenin kontrollü bir şekilde uygulanmasına izin veren bir 3D yazıcı tarafından üretilen bir destek yüzdürme bloğu geliştirmiştir. Bu blok kullanılarak grafen ve karbon katmanları ucuz ve kullanıcı dostu bir şekilde biriktirilir.

Hava-su arayüzündeki hasarı önlemenin bir başka yolu da proteinin atmosfere maruz kalma süresini sınırlamaktır. Bunun için Klebs ve ark.7 ve Budell ve ark.8 tarafından geliştirilen iki farklı araç, hızlı (10 ms kadar düşük) ızgara hazırlığı için yeni yaklaşımlar kullanmakta ve partikül oryantasyonu ile ilgili sorun olasılığını azaltmaktadır. Bu cihazların bir diğer avantajı, yapısal çalışmalar için heyecan verici yeni bir sınır olan zaman çözümlü deneyler yapma olasılığıdır.

Zıt bir yaklaşımla, Nguyen ve ark.9 , yapımı çok maliyetli veya zor olan ticari veya ısmarlama cihazların yokluğunda kriyo-EM analizi için ızgaraları dondurmak için bir yöntem bildirmiştir. Kriyo-EM'nin demokratikleşmesine katkıda bulunan, pahalı enstrümantasyon gerektirmeyen ucuz, ev yapımı bir cihaz kullanılarak benzer kalitede ızgaraların nasıl elde edilebileceğini gösteriyorlar.

Kriyo-EM'de, ilgilenilen örnek her zaman bir protein değildir, bunun yerine küçük bir molekül veya bütün bir hücre gibi büyük bir biyolojik sistem olabilir. Bu tür örneklerin hazırlanması benzersizdir ve veri toplamada farklı stratejilerin yanı sıra belirli adımlar gerektirir.

Mikrokristal elektron kırınımı (MicroED) için incelenecek numune, genellikle toz formunda bulunan küçük bir kimyasaldır. Toz, kristal formu korumak için doğrudan EM ızgarasına uygulanır. Veri toplama daha sonra Martynowycz ve Gonen10 tarafından gösterildiği gibi kırınım modunda gerçekleştirilir. Buna karşılık, tüm hücreler kriyo-EM analizi için çok kalındır. Bunu ele almak için, Bisson ve ark. yapısal çalışmalara uygun ince kesitler elde etmek için böyle bir numuneyi fiziksel olarak delmek için bir SEM kullanma yöntemini rapor etmektedir11.

Numuneden yapıya, protein konsantrasyonundan mikroskop ayarlarına ve veri analizine kadar her protein numunesi için birçok parametre değiştirildiğinden, sürecin her adımı için bir kayıt tutmak önemlidir. Bu amaçla Wypych ve ark.12 , kullanıcıların iş akışlarını düzenlemelerine ve gelecekteki yayınlar için ihtiyaç duyulan tüm ayrıntıları takip etmelerine olanak tanıyan web tabanlı bir bilgi yönetim aracı geliştirmişlerdir. Otomasyon, kriyo-EM'de, özellikle de endüstri ortamlarında giderek daha yaygın hale geldiğinden, bu özellikle kritik öneme sahiptir.

Cryo-EM, son on yılda hem donanım hem de yazılım cephelerinde olağanüstü bir hızla ilerledi. En iyi uygulamaların yaygın olarak yayılmasını ve yeni yöntemlerin geniş çapta benimsenmesini sağlamak için şeffaf bir protokol seti gereklidir. Bu özel sayı bu çabaya katkıda bulunacaktır.

Teşekkürler

JB, BBSRC (BB/R009759/2) ve HFSP'den (RGY0080/2021) fon sağladığını kabul eder.

Kaynaklar

  1. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  2. Smith, M. T. J., Rubinstein, J. L. Beyond blob-ology. Science. 345 (6197), 617-619 (2014).
  3. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. 91, 1-32 (2022).
  4. Wigge, C., Stefanovic, A., Radjainia, M. The rapidly evolving role of cryo-EM in drug design. Drug Discovery Today. Technologies. 38, 91-102 (2020).
  5. Tachibana, C. Democratizing cryo-EM: Broadening access to an expanding field. Science. 367 (6484), 1394(2020).
  6. de Martin Garrido, N., Ramlaul, K., Aylett, C. H. S. Preparation of sample support films in transmission electron microscopy using a support floatation block. Journal of Visualized Experiments. (170), e62321(2021).
  7. Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. Fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (177), e62199(2021).
  8. Budell, W. C., Allegri, L., Dandey, V., Potter, C. S., Carragher, B. Cryo-Electron microscopic grid preparation for time-resolved studies using a novel robotic system, Spotiton. Journal of Visualized Experiments. (168), e62271(2021).
  9. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765(2022).
  10. Martynowycz, M. W., Gonen, T. Microcrystal electron diffraction of small molecules. Journal of Visualized Experiments. (169), e62313(2021).
  11. Bisson, C., Hecksel, C. W., Gilchrist, J. B., Fleck, R. A. Preparing lamellae from vitreous biological samples using a dual-beam scanning electron microscope for cryo-electron tomography. Journal of Visualized Experiments. (174), e62350(2021).
  12. Wypych, D., Kierecki, D., Golebiowski, F. M., Rohou, A. gP2S, an information management system for CryoEM experiments. Journal of Visualized Experiments. (172), e62377(2021).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Cryogenic Electron MicroscopySample Support FilmsGrid PreparationTime-resolved Cryo-electron MicroscopyRobotic SystemManual Blot-and-plunge FreezingMicrocrystal Electron DiffractionCryo-electron TomographyInformation Management SystemBiological Specimens
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.