Yöntem makalesi

Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi

DOI:

10.3791/64913

⸱

7 Nisan 2023

 ,  ,  , 
1Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek verimli scRNA-seq yöntemlerinin fizibilitesi ve etkinliği, bitki araştırmalarında tek hücreli bir çağın habercisidir. Burada, spesifik Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerinin izole edilmesi ve ardından transkriptom kütüphanesi yapımı ve analizi için sağlam ve eksiksiz bir prosedür sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çok hücreli organizmalarda, gelişimsel programlama ve çevresel tepkiler, farklı hücre tiplerinde ve hatta hücresel heterojenite olarak bilinen hücreler içinde oldukça farklı olabilir. Son yıllarda, yeni nesil dizileme (NGS) teknikleriyle birleştirilen tek hücreli ve hücre tipi izolasyon, biyolojik süreçleri tek hücreli çözünürlükte incelemek için önemli araçlar haline gelmiştir. Bununla birlikte, bitki hücrelerinin izole edilmesi, bitkilerde tek hücreli yaklaşımların uygulanmasını sınırlayan bitki hücre duvarlarının varlığı nedeniyle nispeten daha zordur. Bu protokol, aşağı akış multi-omik analizi ve diğer çalışmalar için uygun olan, bitki hücreleri ile floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) tabanlı tek hücreli ve hücre tipi izolasyon için sağlam bir prosedürü açıklamaktadır. Arabidopsis kök floresan işaretleyici çizgilerini kullanarak, ksilem-kutup perisiklus hücreleri, lateral kök başlangıç hücreleri, lateral kök kapak hücreleri, korteks hücreleri ve endodermal hücreler gibi belirli hücre tiplerinin nasıl izole edildiğini gösteriyoruz. Ayrıca, Smart-seq2 kullanan etkili bir aşağı akış transkriptom analiz yöntemi de sağlanmaktadır. Hücre izolasyon yöntemi ve transkriptom analiz teknikleri, diğer hücre tiplerine ve bitki türlerine uyarlanabilir ve bitki biliminde geniş uygulama potansiyeline sahiptir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler tüm canlı organizmaların temel birimidir ve yapısal ve fizyolojik işlevleri yerine getirir. Çok hücreli organizmalardaki hücreler belirgin bir eşzamanlılık göstermesine rağmen, farklı tipteki hücreler ve bireysel hücreler, gelişim ve çevresel tepkiler sırasında transkriptomlarında farklılıklar gösterir. Yüksek verimli tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), hücresel heterojenliği anlamak için benzeri görülmemiş bir güç sağlar. ScRNA-seq'in bitki bilimlerinde uygulanması, bir bitki hücresi atlası1'in başarılı bir şekilde oluşturulmasına katkıda bulunmuş, bitki dokularındaki nadir hücresel taksonları tanımlamak için kullanılmıştır2, bitki dokularındaki hücre tiplerinin bileşimi hakkında fikir vermiş ve hücresel kimliği ve bitki gelişimi ve farklılaşması sırasında kullanılan önemli işlevleri tanımlamak için kullanılmıştır. Ek olarak, yeni belirteç genleri keşfetmek için bitki dokularındaki uzaysal zamansal gelişimsel yörüngeleri çıkarmak mümkündür 1,2,3 4 ve farklı bitkilerde aynı hücre tipinin evrimsel korunumunu ortaya çıkarmak için scRNA-seq kullanarak önemli transkripsiyon faktörlerinin işlevlerini incelemek5. Abiyotik stresler, bitki büyümesi ve gelişimi üzerindeki en önemli çevresel etkiler arasındadır. Tek hücreli transkriptom dizilimi yoluyla farklı tedavi koşulları altında bitki dokularındaki hücre tiplerinin bileşimindeki değişiklikleri araştırarak, abiyotik stres yanıt mekanizması6'yı da çözebilirsiniz.

ScRNA dizilimini kullanarak hücre tipleri arasındaki transkripsiyonel heterojenliği çözme potansiyeli, hücre izolasyon yöntemine ve dizileme platformuna bağlıdır. Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), ışık saçılmasına ve hücrelerin floresan özelliklerine dayanan scRNA-seq için hücrelerin bir alt popülasyonunu izole etmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Transgenik teknoloji ile floresan işaretleyici hatlarının geliştirilmesi, FACS7 ile hücre izolasyonunun verimliliğini büyük ölçüde artırmıştır. Smart-seq28 kullanarak scRNA-seq iletmek, hücresel heterojeniteyi disseke etme yeteneğini daha da geliştirir. Smart-seq2 yöntemi, gen tespiti için iyi bir duyarlılığa sahiptir ve düşük bir transkript girişi9 ile bile genleri tespit edebilir. Toplu hücre tipi toplamaya ek olarak, modern hücre sıralayıcıları, Smart-seq210 veya CEL-seq211 gibi diğer çoğullanmış RNA-seq yöntemlerini kullanarak tek hücreli çözünürlükte transkriptom analizine izin veren tek hücreli bir dizin sıralama formatı sağlar. Tek hücreli veya hücre tipi sıralama, paralel multi-omik çalışmalar12,13 gibi diğer birçok aşağı akış uygulaması için potansiyel olarak kullanılabilir. Burada, ksilem-kutup perisiklus hücreleri, lateral kök kapak hücreleri, lateral kök başlangıç hücreleri, korteks hücreleri ve endodermal hücreler gibi bitki hücre tiplerini FACS tarafından Arabidopsis thaliana marker hücre hatlarının köklerinden izole etmek için sağlam ve çok yönlü bir protokol sunulmaktadır. Protokol ayrıca aşağı akış transkriptom analizi için Smart-seq2 kütüphanesinin oluşturulmasını içerir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıdaki protokol, aşağıdaki kök hücre tipleri için floresan ve floresan işaretleyici çizgileri olmayan A. thaliana vahşi tip (WT) tohumlar için optimize edilmiştir: ksilem-kutuplu perisiklus hücreleri (J0121), lateral kök başlangıç hücreleri, lateral kök kapak hücreleri (J3411), endodermis ve korteks hücreleri (J0571) (Şekil 1A). Tüm işaretleyici çizgileri, daha önce yayınlanmış bir rapor14'ü takiben vahşi tip bir Arabidopsis tesisine GATA23 promotör güdümlü GFP yapısının sokulmasıyla oluşturulan lateral kök başlatma hücresi işaretleyici hattı hariç, ticari bir kaynaktan (Malzeme Tablosuna bakınız) elde edilmiştir.

1. Bitki materyalinin hazırlanması

  1. A. thaliana WT tohumlarını ve floresan işaretleyici hattı tohumlarını, tohumları oda sıcaklığında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca dönen bir inkübatörde% 20 ağartıcıda inkübe ederek sterilize edin.
  2. Tohumları çift damıtılmış suda (ddH2O) üç ila beş kez durulayın. Bu adımı steril temiz bir tezgahta gerçekleştirin.
  3. WT ve muhabir hattı tohumlarını yarı güçlü Murashige ve Skoog (MS) ortamına %0,8 agar (w/v)15 ile kaplayın. 4 °C'de 2 gün boyunca tabakalaştıktan sonra bitkileri 5 gün boyunca dikey olarak büyütün (23 ° C'de 16 saat ışık).

2. Protoplasting

  1. Çözüm A ve Çözüm B olarak adlandırılan protopkalıcı çözeltiler 2,5'i hazırlayın (bkz.
    1. 400 mM mannitol, %0,05 BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 ve 20 mM KCl içeren Çözelti A'yı hazırlayın (bkz. A Çözümünü −20 °C'de 1 aya kadar saklayın.
    2. Çözelti A'nın taze bir aliquotuna %1 (w/v) selülaz R10, %1 (w/v) selülaz RS, %1 (w/v) hemiselülaz, %0,5 (w/v) pektolyaz ve %1 (w/v) macerozyme R10 ekleyerek Çözelti B'yi hazırlayın.
  2. Deneye başlamadan önce A Çözeltisi ve B Çözeltisini buz üzerinde yavaşça çözün.
  3. Kökleri temiz bir bıçak veya makas kullanarak kesin ve kökleri ~ 0,5 cm'lik parçalara ayırın. Kökleri 1,5 mL B Çözeltisine batırın ve ardından oda sıcaklığında 1,5-2 saat boyunca hafifçe döndürün (yaklaşık 18 rpm'de).
  4. Kök protoplastlarını 40 μm süzgeç ağından süzün (bkz.
  5. Süzgeç ağını 1-2 mL Çözelti A ile durulayın.
  6. Adım 2.4 ve adım 2.5'teki sıvıları birleştirin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı bir pipetle atın, hücre peletini 500-600 μL Çözelti A'da yeniden askıya alın ve ardından hemen buzun üzerine yerleştirin.
  7. Askıya alınmış hücre çözeltisini, hücre sıralama için yeni bir 5 mL test tüpüne aktarın.

3. Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS)

  1. Sıralayıcıdaki cihaz kurulum adımlarını açın ve tamamlayın (bkz. Floresan kanallarını seçin, otofloresan taban çizgisini belirlemek için kontrol olarak bir WT tesisi (floresan yok) kullanın ve floresan yoğunluğuna ve FSC/SSC teklilerine göre sıralama kapısını ayarlayın (Şekil 2).
  2. Hücrelerin zarar görmesini önlemek için 1,5 mL'lik bir toplama tüpüne 500 μL Çözelti A (adım 2.1.1) ekleyin. Tüp başına 2.000-3.000 hücre toplayın.
  3. Sıralamadan sonra, numuneleri hemen buzun üzerine yerleştirin, hücreleri içeren toplama tüpünü 300 x g'de 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı bir pipetle çıkarın.
  4. 2 μL sıralanmış hücre alın ve floresan mikroskobu kullanarak floresan olup olmadığını kontrol edin (bkz.
  5. Sıralanan hücreleri −80 °C'de saklayın veya kütüphane yapımı için hemen kullanın (adım 4).
  6. Tek hücreli dizin sıralama için, 96 delikli plakayı bağdaştırıcıya yerleştirin. Plakanın konumunu, damlacık plakanın orta deliğine düşecek şekilde kalibre edin. Sıralama yaparken tek hücreli sıralama modunu seçin, sıralanan hücrelerin hedef sayısını 1 olarak girin ve sıralamaya başlayın.

4. Smart-seq2 kütüphane hazırlığı

  1. Ultra düşük girdi miktarının bir sonucu olarak, kontaminasyonsuz bir ortamda tek hücreli tip RNA-seq kütüphanesi inşası gerçekleştirin. Deneye başlamadan önce, tezgahı bir yüzey dekontaminantı8 (bakınız Malzeme Tablosu) ve% 75 etanol ile temizleyin.
  2. 0.33 μL% 10 Triton X-100, 0.55 μL RNaz inhibitörü ve 0.22 μL 0.1 M DTT'yi birleştirerek lizis tamponunu (karışım A) (Tablo 1) hazırlayın (bkz.
  3. Sıralanan numuneye 1 μL karışım A ekleyin ve steril bir havaneyle öğütün. Tercih edilen numune hacmi ≤0,5 μL'dir; hacmi 14 μL'ye çıkarmak için RNaz içermeyen su kullanın. her bir hücre örneğini 0,2 mL ince duvarlı bir PCR tüpüne aktarın.
  4. 0.44 μL oligo-dT 30 VN ters transkripsiyon (RT) reaksiyon astarı (100 μM) ve 4.4 μL dNTP (10mM) içeren karışım B'yi hazırlayın (Tablo 2) (bkz.
  5. Her tüpteki 14 μL'lik numuneye 4,4 μL B karışımı ekleyin, numuneyi karıştırmak için yavaşça pipet yapın ve numuneyi 72 °C'de 3 dakika boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, oligo-dT'yi poli A kuyruğuna melezleştirmek için numuneleri hemen buz üzerine koyun.
  6. Ters transkripsiyon reaksiyonu karışımını (karışım C) hazırlayın (Tablo 3) (bakınız Malzeme Tablosu). Numuneleri içeren her tüpe 21,6 μL C karışımı ekleyin. RT programını ortak bir PCR cihazında açın (Tablo 4).
  7. Ön amplifikasyon reaksiyonunu buz üzerinde gerçekleştirin. 44 μL 2x PCR polimeraz karışımı ve 0.88 μL IS PCR primeri (10 μM) birleştirerek D karışımını hazırlayın (Tablo 5) (bkz . 40 μL RT reaksiyon ürününe 40,8 μL karışım D ekleyin ve ön amplifikasyon programını çalıştırın (Tablo 6).
  8. Ampure XP boncuklarını kullanarak ön amplifikasyon reaksiyonu ürünlerini saflaştırın (bkz. Adım 4.7'den itibaren her numuneye 48 μL boncuk (0,6:1 oranında) ekleyin ve pipetleme ile numuneleri nazikçe karıştırın.
  9. Numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Numuneleri içeren 1,5 mL'lik tüpleri manyetik bir ayırma standına 5 dakika boyunca yerleştirin. Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı numunelerden dikkatlice atın.
  10. Boncukları 200 μL% 80 etanol içinde yeniden askıya alarak yıkayın ve etanol içeren süpernatanı atmadan önce numuneleri manyetik ayırma standına ( Malzeme Tablosuna bakınız) 3 dakika daha yerleştirin.
  11. Numuneleri 10 dakika boyunca hava ile kurutun ve hava kurutması sırasında kontaminasyonu ve çapraz kontaminasyonu önlemek için tüpü örtün.
  12. Boncukları 20 μLddH2O içinde tekrar askıya alın, numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin ve ardından manyetik ayırma standına 5 dakika boyunca yerleştirin.
  13. Her tüpten 18 μL süpernatantı pipetleyin ve numuneleri yeni 1,5 mL santrifüj tüplerine aktarın. Bir DNA niceleme kiti kullanarak cDNA'nın kalitesini değerlendirmek, bir parça analizörü kullanarak her bir ön kütüphanenin boyut dağılımını belirlemek için numunenin 1 μL'sini kullanın (bkz.
  14. Bir dizileme kütüphanesi hazırlama kiti kullanarak adım 4.13'ün kütüphane öncesi ürününden Illumina dizilimi16 için bir cDNA kütüphanesi 8 oluşturun (bkz.
  15. Ampure XP boncuklarını kullanarak kütüphaneleri saflaştırın (adım 4.14'ten itibaren), saflaştırılmış kütüphaneleri ölçün ve adım 4.13'ü takip eden her kütüphanenin boyut dağılımını belirleyin.
    NOT: Her kütüphanenin eşit nanomollerini bir araya getirerek, hiçbirinin aynı Illumina indeksi kombinasyonuna sahip olmamasını sağlayın. Aksi takdirde, kütüphaneler istenen sıralama çıktısına dayalı bir oranda bir araya getirilebilir ve Illumina sıralayıcısının aynı şeridinde birlikte sıralanabilir. Genel olarak, her kütüphaneyi >10 milyon haritalanmış okuma sağlayan 4-6 GB derinliğe kadar sıralamak, Arabidopsis genomunun 20x-30x kapsama alanını sağlar. Daha düşük sıralama derinlikleri de kabul edilebilir, ancak diferansiyel ifade analizinin önemini etkileyebilir.

5. RNA-seq veri analizi

  1. Trim-Galore17 kullanarak ham okumaları kırpın, ardından hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2) kullanarak referans genoma eşleyin ve Picard19 (broadinstitute.github.io/picard) kullanarak PCR çoğaltılmış parçaları çıkarın.
  2. Her numune için en az üç biyolojik replika kullanarak DESeq220 ile diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin (DEG) ham sayım işlemesini ve müteakip analizini gerçekleştirin. Pheatmap paketi ile gen ekspresyonunun kümelenmesini gerçekleştirin ve bir ekspresyon ısı haritasında görselleştirin.
    NOT: Genlerin ve TE'lerin (dönüştürülebilir elementler) RPKM (milyon eşlenmiş okuma başına kilobaz başına okuma) değerleri Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) ile hesaplanmış ve bir genom tarayıcısında görselleştirilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protoplast izolasyonu
Bu protokol, floresan A. thaliana kök işaretleyici çizgilerinin protoplast sıralaması için etkilidir. Bu belirteç çizgileri, floresan proteinlerinin özellikle hedef hücre tiplerinde eksprese edilen genlerle füzyonu veya arttırıcı tuzak çizgileri kullanılarak geliştirilmiştir (Şekil 1). Çok sayıda doku ve organ, model bitkilerde ve mahsullerde spesifik floresan belirteçleri eksprese eden hücre tiplerine diseke edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Smart-seq2 tabanlı protokol, yüzlerce hücreden güvenilir sıralama kitaplıkları oluşturabilir8. Başlangıç malzemesinin kalitesi, transkriptom analizinin doğruluğu için esastır. FACS, ilgilenilen hücreleri hazırlamak için güçlü bir araçtır, ancak bu prosedür, özellikle de protoplasting adım, bitki uygulamaları için optimize edilmelidir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) veya manuel disseke hücreler de girdi25,26 olarak kullanılabilir, bu nedenle burada sağlanan protokol

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolü Şangay Jiao Tong Üniversitesi Tarım ve Biyoloji Fakültesi'nin tek hücreli multi-omik tesisinde kurduk ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32070608), Şangay Pujiang Programı (Hibe No. 20PJ1405800) ve Şangay Jiao Tong Üniversitesi (Hibe No. Agri-X20200202, 2019TPB05) tarafından desteklendik.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 ve mikro; m süzgeçSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Agilent parça analizörüAglientAglient 5200
Agilent yüksek hassasiyetli DNA kitiAglientDNF-474-0500
Ampure XP boncuklarıBECKMANA63881
BetainyuanyeS18046-100g
Çamaşır SuyuBay KasFnBn83BK%20 (h/h) çamaşır suyu
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Selülaz R10Yakult (Japonya)9012-54-8
Selülaz RSYakult (Japonya)9012-54-8
Santrifüj tüpü (1.5 mL)Eppendolf30121589
DNaz, RNase, DNA ve RNA Uzak Yüzey DekontaminantlarıBeyotimeR0127
dNTP'ler (10 mM)NEBN0447S
DTT (0,1 M)
invitrojen		18090050
EtanolSinopharm Kimyasal Reaktif Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodiBD-65745
FACSSonySH800S
Filtre ucu  (1000 ve mikro; L)Thermo ScientificTF112-1000-Q
Filtre ucu  (200 & L)Thermo ScientificTF140-200-Q
Filtre ucu (10 & mikro; L)Thermo ScientificTF104-10-Q
Filtre ucu (100 & mikro; L)Thermo ScientificTF113-100-Q
Floresan mikroskobuNikonEclipse Ni-E
Dört Boyutlu Döner KarıştırıcıKylin -BellBE-1100
Hemiselülazsigma9025-56-3
IS PCR astarı5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix( 2X)Roche 
KClSinopharm Kimyasal Reaktif Co, Ltd7447-40-7
Makrozyme R10Yakult (Japonya)9032-75-1
Manyetik ayırma standıinvitrojen12321D
Mannitolaladdin69-65-8
MESaladdin145224948
MgCl < sub > 2 < / sub> yuanyeR21455-500ml
MikrosantrifüjlerEppendorfSantrifüj 5425
Mikro-mini santrifüjTitanTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT DNA Kütüphanesi Hazırlama KitiilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN astarı5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'PCR
cihazıTermal döngüleyiciA24811
PektolyazYakult (Japonya)9033-35-6
Bitki işaretleyici çizgileriNottingham Arabidopsis Stok Merkezi (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Test KitiinvitrogenQ33231
Qubit 2.0 florometreinvitrojenQ32866
RNaz inhibitörü ve nbsp;Thermo ScientificEO0382
RNaz içermeyen suinvitrojeni10977023
Çözeltisi A400 mM mannitol, %0,05 BSA, 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl
Çözelti B%1 (a/h)selülaz R10, %1 (a/h) selülaz RS, %1  (w/h)hemiselülaz, %0.5   (w/h)pektoliyaz ve %1  (w/v) Taze bir çözelti alikotunda Macerozyme R10 Steril bir
havaneliBIOTREAT453463
Süzgeç (40 & mikro; m )Sorfa 251100
SuperScript IV ters transkriptaz (200 U/&mikro; L)canlandırıcı18090050
SuperScript IV tamponu (5x)canlandırıcı18090050
Test tüpü (5 mL)BD Falcon352052
Kapaklı ince duvarlı PCR tüpleri (0,5 mL)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO astarı5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'Girdap
TitanVM-T2
7958935001,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -H., Wang, J. -W. Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root. Nature Communications. 12 (1), 2053(2021).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).
  3. Liu, Q., et al. Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution. Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).
  4. Liu, Z., et al. Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing. Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).
  5. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).
  6. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), (2020).
  7. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  8. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  9. Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2. Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).
  10. Serrano-Ron, L., et al. Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation. Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).
  11. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77(2016).
  12. Macaulay, I. C., et al. G&T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes. Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).
  13. Angermueller, C., et al. Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity. Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).
  14. De Rybel, B., et al. A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity. Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).
  15. Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy. Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).
  16. Levy, S. E., Myers, R. M. Advancements in next-generation sequencing. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).
  17. Ooi, C. C., et al. High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells. PLoS One. 12 (11), e0188510(2017).
  18. Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
  19. Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease. Journal of Open Source Software. 3, 583(2018).
  20. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550(2014).
  21. Kamiya, T., et al. The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).
  22. Zhang, Y., et al. Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation. Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).
  23. Haecker, A., et al. Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Development. 131 (3), 657-668 (2004).
  24. Chen, Q., et al. Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots. Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).
  25. Nichterwitz, S., et al. Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling. Nature Communications. 7, 12139(2016).
  26. Long, J., et al. Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis. Science. 373 (6550), (2021).
  27. Gutzat, R., et al. Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns. EMBO Journal. 39 (20), e103667(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bitki H cresi zolasyonuTek H cre DizilemeFloresan Aktivasyonlu H cre Ay klamaArabidopsis K k H creleriProtoplast Ay klamaRNA DizilemeSmart seq2 ProtokolH cre Tipi Heterojenli iMultiomik Analiz

İlgili makaleler