Mevcut protokol, insan ve insan olmayan primat idrar türevi hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) izole etmek, genişletmek ve yeniden programlamak için bir yöntemin yanı sıra yeni üretilen iPSC'lerin besleyicisiz bakımı için talimatları açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İdrardan Elde Edilen Primat Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Üretimi ve Bakımı
Bu makalede
Özet
Özet
Primat pluripotent kök hücreleri ve türevlerini inceleyen türler arası yaklaşımlar, hastalık, gelişim ve evrimin moleküler ve hücresel mekanizmalarını daha iyi anlamak için çok önemlidir. Primatların neden olduğu pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) daha erişilebilir hale getirmek için, bu makale idrardan türetilmiş hücrelerden insan ve insan olmayan primat iPSC'leri üretmek için invaziv olmayan bir yöntem ve bunların besleyicisiz bir kültürleme yöntemi kullanılarak sürdürülmesini sunmaktadır.
İdrar, steril olmayan bir ortamdan (örneğin, hayvanın kafesi) örneklenebilir ve kontaminasyonu etkili bir şekilde azaltmak için birincil hücre kültürü sırasında geniş spektrumlu bir antibiyotik kokteyli ile muamele edilebilir. İdrar kaynaklı hücrelerin çoğaltılmasından sonra, iPSC'ler ticari olarak temin edilebilen bir Sendai virüs vektör sisteminin modifiye edilmiş bir transdüksiyon yöntemi ile üretilir. İlk iPSC kolonileri 5 gün sonra zaten görülebilir ve en erken 10 gün sonra toplanabilir. Enzimsiz ayrışma tamponu ile rutin kümelenme geçişi, 50'den fazla pasaj için üretilen iPSC'lerin pluripotensini destekler.
Giriş
İnsan ve insan olmayan primatların (NHP'ler) genomik karşılaştırmaları, evrimsel tarihimizi ve insana özgü özelliklerin evrimini anlamak için çok önemlidir1. Ek olarak, bu karşılaştırmalar, korunmuş DNA dizileri2'yi tanımlayarak, örneğin hastalıkla ilişkili varyantları önceliklendirmek için fonksiyonun çıkarılmasına izin verir3. Gen ekspresyon seviyeleri gibi moleküler fenotiplerin karşılaştırılması, genomik karşılaştırmaları daha iyi yorumlamak ve örneğin hücresel fenotipik farklılıkları keşfetmek için çok önemlidir. Dahası, DNA seviyesindeki karşılaştırmalara benzer şekilde, işlevsel alaka düzey....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu deneysel prosedür, insan deneyleri sorumlu etik komitesi (20-122, Ethikkommission LMU München) tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler ilgili kılavuz ilkelere ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: İnsan ve NHP örnekleri ile ilgili deneylere başlamadan önce uygun etik kuruldan onay alınmalıdır. Tüm deneysel prosedürler ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Aşağıdaki adımların her biri, biyolojik bir güvenlik kabininde steril teknik kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Tüm tampon ve ortam bileşimleri Ek Tablo S1'de bulunabilir. Hücrelere eklenmeden önce tüm ortamların oda sıcaklığına (22 °C) ısıtıld....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Hücreleri insan ve NHP idrarından izole ederken, izolasyondan hemen sonra farklı hücre tipleri tanımlanabilir. Skuamöz hücrelerin yanı sıra çeşitli küçük yuvarlak hücreler idrarla atılır; Kadın idrarı, erkek idrarından çok daha fazla skuamöz hücre içerir (Şekil 1B - Gün 0; Ek Şekil S1). Primer idrar ortamında 5 günlük kültürden sonra ilk yapışık proliferasyon yapan hücreler görülebilir (Şekil 1A,B - Gün 5). Bu noktada, ortamın y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
iPSC'ler, in vitro olarak erişilemeyen hücre tiplerinin üretilmesine izin verdikleri için değerli hücre tipleridir. Yeniden programlamanın başlangıç materyalleri olarak, örneğin, fibroblastlar tüm primat türlerinden kolayca elde edilemediğinden, bu makale idrardan türetilmiş hücrelerden iPSC'lerin üretilmesi için bir protokol sunmaktadır. Bu hücreler, kültür ortamını geniş spektrumlu antibiyotiklerle destekleyerek, steril olmayan primat idrar örneklerinden bile invaziv olmayan bir şekilde elde edilebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma DFG EN 1093/5-1 (proje numarası 458247426) tarafından desteklenmiştir. M.O. JSPS Overseas Research Fellowship tarafından desteklenmiştir. Tüm figürler BioRender.com ile oluşturuldu. Akım sitometrisi, Münih Biyomedikal Merkezi'ndeki Core Facility Flow Cytometry yardımıyla gerçekleştirildi. Kyoto Üniversitesi ASHBi'den Makoto Shida ve Tomoyo Muto'ya videografiye verdikleri destek için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Accumax & trade; hücre ayırma çözümü ( Ayırma çözümü< / em>) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Amfoterisin B-Çözeltisi | Merck | A2941-100ML | |
| Anti-İnsan TRA-1-60 Fare Antikoru | Kök Hücre Teknolojileri | 60064 | Seyreltme: 1/200 |
| Anti-İnsan TRA-1-60 PE konjuge Antikor | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Seyreltme: 1/50 |
| Bambanker ve ticaret; ( Hücre dondurma ortamı< / em>) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Hücre kültürü çok kuyulu plaka, 12 oyuklu CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Kontes ve ticaret; II otomatik hücre sayacı | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® 2D Barkodlu 1,5 mL Tüpler (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Dondurma için farklı tipte Kriyotüpler kullanılabilir. 2D barkod tüpleri, numune bilgilerinin benzersiz tüp bilgilerine sahip bir veritabanında saklanabilmesi avantajına sahiptir. |
| CytoTune ve ticaret; EmGFP Sendai Floransan Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Yeniden Programlama Kiti (Sendai virüsü yeniden programlama kiti) | Thermo Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4 ',6-Diamidin-2'-fenilindol dihidroklorür | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM Yüksek Glikoz | TH. Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutamin | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Eşek anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor & trade; 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Seyreltme: 1/500 |
| Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor & trade; 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Seyreltme: 1/500 |
| Kalsiyumsuz DPBS, Magnezyum | TH'siz. Geyer | L0615-500 | |
| EpCAM Rekombinant Poliklonal Tavşan Antikoru (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Seyreltme: 1/500 |
| Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL konik tabanlı | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL konik tabanlı | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısı inaktive edilmiş, Brezilya (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | ||
| Domuz derisinden elde edilen jelatin | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex & trade; LDEV İçermeyen, hESC Nitelikli, Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran Matrisi | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX & trade; Takviye Thermo | Fisher Scientific | 35050038 | |
| Heracell™ 240i CO2 inkübatörü | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe güvenlik kabini | Kendro | 51017905 | |
| Human EGF, birinci sınıf | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Sürüm 2.9.0 | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mikrosantrifüj tüpü PP, 1.5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Mikroskop Nikon tutulma TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Fare anti-alfa-Fetoprotein antikoru | R& D Sistemleri | MAB1368 | Seyreltme: 1/100 |
| Fare anti-alfa-Düz Kas Aktin antikoru | R& D Sistemleri | MAB1420 | Seyreltme: 1/100 |
| Fare anti-beta-III Tubulin antikoru | R& D Sistemleri | MAB1195 | Seyreltme: 1/100 |
| mTeSR ve ticaret; 1 | STEMCELL Teknolojileri | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Tavşan mAb | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | 4903S | Seyreltme: 1/400 |
| Normocure ve ticaret; (Antimikrobiyal Reaktif) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Tavşan Antikoru | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | 2750S | Seyreltme: 1/400 |
| Paraformaldehit (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penisilin-Streptomisin (10.000 U / ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penisilin-Streptomisin karışımı 100 U / mL Penisilin ve 100 & mikro içerir; g/mL Streptomisin. |
| Rekombinant İnsan FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Rekombinant İnsan PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Soğutmalı tezgah üstü santrifüj | SIGMA | 4-16KS | |
| Renal Epitel Hücreli Bazal Orta | ATCC | PCS-400-030 | |
| Renal Epitel Hücre Büyüme Kiti | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) Fare mAb # 4900 | Hücre Sinyal Teknolojisi | 4900S | Seyreltme: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) Fare mAb | NEB | 4755S | Seyreltme: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | Bu besiyerinin üretimi durduruldu, bunun yerine insan hücre hatları için StemFit Basic04CT veya insan olmayan primatlar için StemFit Basic03 kullanın. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE ve ticaret; Enzim Seç (1x), fenol kırmızısı yok ( ayrışma enzimi< / em >) | Thermo Fisher Scientific | 12563011 | |
| Su Banyosu Hassasiyeti GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, Dihidroklorür Tuzu ( Kaya İnhibitörü < / em >) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Antikor seyreltme tamponu | Kompozisyon için ek tablo S1 | ||
| Blokaj tamponu | Bileşim için ek tabloya bakın S1 | ||
| REMC ortamı | Bileşim için ek tabloya bakın S1 | ||
| Birincil idrar ortamı | Bileşim için ek tabloya bakın S1 | ||
| PSC kültür ortamı | Bileşim için ek tabloya bakın S1 | ||
| PSC üretim ortamı | Kompozisyon için ek tablo S1'e bakın | ||
| İdrar yıkama tamponu | Kompozisyon için ek tablo S1'e bakın |
Kaynaklar
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
