Yöntem makalesi

İdrardan Elde Edilen Primat Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Üretimi ve Bakımı

DOI:

10.3791/64922

⸱

28 Temmuz 2023

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biology, Ludwig Maximilian University of Munich, 2Institute for the Advanced Study of Human Biology, Kyoto University, 3Hakubi Center, Kyoto University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, insan ve insan olmayan primat idrar türevi hücreleri indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) izole etmek, genişletmek ve yeniden programlamak için bir yöntemin yanı sıra yeni üretilen iPSC'lerin besleyicisiz bakımı için talimatları açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primat pluripotent kök hücreleri ve türevlerini inceleyen türler arası yaklaşımlar, hastalık, gelişim ve evrimin moleküler ve hücresel mekanizmalarını daha iyi anlamak için çok önemlidir. Primatların neden olduğu pluripotent kök hücreleri (iPSC'ler) daha erişilebilir hale getirmek için, bu makale idrardan türetilmiş hücrelerden insan ve insan olmayan primat iPSC'leri üretmek için invaziv olmayan bir yöntem ve bunların besleyicisiz bir kültürleme yöntemi kullanılarak sürdürülmesini sunmaktadır.

İdrar, steril olmayan bir ortamdan (örneğin, hayvanın kafesi) örneklenebilir ve kontaminasyonu etkili bir şekilde azaltmak için birincil hücre kültürü sırasında geniş spektrumlu bir antibiyotik kokteyli ile muamele edilebilir. İdrar kaynaklı hücrelerin çoğaltılmasından sonra, iPSC'ler ticari olarak temin edilebilen bir Sendai virüs vektör sisteminin modifiye edilmiş bir transdüksiyon yöntemi ile üretilir. İlk iPSC kolonileri 5 gün sonra zaten görülebilir ve en erken 10 gün sonra toplanabilir. Enzimsiz ayrışma tamponu ile rutin kümelenme geçişi, 50'den fazla pasaj için üretilen iPSC'lerin pluripotensini destekler.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan ve insan olmayan primatların (NHP'ler) genomik karşılaştırmaları, evrimsel tarihimizi ve insana özgü özelliklerin evrimini anlamak için çok önemlidir1. Ek olarak, bu karşılaştırmalar, korunmuş DNA dizileri2'yi tanımlayarak, örneğin hastalıkla ilişkili varyantları önceliklendirmek için fonksiyonun çıkarılmasına izin verir3. Gen ekspresyon seviyeleri gibi moleküler fenotiplerin karşılaştırılması, genomik karşılaştırmaları daha iyi yorumlamak ve örneğin hücresel fenotipik farklılıkları keşfetmek için çok önemlidir. Dahası, DNA seviyesindeki karşılaştırmalara benzer şekilde, işlevsel alaka düzeyini çıkarma ve dolayısıyla insanlarda tıbbi olarak ilgili varyasyonları daha iyi yorumlama potansiyeline sahiptirler4. Kapsamlı moleküler fenotipik verilerin bu karşılaştırmalı çalışmalara dahil edilmesi, uygun biyolojik kaynakları (yani, türler arasında ortolog hücreler) gerektirir. Bununla birlikte, etik ve pratik nedenler, özellikle gelişim sırasında, bu tür karşılaştırılabilir hücrelere erişmeyi zorlaştırır veya imkansız kılar. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), in vitro 5,6'da erişilemeyen hücre tiplerinin üretilmesine izin verir, deneysel olarak erişilebilirdir ve primat karşılaştırmaları için kullanılmıştır6,7,8,9,10,11,12,13,14.

iPSC'ler oluşturmak için, yeniden programlanacak birincil hücrelerin edinilmesi gerekir. İdrardan izole edilen hücreler, primatlardan invaziv olmayan bir şekilde örneklenebilmeleri ve muhtemelen kök hücre benzeri moleküler profilleri nedeniyle kolayca yeniden programlanabilmeleri avantajına sahiptir15. Primat iPSC'lerini korumak için kültür koşulları, yeniden programlama kadar önemlidir; Klasik olarak, insan pluripotent kök hücrelerinin kültürü, embriyonik kök hücreler (ESC'ler) için gerekli besinleri ve bir iskele sağlayan, tanımlanmamış, serum bazlı bir ortam ve fare embriyonik fibroblastlarının (besleyici hücreler olarak adlandırılır) ortak kültürünü gerektiriyordu16. Kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen kültür sistemlerinin geliştirilmesinden bu yana17,18, artık ticari olarak temin edilebilen iPSC kültür ortamları ve matrisleri için çeşitli seçenekler bulunmaktadır. Bununla birlikte, bu kültür koşullarının çoğu insan ESC'leri ve iPSC'leri için optimize edilmiştir ve bu nedenle NHP iPSC kültüründe daha az iyi çalışabilir. Bu video protokolünde, idrar hücre kültüründen türetilen insan ve NHP iPSC'lerinin üretilmesi ve sürdürülmesi için talimatlar sunuyoruz.

2006 yılında fibroblastlarda tanımlanmış faktörlerin zorla ekspresyonu ile iPSC üretiminin ilk raporundan bu yana, bu yöntem çeşitli kökenlerden birçok farklı hücre tipine uygulanmıştır 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Bunlar arasında, sadece idrar kaynaklı hücreler tamamen invaziv olmayan bir şekilde elde edilebilir. Zhou ve ark.33 tarafından daha önce tarif edilen protokole dayanarak, geniş spektrumlu antibiyotikleri15 destekleyerek, steril olmayan örneklerden bile primat idrarından hücreleri izole edebilir ve genişletebilir. Özellikle, bu protokol tarafından örneklenen idrar türevi hücreler, fibroblastların geleneksel yeniden programlanmasından (deneyimlerimize göre 20-30 gün) daha kısa bir süre içinde (koloniler 5-15 gün içinde görünür hale gelir) ve yeterince yüksek bir başarı oranıyla iPSC'ler üretmek için yüksek bir potansiyel sergiler. Bu idrar kaynaklı hücreler, mezenkimal kök hücre benzeri hücrelerin ve mesane epitel hücrelerinin karışık popülasyonu olarak sınıflandırıldı ve yüksek yeniden programlama verimliliğine neden oldu15.

Birincil hücrelerdeki varyasyona ek olarak, iPSC'leri oluşturmak için yeniden programlama yöntemleri de kullanım amacına göre değişir. İnsan somatik hücreleri için geleneksel yeniden programlama prosedürleri, eksojen DNA'nıngenom 5,34,35'e entegrasyonuna izin veren retrovirüs veya lentivirüs vektörleri ile yeniden programlama faktörlerinin aşırı ekspresyonu ile gerçekleştirildi. Üretilen iPSC'leri genomik olarak sağlam tutmak için, araştırmacılar çok çeşitli entegrasyon dışı sistemler geliştirdiler - uyarılabilir PiggyBac vektörü36,37, epizomal vektör38,39, Sendai virüsü 40 ve adenovirüs41 gibi entegre olmayan virüs vektörleri, mRNA transfeksiyonu 42, protein transfeksiyonu 43,44 ve kimyasal bileşik tedavisi 45. Kullanımdaki verimlilik ve kolaylık nedeniyle, Sendai virüsü tabanlı yeniden programlama vektörleri bu protokolde kullanılır. Primer hücrelerin enfeksiyonu, kaplamadan önce 5'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) hücrelerin ve virüslerin 1 saatlik süspansiyon kültüründe gerçekleştirilir. Bu modifiye adım, virüslerin doğrudan yapışkan hücre kültürüne eklendiği geleneksel yönteme kıyasla hücre yüzeyleri ve virüsler arasındaki temas olasılığını artırabilir ve böylece daha fazla iPSC kolonisi15 verebilir.

İnsan ve NHP pluripotent kök hücrelerin geçişi, kümelenme geçişi ve tek hücreli geçiş ile yapılabilir. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA), kalsiyum ve magnezyum iyonlarını bağlayan ve böylece kadherin ve integrinin yapışkan aktivitesini önleyen uygun maliyetli bir şelatlama ajanıdır. EDTA ayrıca hafif, seçici bir ayrışma reaktifi olarak da kullanılır, çünkü farklılaşmamış hücreler farklı yapışma molekülleri nedeniyle farklılaşmış hücrelerden önce ayrılırlar. Tam ayrışma, primat iPSC'lerinin Rho / Rho ile ilişkili sarmal bobin içeren protein kinaz (Rho / Rock) aracılı miyozin hiperaktivasyonu yoluyla masif hücre ölümüne neden olur. Bu nedenle, kültür ortamının bir Rho / Rock inhibitörü ile desteklenmesi,süspansiyon 46,47'de tek hücre gerektiren deneyler için gereklidir. Bu protokolde, rutin geçiş yöntemi olarak küme geçişini öneriyoruz ve tek hücreli geçişi yalnızca gerekli olduğunda, örneğin tanımlanmış hücre numaralarının tohumlanması gerektiğinde veya alt klonlama sırasında öneriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneysel prosedür, insan deneyleri sorumlu etik komitesi (20-122, Ethikkommission LMU München) tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler ilgili kılavuz ilkelere ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: İnsan ve NHP örnekleri ile ilgili deneylere başlamadan önce uygun etik kuruldan onay alınmalıdır. Tüm deneysel prosedürler ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Aşağıdaki adımların her biri, biyolojik bir güvenlik kabininde steril teknik kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Tüm tampon ve ortam bileşimleri Ek Tablo S1'de bulunabilir. Hücrelere eklenmeden önce tüm ortamların oda sıcaklığına (22 °C) ısıtıldığından emin olun. Her santrifüjleme adımı, aksi belirtilmedikçe, oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir.

1. İdrar örneklerinden hücrelerin izolasyonu

DİKKAT: İnsan donörlerinin insan immün yetmezlik virüsü (HIV), hepatit B virüsü (HBV) ve hepatit C virüsü (HCV) içermediğinden emin olun. NHP'ler için, olası donörlerin / hücrelerin spesifik patojenler-B Virüsü (BV), Simian İmmün Yetmezlik Virüsü (SIV), Simian Betaretrovirüs (SRV) ve Simian T Hücresi Lenfotropik Virüsü (STLV) içermediğinden emin olun.

  1. Kuyucuk başına 500 μL% 0.2 jelatin ekleyerek jelatin kaplı 12 delikli bir plaka hazırlayın ve plakayı hareket ettirerek sıvıyı dağıtın. İhtiyaç duyulmadan önce en az 30 dakika boyunca 37 ° C'de bekletin.
  2. İnsan idrar örneklerini 50 mL konik tüplerde toplayın. Primatlar için, hayvan tesisinin tabanından bir şırınga ile idrar toplayın.
    NOT: Girişimlerin% 42'sinde en az bir koloninin izole edilmesi için 5 mL'lik bir idrar hacminin yeterli olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, kolonileri izole etme şansını artırmak için daha yüksek miktarda ~ 50 mL idrar kullanılması önerilir. NHP idrarı mümkün olduğunca taze, tercihen idrara çıktıktan hemen sonra örneklenmelidir. İdrar örneklerinin 4 saat boyunca 4 ° C'de saklanmasının protokolün başarı oranı üzerinde olumsuz bir etkisi olmamıştır, ancak daha uzun depolama süreleri test edilmemiştir.
  3. İdrar içeren tüpü 10 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj edin ve tüpte yaklaşık 1 mL bırakarak süpernatanı dikkatlice aspire edin.
  4. Pelet artık 1 mL sıvı içinde tekrar askıya alın. Birden fazla idrar tüpü toplanmışsa, süspansiyonları bir tüpte toplayın.
  5. Tüpe 2,5 μg/mL amfoterisin içeren 10 mL idrar yıkama tamponu ( Ek Tablo S1'e bakınız) ekleyerek hücreleri yıkayın ve süspansiyonu serolojik bir pipet kullanarak dikkatlice karıştırın.
  6. Tüpü 10 dakika boyunca 200 × g'da santrifüj edin ve süpernatanı dikkatlice aspire ederek tüpte yaklaşık <0.2 mL bırakın.
  7. Başlangıçta işlenmiş idrarın 50 mL'si başına 0.5 μg / mL amfoterisin içeren 1 mL birincil idrar ortamında (Ek Tablo S1'e bakınız) hücre peletini yeniden askıya alın (50 mL'den az idrar işlenmiş olsa bile 1 mL'de yeniden askıya alın).
  8. Kuyucuklardan jelatin aspire edin (adım 1.1'de hazırlanır) ve süspansiyonun 1 mL'sini adım 1.7'den 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna taplayın. İstediğiniz kadar kuyu için veya mevcut olduğu kadar mililitre süspansiyon için tekrarlayın.
    İsteğe bağlı: Sağlıksız numune toplamadan kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için, buradan ilk geçişe kadar hücrelere 100 μg/mL antimikrobiyal reaktif ekleyin.
  9. Plakayı 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöre yerleştirin.
  10. Mevcut ortamı çıkarmadan, 5. güne kadar günde 1 mL birincil idrar ortamı ekleyin.
  11. 5. günde, plakadan 4 mL ortam aspire edin ve yaklaşık 1 mL orta bırakın. Yeni kültür ortamıyla 1:1 karışım elde etmek için kuyucuk başına 1 mL REMC ortamı ekleyin (Ek Tablo S1'e bakınız).
  12. İlk koloniler ortaya çıkana kadar ortamın yarısını her gün REMC ortamı ile değiştirin (Şekil 1A, B). Bu nedenle, 1 mL eski ortamı çıkarın ve kuyu başına 1 mL taze REMC ortamı ekleyin.

2. İdrar hücrelerinin genişlemesi


  2. Virüs hacmi formülünün hesaplanması, MOI yöntemi, hücre çalışması uygulamaları için denklem.



>










Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreleri insan ve NHP idrarından izole ederken, izolasyondan hemen sonra farklı hücre tipleri tanımlanabilir. Skuamöz hücrelerin yanı sıra çeşitli küçük yuvarlak hücreler idrarla atılır; Kadın idrarı, erkek idrarından çok daha fazla skuamöz hücre içerir (Şekil 1B - Gün 0; Ek Şekil S1). Primer idrar ortamında 5 günlük kültürden sonra ilk yapışık proliferasyon yapan hücreler görülebilir (Şekil 1A,B - Gün 5). Bu noktada, ortamın y...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSC'ler, in vitro olarak erişilemeyen hücre tiplerinin üretilmesine izin verdikleri için değerli hücre tipleridir. Yeniden programlamanın başlangıç materyalleri olarak, örneğin, fibroblastlar tüm primat türlerinden kolayca elde edilemediğinden, bu makale idrardan türetilmiş hücrelerden iPSC'lerin üretilmesi için bir protokol sunmaktadır. Bu hücreler, kültür ortamını geniş spektrumlu antibiyotiklerle destekleyerek, steril olmayan primat idrar örneklerinden bile invaziv olmayan bir şekilde elde edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma DFG EN 1093/5-1 (proje numarası 458247426) tarafından desteklenmiştir. M.O. JSPS Overseas Research Fellowship tarafından desteklenmiştir. Tüm figürler BioRender.com ile oluşturuldu. Akım sitometrisi, Münih Biyomedikal Merkezi'ndeki Core Facility Flow Cytometry yardımıyla gerçekleştirildi. Kyoto Üniversitesi ASHBi'den Makoto Shida ve Tomoyo Muto'ya videografiye verdikleri destek için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Accumax & trade; hücre ayırma çözümü ( Ayırma çözümü< / em>)Sigma-AldrichSCR006
Amfoterisin B-ÇözeltisiMerckA2941-100ML
Anti-İnsan TRA-1-60 Fare Antikoru Kök Hücre Teknolojileri60064Seyreltme: 1/200
Anti-İnsan TRA-1-60 PE konjuge Antikor Miltenyi Biotec130-122-965Seyreltme: 1/50
Bambanker ve ticaret; ( Hücre dondurma ortamı< / em>)Nippon GeneticsBB01
Sığır Serumu Albümini (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
Hücre kültürü çok kuyulu plaka, 12 oyuklu CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Kontes ve ticaret; II otomatik hücre sayacıThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® 2D Barkodlu 1,5 mL Tüpler (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213Dondurma için farklı tipte Kriyotüpler kullanılabilir. 2D barkod tüpleri, numune bilgilerinin benzersiz tüp bilgilerine sahip bir veritabanında saklanabilmesi avantajına sahiptir.
CytoTune ve ticaret; EmGFP Sendai Floransan Reporter (GFP Sendai virus)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Yeniden Programlama Kiti (Sendai virüsü yeniden programlama kiti)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4 ',6-Diamidin-2'-fenilindol dihidroklorürSigma-Aldrich10236276001
DMEM Yüksek GlikozTH. GeyerL0102
DMEM/F12 w L-glutaminFisher Scientific15373541
Eşek anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor & trade; 488Thermo Fisher ScientificA-21202Seyreltme: 1/500
Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor & trade; 594Thermo Fisher ScientificA-21207Seyreltme: 1/500
Kalsiyumsuz DPBS, MagnezyumTH'siz. GeyerL0615-500
EpCAM Rekombinant Poliklonal Tavşan Antikoru (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524Seyreltme: 1/500
Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 mL konik tabanlıGreiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 mL konik tabanlıGreiner BIO-ONE227261
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısı inaktive edilmiş, Brezilya (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 
Domuz derisinden elde edilen jelatinSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex & trade; LDEV İçermeyen, hESC Nitelikli, Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran MatrisiThermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX & trade; Takviye ThermoFisher Scientific35050038
Heracell™ 240i CO2 inkübatörüFisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe güvenlik kabiniKendro51017905
Human EGF, birinci sınıfMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ FijiSürüm 2.9.0
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
Mikrosantrifüj tüpü PP, 1.5 mLNerbe Plus04-212-1000
Mikroskop Nikon tutulma TE2000-SNikonTE2000-S
Fare anti-alfa-Fetoprotein antikoruR& D SistemleriMAB1368Seyreltme: 1/100
Fare anti-alfa-Düz Kas Aktin antikoruR& D SistemleriMAB1420Seyreltme: 1/100
Fare anti-beta-III Tubulin antikoruR& D SistemleriMAB1195Seyreltme: 1/100
mTeSR ve ticaret; 1STEMCELL Teknolojileri85850
Nanog (D73G4) XP Tavşan mAb Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi4903SSeyreltme: 1/400
Normocure ve ticaret; (Antimikrobiyal Reaktif)Invivogenant-noc
Oct-4 Tavşan Antikoru Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi2750SSeyreltme: 1/400
Paraformaldehit (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
Penisilin-Streptomisin (10.000 U / ml) (PS)Thermo Fisher Scientific15140122Penisilin-Streptomisin karışımı 100 U / mL Penisilin ve 100 & mikro içerir; g/mL Streptomisin.
Rekombinant İnsan FGF-basicPeproTech100-18B
Rekombinant İnsan PDGF-ABPeproTech100-00AB
Soğutmalı tezgah üstü santrifüjSIGMA 4-16KS
Renal Epitel Hücreli Bazal OrtaATCCPCS-400-030
Renal Epitel Hücre Büyüme KitiATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Fare mAb # 4900Hücre Sinyal Teknolojisi4900SSeyreltme: 1/400
SSEA4 (MC813) Fare mAbNEB4755SSeyreltme: 1/500
StemFit® Basic02Nippon Genetics3821.00Bu besiyerinin üretimi durduruldu, bunun yerine insan hücre hatları için StemFit Basic04CT veya insan olmayan primatlar için StemFit Basic03 kullanın.
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-50ML
TrypLE ve ticaret; Enzim Seç (1x), fenol kırmızısı yok ( ayrışma enzimi< / em >)Thermo Fisher Scientific12563011
Su Banyosu Hassasiyeti GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, Dihidroklorür Tuzu ( Kaya İnhibitörü < / em >)BiozolBYT-ORB153635
Antikor seyreltme tamponuKompozisyon için ek tablo S1
Blokaj tamponuBileşim için ek tabloya bakın S1
REMC ortamıBileşim için ek tabloya bakın S1
Birincil idrar ortamıBileşim için ek tabloya bakın S1
PSC kültür ortamıBileşim için ek tabloya bakın S1
PSC üretim ortamıKompozisyon için ek tablo S1'e bakın
İdrar yıkama tamponuKompozisyon için ek tablo S1'e bakın
663441

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
  4. Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
  7. Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
  8. Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214(2017).
  9. Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
  10. Gallego Romero,, I,, et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103(2015).
  11. Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312(2018).
  12. Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361(2022).
  13. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  14. Dannemann, M., Gallego Romero,, I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
  15. Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516(2021).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  17. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  18. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  19. Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
  20. Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
  21. Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
  22. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  23. Park, I. -H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  24. Loh, Y. -H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  25. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  26. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
  27. Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
  28. Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
  29. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  30. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  31. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
  32. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  33. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  34. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  35. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  36. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  37. Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
  38. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  39. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  40. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  41. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  42. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  43. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  44. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  45. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  46. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  47. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  48. Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
  49. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432(2014).
  50. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  51. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
  52. Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
  53. Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
  54. Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Primat iPSC lerdrar T revli H crelerBesleyici H creden Ba ms z K lt rSendai Vir s Yeniden ProgramlamaK me PasajlamaPluripotens Belirte leriAk Sitometrisimm nositokimyaGerm Tabakas Diferansiyasyonu

İlgili makaleler