Method Article

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

DOI:

10.3791/64927

⸱

March 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare modelleri, retinal pigmentli epitelin (RPE) biyolojisini araştırmak için yararlı araçlar olabilir. Farelerin bir dizi RPE patolojisi geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, ışık, iletim elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak farelerde RPE patolojilerini aydınlatmak ve ölçmek için bir fenotipleme protokolü tarif ediyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), yaşlanan popülasyonlarda zayıflatıcı bir retina hastalığıdır. Retinal pigmente epitel (RPE) disfonksiyonunun YBMD'de önemli bir patobiyolojik olay olduğuna inanılmaktadır. RPE disfonksiyonuna yol açan mekanizmaları anlamak için, fare modelleri araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Önceki çalışmalarla, farelerin, bazıları AMD tanısı alan bireylerin gözlerinde gözlenen RPE patolojileri geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, farelerde RPE patolojilerini değerlendirmek için bir fenotipleme protokolü tanımlanmaktadır. Bu protokol, ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak retinal kesitlerin hazırlanmasını ve değerlendirilmesini ve ayrıca konfokal mikroskopi ile RPE düz montajlarının hazırlanmasını ve değerlendirilmesini içerir. Bu tekniklerle gözlemlenen yaygın murin RPE patolojileri türlerini ve bunları istatistiksel testler için tarafsız yöntemlerle ölçmenin yollarını detaylandırıyoruz. Kavram kanıtı olarak, bu RPE fenotipleme protokolünü, transmembran protein 135'i (Tmem135) aşırı eksprese eden farelerde ve yaşlı vahşi tip C57BL / 6J farelerde gözlenen RPE patolojilerini ölçmek için kullanıyoruz. Bu protokolün temel amacı, AMD'nin fare modellerini kullanan bilim adamları için standart RPE fenotipleme yöntemlerini tarafsız nicel değerlendirmelerle sunmaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), 55 yaşın üzerindeki popülasyonları etkileyen yaygın bir körleme hastalığıdır1. Birçok araştırmacı, retinal pigmentli epitel (RPE) içindeki disfonksiyonun AMD2'de erken ve önemli bir patobiyolojik olay olduğuna inanmaktadır. RPE, komşu fotoreseptörlerin ve koroidal kan damarlarının homeostazını korumakla görevli polarize hücrelerin tek katmanlıdır3. RPE içindeki hastalıkla ilişkili mekanizmaları araştırmak için, hücre kültürü modelleri 4,5 ve fareler 6,7,8 dahil olma....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan denekleri içeren tüm prosedürler, Wisconsin-Madison Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır ve Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Beyanı ile uyumludur.

1. Fare RPE'sinin ışık mikroskobu ile değerlendirilmesi

  1. Bir cam şişede oda sıcaklığında (RT) son konsantrasyonu% 2 paraformaldehit ve% 2 glutaraldehit içeren fiksatif bir tampon yapın.
    NOT: Bu protokol, fare başına en fazla 14 mL fiksatif arabellek gerektirir.
    DİKKAT: Paraformaldehit ve glutaraldehit tehlikeli maddelerdir. Lütfe....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede açıklanan RPE fenotipleme protokolünün tamamlanması, AMD'nin fare modellerinde yaygın olarak gözlenen yapısal RPE anormalliklerinin nicel bir analizini sağlar. Bu protokolün etkinliğini doğrulamak için, tavuk beta-aktin promotörü (Tmem135 TG)30 ve yaşlı C57BL / 6J fareleri31,32 tarafından tahrik edilen WT Tmem135'i aşırı eksprese eden transgenik fareler de dahil olmak üzere RPE patolojileri gösterdiği bilinen farelerde.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, fare modellerinin yapısal RPE patolojilerini değerlendirmek için bir fenotipleme protokolü tanıtıldı. Işık, transmisyon elektronu ve konfokal mikroskopi dahil olmak üzere çeşitli görüntüleme teknikleri için gözlerin işlenmesi için gerekli adımları ve bu görüntüleme yöntemleriyle gözlenen tipik patolojilerin nicelleştirilmesini tanımladık. RPE fenotipleme protokolümüzün etkinliğini, Tmem135 TG ve 24 aylık WT farelerini inceleyerek kanıtladık, çünkü bu fareler RPE patolojilerini

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün yazarlarının hiçbir açıklaması ve çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, dokularımızı ışık mikroskobu için hazırladıkları için Satoshi Kinoshita ve Wisconsin Üniversitesi (UW) Patolojide Translasyonel Araştırma Girişimleri laboratuvarına (TRIP) teşekkür etmek ister. Bu çekirdek, UW Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü, Wisconsin Üniversitesi Carbone Kanser Merkezi (P30 CA014520) ve Direktör-NIH Ofisi (S10OD023526) tarafından desteklenmektedir. Konfokal mikroskopi, UW Biyokimya Vakfı Bölümü'nün desteğiyle kurulan UW Biyokimya Optik Çekirdeği'nde gerçekleştirildi. Bu çalışma aynı zamanda Ulusal Göz Enstitüsü'nden (R01EY022086'dan A. Ikeda'ya; R01EY031748'den C. Bowes Rickman'a; P30EY016665 UW Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümüne....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 M Kakodilat Tamponu pH7.2PolyScientiifc R& DCompany S1619
100 Kapasiteli Slayt KutusuBu protokol için iki adet gereklidir (biri H & E lekeli kızaklar ve RPE düz montajlar için bir tane.)
% 100 Etanol &MDS Depo2292-CASEBu protokolde seyreltilmiş etanol çözeltileri yapmak için kullanılabilir.
1 Musluk, 2 Dişi Luer KilidiQosina11069
1x Fosfat Tampon Çözeltisi (PBS)Bu protokolde hazır 1x PBS kullanılabilir.
2.0 mL mikrotüplerGenesee Scientific 24-283-LR
24 Boşluk Gömme Kapsül İkame Kalıp ElektronMikroskobu Bilimleri70165
Luer Uçlu 24 inç PVC BoruFisher ScientificNC1376778
400 Mesh Gilder İnce Çubuk Kare Mesh IzgaralarElektron Mikroskobu BilimleriT400-Cu
%95 EtanolMDS Deposu2293-KASA
Su Geçirmez Nem Bariyerli Emici Alt Pedler (23 inç x 24 inç)VWR56616-031
Ayarlanabilir 237 ml  Sprey ŞişesiVWR23609-182
Alexa Fluor488 Konjuge Eşek anti-Tavşan IgG ve nbsp;Thermo Fisher ScientificA-21206
Alüminyum Folyo
BD Hassas kayma 19 Ölçer Şırınga İğnesiSigma-Aldrich 
eğrelti otu forseps; Kıvrımlı; İnce çapraz tırtıklar; 4" Uzunluk, 1 mm Uç GenişliğiRoboz Cerrahi AletRS-5211Bu protokolde kavisli forseps olarak bilinir.
Deve Kılı Fırça ElektronMikroskobu Bilimleri65575-02
Karbondioksit Ötenazi Odası
Karbondioksit Akış Ölçer
Karbondioksit Tankı
Castaloy Çatal Uzatma KelepçeleriFisher Scientific 05-769-7Q
Dökme Demir L-şekilli Taban Destek StandıFisher Scientific 11-474-207
Hücre Prolifer Programıİndirilebilir: https://cellprofiler.org/releases
Şeffaf Oje ElektronMikroskobu Bilimleri72180
Colorfrost Mikroskop Slaytları LavantaVWR10118-956
Bilgisayar
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
Bu protokolde Milli-Q Arıtma Sistemindendamıtılmış H20
Dumont İnce Uçlu Cımbız; Model #55Roboz Cerrahi AletRS-4984Bu protokolde ince uçlu forseps olarak bilinir ve bu protokol için 3 adet gereklidir (ikisi diseksiyon için ve biri elektron mikroskobu işlemi için).
Elektron Mikroskobu Izgara Tutucu ElektronMikroskobu Bilimleri71147-01
EPON 815 Reçine ElektronMikroskobu Bilimleri14910
Epredia Mark-It Doku İşaretleme SarıBoya Fisher Scientific 22050460Bu doku işaretleme boyasını kullanırken lütfen üreticinin protokolüne uyun.
Epredia Montaj OrtamıFisher Scientific22-110-610H & montajı için kullanın E slaytlar. 
Fiber-Lite Mi-150 Aydınlatıcı Serisi, 150 w Halojen Işık KaynağıDolan-Jenner IndustriesMi-150Diseksiyon mikroskobu için ışık kaynağı.
Fiji ImageJ Programıİndirilebilir: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Kanca KonektörüThermo Scientific   14-666-18Q
Çeker ocak
Glutaraldehit %2.5 Fosfat Tamponunda, pH 7.4, %32Elektron Mikroskobu Bilimleri16537-05
ORIUS (1000) CCD Kamera
ile JEM-1400 Transmisyon Elektron Mikroskobu (JEOL)Bu deneyler için iki tanesine ihtiyaç vardır. Biri oda sıcaklığında, diğeri ise 4 santigrat derece soğuk odada olmalıdır.
Lazer Cryo Etiket Etiketleri ElektronMikroskobu Bilimleri77564-05
Kurşun Sitrat ElektronMikroskobu Bilimleri17800
Leica EM UC7Ultramikrotom
Leica Reichert Ultracut S Mikrotom
KaldırıcıSliplerThermo Fisher Bilimsel22X22I24788001LSYükseltilmiş kenarlara sahip oldukları ve RPE'nin kalınlığına uydukları için RPE düz montajları için bu lameller kullanın.
Mayer'in Hematoksilen VWR100504-406
McPherson-Vannas Mikro Diseksiyon Yaylı MakasRoboz Cerrahi AletRS-5600Protokolde mikro diseksiyon makası olarak bilinir.
MetanolFisher Scientific A412-4
FarelerHerhangi bir AMD fare modeli ve ilgili kontrolleri bu protokol için çalışabilir.
Mikro Diseksiyon Makasları; Standart versiyon; Kıvrımlı; Keskin noktalar; 24 mm Bıçak Uzunluğu; 4.5" Toplam UzunlukRoboz Cerrahi AletRS-5913Bu protokolde kavisli makas olarak bilinir.
Microsoft Excel
Mikrotüp rafları
Nikon A1RS Konfokal Mikroskop
Normal Eşek SerumuSouthernBiotech0030-01
Numara 11 Steril Tek Kullanımlık Neşter BıçaklarıVWR21909-380
Osmiyum Tetroksit Elektron Mikroskobu Bilimleri19150
Paraformaldehit, %32Elektron Mikroskobu Bilimleri15714-S
Kalem
Petri KabıVWR 21909-380
Pipet Uçları
Pipetler 
Poliklonal Anti-ZO-1 AntikorThermo Fisher Scientific402200
Propilen Oksit ElektronMikroskobu Bilimleri20412
Tıraş BıçağıVWR10040-386
Fare Perfüzyonları
Shandon Eosin Y AlkollüVWR89370-828
Sharpie Ultra İnce Uçlu Siyah Kalıcı MarkerZımba642736
Boyama için Sürgülü RafGrainger 49WF31
Kare Kapak Cam SlipsFisher Scientific 12-541B
Kapaklı Boyama KabıGrainger49WF30H & için 15'e İhtiyaç Var E boyama prosedürü.
Hedef Tamamen Plastik Tek Kullanımlık Luer-Slip 50 mL Şırınga Termo Bilimsel S7510-50Yalnızca şırınga haznesini kullanın.
ZamanlayıcıFisher1464917
Uranil Asetat ElektronMikroskobu Bilimleri22400
Vakumlu Fırın
Vectashield Montaj OrtamıVektör LaboratuvarlarıH-1000RPE düz montajları monte etmek için kullanın.
KsilenFisher Bilimsel 
Zeiss Axio Imager 2 Işık MikroskobuBu mikroskop, dikişli 20x görüntü oluşturma kapasitesine sahiptir. Bir ışık mikroskobu bu kapasiteye sahip değilse, tüm retinanın birbiriyle hafifçe örtüşen görüntülerini alın. Bu görüntüleri birleştirmek için Adobe Photoshop'u kullanın. Görüntü birleştirme için lütfen Adobe Photoshop programının kılavuzlarına bakın.
Zeiss Stemi 2000 Diseksiyon Mikroskobu ElektronMikroskobu Bilimleri65575-02
Z192546 Su kullanılmıştır.Laboratuvarı Tezgah Üstü Çalkalayıcıİçin Sığ Tepsi22050283

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. The Lancet. Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  2. Bhutto, I., Lutty, G.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal Pigmented EpitheliumAge Related Macular DegenerationMouse ModelsRPE PathologiesLight MicroscopyTransmission Electron MicroscopyConfocal MicroscopyCardiac PerfusionRPE QuantificationMolecular Pathways

Related Articles