Yöntem makalesi

Kardiyak aritmilerin karmaşık mekanizmalarını araştırmak için yenilikçi bir araç seti

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64932

⸱

10 Şubat 2023

1Department of Medicine I, University Hospital Munich (LMU), Ludwig-Maximilians-University Munich (LMU), 2Institute of Surgical Research at the Walter-Brendel-Centre of Experimental Medicine, University Hospital, LMU Munich, 3DZHK (German Centre for Cardiovascular Research) Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), 4Interfaculty Center for Endocrine and Cardiovascular Disease Network Modelling and Clinical Transfer (ICONLMU), LMU Munich

Bu makalede

Özet

TARTIŞILAN MAKALELER:

Tomsits, P., Schuttler, D., Kaab, S., Clauss, S., Voigt, N. Ca2+ geçici akımlarının ve L-Tipi kalsiyum akımının eşzamanlı ölçümleri için yüksek kaliteli murin atriyal ve ventriküler miyositlerin izolasyonu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (165), 10.3791/61964 (2020).

Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerde Tek Hücreli optik aksiyon potansiyeli ölçümü. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (166), 10.3791/61890 (2020).

Xia, R. ve ark. Murin sinoatriyal ve atriyoventriküler düğümden yerleşik kardiyak makrofajların izolasyonu ve kültürü. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (171), 10.3791/62236 (2021).

Xia, R. et al. Farede Whole-Mount immünofloresan boyama, konfokal görüntüleme ve sinoatriyal ve atriyoventriküler düğümün 3D rekonstrüksiyonu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (166), 10.3791/62058 (2020).

Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. Farelerde içsel kardiyak kalp pili yapma kusurlarını tanımlamak için sinoatriyal düğüm ateşleme hızının mikroelektrot dizisi kaydı. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (173), 10.3791/62735 (2021).

Scherschel, K. et al. Murin stellat ganglionunun yeri, diseksiyonu ve analizi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (166), 10.3791/62026 (2020).

Shimura, D., Hunter, J., Katsumata, M., Shaw, R. M. Tam uzunlukta proteinin ekspresyonunu korurken mRNA'dan dahili bir translasyonel başlangıç bölgesinin çıkarılması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (181), 10.3791/63405 (2022).

Rotzer, RD ve ark. Bilinçli farelerde spontan barorefleks duyarlılığını belirlemek için kombine telemetrik EKG ve kan basıncı vericilerinin implantasyonu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (168), 10.3791/62101 (2021).

Tomsits, P. et al. Farelerde aritmileri tespit etmek için uzun süreli elektrokardiyografi kayıtlarının analizi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (171), 10.3791/62386 (2021).

Grab, M. ve ark. Girişimsel planlama ve eğitim için 3D baskılı kardiyovasküler fantomların geliştirilmesi ve değerlendirilmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (167), 10.3791/62063 (2021).

Editöryal

Aritmiler çok yaygındır ve klinik olarak oldukça önemlidir; Bununla birlikte, çoğu terapötik strateji, aritmilerin nedensel mekanizmalarını hedeflemek yerine yalnızca semptomlara odaklandığından, mevcut tedavi büyük ölçüde yetersiz kalmaktadır. Bu nedenle, yeni, yenilikçi ve nedensel tedaviler geliştirmek için karmaşık hastalık mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına acilen ihtiyaç vardır.

Mevcut JoVE yöntemleri koleksiyonunun amacı, aritmogenezin çeşitli yönlerini kapsamlı bir şekilde araştırmaya izin veren tarafsız ve çeşitli bir protokol seti sağlamaktır.

Değişmiş bir kalsiyum homeostazı, aritmogenezin ayırt edici özelliklerinden biridir, ancak her biri 1,2'yi incelemek için özel teknikler gerektiren birden fazla yönün dikkate alınması gerektiğinden araştırılması zor olmaya devam etmektedir. Bu yöntem koleksiyonunda, Tomsits ve ark. aynı fareden atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerin izolasyonuna ve hem L-tipi kalsiyum akımının hem de kalsiyum geçişlerinin aynı anda çalışmasına izin veren bir protokol sağlar3. Böylece bu protokol, araştırmacıların kalsiyum bozukluklarını küresel olarak daha fazla araştırmasına ve aynı zamanda hayvan sayısını azaltmasına olanak tanıyor ki bu da önemli bir bilimsel ve etik gelişmeyi temsil ediyor.

Bununla birlikte, izole edilmiş hücrelerin yamalanması karmaşık, emek yoğun ve düşük verimli deneyler olmaya devam etmektedir4. Bunu ele almak için, Seibertz ve ark. insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde aksiyon potansiyellerini ölçmek için voltaja duyarlı bir boya kullanan bir protokol sağlar5. Teknik, kapsamlı bir eğitim gerektirmediğinden (yama kenetleme için gerektiği gibi) ve nispeten düşük maliyetli bir deney düzeneği kullanılarak uygulanabildiğinden, bu protokolün geniş uygulamaları vardır.

Kardiyomiyositlerin yanı sıra diğer hücre tipleri (örneğin fibroblastlar veya makrofajlar) da elektrofizyolojide önemli bir rol oynar 6,7,8. İletim sistemindeki hücre tipine özgü etkileri araştırmak için, Xia ve ark. farelerde sinüs düğümünü (SAN) ve atriyoventriküler düğümü (AVN) tanımlamak için adım adım bir kılavuz sağlar 9,10, ardından makrofajları9 izole etmek ve incelemek için mikrodiseksiyon ve floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması (FACS) veya tam montajlı immünofloresan görüntüleme ile. Bu, farklı hücre tiplerinin tanımlanmasına, üç boyutlu yapının değerlendirilmesine ve SAN/AVN10 içinde hücre tipine özgü protein ekspresyonunun incelenmesine izin verir.

Ayrıca, Kumar ve ark.11 tarafından sunulan bu tür tam montajlı preparatlar üzerinde çok elektrotlu dizi (MEA) kayıtları gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, nispeten hızlı ve basit olduğu ve aynı zamanda üstün uzamsal çözünürlük sağladığı için şu anda kullanılan tekniklere mükemmel bir ektir. Farmakolojik müdahalelere izin verir ve kalbin diğer spesifik bölgelerine (örneğin AVN) kolayca uygulanabilir.

Otonom sinir sistemi elektrofizyolojide12,13,14 önemli bir rol oynar ve sempatektomi 15,16,17,18 veya kardiyak gangliyonların ablasyonu19 gibi tedavi stratejileri mevcuttur. Bununla birlikte, özellikle otonom sinir sisteminin anatomik yapılarına farelerde kolayca erişilemediğinden, mekanik temel hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu sayıda, Scherschel ve ark. çeşitli hücre tiplerinde gen ve protein ekspresyonlarını incelemek için farelerde yıldız gangliyonların tanımlanmasına ve diseksiyonuna izin veren bir protokol sağlar20. Bu, otonom yeniden modellemenin yeni yönlerinin incelenmesine izin verecektir.

Elektrofizyolojiyi hücresel düzeyde incelemek, temel mekanizmaları incelemek için kritik öneme sahiptir. Bununla birlikte, hücresel bulguları doğrulamak ve tanımlanan hedef yapıların (pato-)fizyolojik uygunluğunu doğrulamak için hayvan modellerinde in vivo çalışmalara hala ihtiyaç vardır21. Fareler en yaygın olarak kullanılır, ancak özellikle transgenik farelerin üretimi karmaşıktır. Bu sayıda, Shimura ve ark. kesilmiş proteinlerin karmaşık düzenleyici rollerini ve etkilerini in vivo olarak spesifik olarak incelemek için CRISPR-Cas9 gen düzenlemesini kullanan bir protokol sunar. Bunun için, connexin-43'ü kodlayan GJA1 geninde tek nokta mutasyonu barındıran bir transgenik fare modeli ürettiler. Bu, tam uzunluktaki Cx43'ün düzenli bir ifadesiyle, ancak kesilmiş bir Cx4322'nin azaltılmış bir ifadesiyle sonuçlanır.

İn vivo çalışmaların en büyük sınırlamalarından biri, çeşitli elektrofizyolojik parametreleri etkileyebilecek ve bu nedenle 'gerçek' durumu temsil etmeyebilecek deneyler sırasında hayvanları uyuşturma ihtiyacıdır23,24. Telemetrik cihazlar ise uyanık ve serbestçe hareket eden farelerin birkaç haftadanaylara kadar uzun süreler boyunca incelenmesine izin verir 25,26. Rötzer ve ark. farelerde kalp atış hızı ve kan basıncını aynı anda kaydetmek için telemetrik cihazların nasıl implante edileceğini açıklar, bu da özellikle otonom sinir sisteminin ve barorefleks duyarlılığınınaraştırılmasına izin verir 27.

Telemetri cihazları çok güçlü araçlar olmasına rağmen, büyük bir zorluk devam etmektedir: bu büyük veri kümelerinin nasıl analiz edileceği. Bu sorunu çözmek için Tomsits ve ark. telemetrik EKG kayıtlarını standart yarı otomatik bir şekilde analiz etmek için bir protokol geliştirir28. Protokollerini takiben, araştırmacılar temel EKG parametrelerini (örneğin, kalp atış hızı veya PR aralığı) elde edebilir ve bireysel olarak tanımlanmış aritmileri (örneğin, duraklamalar, bradi-/taşikardi) tarayabilir. Daha da önemlisi, sinyal kalitesini iyileştirmeye yönelik bazı rehberlik de dahil olmak üzere, telemetrik EKG'leri kaydetme ve analiz etmenin zorluklarını ve tuzaklarını da tartışıyorlar.

Protez kapakçıklar gibi yeni geliştirilen tıbbi cihazlar, insan hastalarda uygulanmadan önce hayvan modellerinde kapsamlı bir şekilde test edilmektedir29. Bununla birlikte, sağlıklı hayvanlarda yapılan çalışmalar, özellikle daha önce ameliyat geçirmiş olan insan hastalara mükemmel bir şekilde tercüme edilemeyebilir30,31. Bu tür sınırlamaların üstesinden gelmek için, Grab ve ark. bireysel, hastaya özel kalp modellerinin 3D baskısı için bir protokol sağlar32. Modelleri elastiktir ve insan hastalara benzer hemodinamik özelliklerin yanı sıra biyomekanik özelliklere de benzer; Bu modeller, özellikle karmaşık anatomiye sahip hastalarda hekimlerin eğitilmesine, yeni girişimsel prosedürlerin veya cihazların test edilmesine ve bireyselleştirilmiş tedavi stratejilerinin planlanmasına olanak tanır.

Bu JoVE yöntemleri koleksiyonunda sağlanan protokoller, elektrofizyoloji ve aritmileri incelemede birçok araştırmacıyı destekleyecektir. Bu koleksiyonun en büyük gücü, geleneksel teknolojiler için iyileştirmeler ve yenilikler sağlaması, aynı zamanda aritmogenezin çeşitli yönlerini incelemek için yeni yaklaşımlar göstermesidir. Bu koleksiyon, bu karmaşık hastalıklar hakkındaki anlayışımızı genişletmeye ve nihayetinde aritmi hastaları için yenilikçi tedaviler geliştirmeye yardımcı olacaktır.

Açıklamalar

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazar, Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK; 81X2600255, 81X2600270, 81X2600266), Corona Vakfı (S199/10079/2019), ERA-NET Kardiyovasküler Hastalıklar (ERA-CVD; 01KL1910) ve Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Vakfı tarafından desteklenmiştir. Fon sağlayıcıların el yazmasının hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Kaynaklar

  1. Denham, N. C., et al. Calcium in the pathophysiology of atrial fibrillation and heart failure. Frontiers in Physiology. 9, 1380(2018).
  2. Grandi, E., et al. Human atrial action potential and Ca2+ model: sinus rhythm and chronic atrial fibrillation. Circulation Research. 109 (9), 1055-1066 (2011).
  3. Tomsits, P., Schuttler, D., Kaab, S., Clauss, S., Voigt, N. Isolation of high quality murine atrial and ventricular myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and L-Type calcium current. Journal of Visualized Experiments. (165), e61964(2020).
  4. Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145(2013).
  5. Seibertz, F., Reynolds, M., Voigt, N. Single-Cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (166), e61890(2020).
  6. Grune, J., et al. Neutrophils incite and macrophages avert electrical storm after myocardial infarction. Nature Cardiovascular Research. 1 (7), 649-664 (2022).
  7. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  8. Xia, R., et al. Cardiac macrophages and their effects on arrhythmogenesis. Frontiers in Physiology. 13, 900094(2022).
  9. Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), e62236(2021).
  10. Xia, R., et al. Whole-Mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), e62058(2020).
  11. Kumar, P., Si, M., Paulhus, K., Glasscock, E. Microelectrode array recording of sinoatrial node firing rate to identify intrinsic cardiac pacemaking defects in mice. Journal of Visualized Experiments. (173), e62735(2021).
  12. Chen, P. S., Choi, E. K., Zhou, S., Lin, S. F., Chen, L. S. Cardiac neural remodeling and its role in arrhythmogenesis. Heart Rhythm. 7 (10), 1512-1513 (2010).
  13. Fukuda, K., Kanazawa, H., Aizawa, Y., Ardell, J. L., Shivkumar, K. Cardiac innervation and sudden cardiac death. Circulation Research. 116 (12), 2005-2019 (2015).
  14. Gardner, R. T., Ripplinger, C. M., Myles, R. C., Habecker, B. A. Molecular mechanisms of sympathetic remodeling and arrhythmias. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (2), 001359(2016).
  15. Dusi, V., De Ferrari, G. M., Pugliese, L., Schwartz, P. J. Cardiac sympathetic denervation in channelopathies. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 27(2019).
  16. Dusi, V., et al. Left cardiac sympathetic denervation for long QT syndrome: 50 years' experience provides guidance for management. JACC Clinical Electrophysiology. 8 (3), 281-294 (2022).
  17. De Ferrari, G. M., et al. Clinical management of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia: The role of left cardiac sympathetic denervation. Circulation. 131 (25), 2185-2193 (2015).
  18. Schwartz, P. J., Ackerman, M. J. Cardiac sympathetic denervation in the prevention of genetically mediated life-threatening ventricular arrhythmias. European Heart Journal. 43 (22), 2096-2102 (2022).
  19. Qin, M., Zeng, C., Liu, X. The cardiac autonomic nervous system: A target for modulation of atrial fibrillation. Clinical Cardiology. 42 (6), 644-652 (2019).
  20. Scherschel, K., et al. dissection, and analysis of the murine stellate ganglion. Journal of Visualized Experiments. (166), e62026(2020).
  21. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nat Reviews. Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  22. Shimura, D., Hunter, J., Katsumata, M., Shaw, R. M. Removal of an internal translational start site from mRNA while retaining expression of the full-length protein. Journal of Visualized Experiments. (181), e63405(2022).
  23. Bennett, K., Lewis, K. Sedation and anesthesia in rodents. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 25 (1), 211-255 (2022).
  24. Poon, Y. Y., et al. Disproportional cardiovascular depressive effects of isoflurane: Serendipitous findings from a comprehensive re-visit in mice. Lab Animal (NY). 50 (1), 26-31 (2021).
  25. Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3260(2011).
  26. McCauley, M. D., Wehrens, X. H. Ambulatory ECG recording in mice. Journal of Visualized Experiments. (39), 10(2010).
  27. Rotzer, R. D., et al. Implantation of combined telemetric ECG and blood pressure transmitters to determine spontaneous baroreflex sensitivity in conscious mice. Journal of Visualized Experiments. (168), e62101(2021).
  28. Tomsits, P., et al. Analyzing long-term electrocardiography recordings to detect arrhythmias in mice. Journal of Visualized Experiments. (171), e62386(2021).
  29. Hytonen, J. P., Yla-Herttuala, S. Preclinical evaluation of coronary artery stents. Journal of Visualized Experiments. (186), e64038(2022).
  30. Gruzdeva, O. V., et al. Comparative analysis of the hemostasiological profile in sheep and patients with cardiovascular pathology as the basis for predicting thrombotic risks during preclinical tests of vascular prostheses. Sovremennye Tekhnologii v Meditsine. 13 (1), 52-56 (2021).
  31. Weisskopf, M., Kron, M., Giering, T., Walker, T., Cesarovic, N. The sheep as a pre-clinical model for testing intra-aortic percutaneous mechanical circulatory support devices. The International Journal of Artificial Organs. 44 (10), 703-710 (2021).
  32. Grab, M., et al. Development and evaluation of 3D-printed cardiovascular phantoms for interventional planning and training. Journal of Visualized Experiments. (167), e62063(2021).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Cardiac MyocytesElectrocardiographyPacemaking DefectsCalcium CurrentOptical Action PotentialCardiac MacrophagesImmunofluorescence StainingMicroelectrode ArrayBaroreflex Sensitivity3D-printed Cardiovascular PhantomsSinoatrial NodeAtrioventricular Node
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.