Method Article

Drosophila larvalarında nöromüsküler kavşakların transmisyon elektron mikroskobu için numune hazırlama sürecinin optimize edilmesi

DOI:

10.3791/64934

⸱

September 15th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, Drosophila Larvalarında nöromüsküler kavşakları görselleştirmek için yeni bir numune hazırlama prosedürü sunmaktadır. Bu yöntem, geleneksel yönteme kıyasla örneklerin kıvrılmasını önlemede daha etkilidir ve özellikle Drosophila nöromüsküler kavşak ultrastrüktürel analizi için yararlıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ), sinirbilim alanında değerli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila NMJ'de konfokal mikroskopi uygulaması, araştırmacıların hem sinaps bolluğu hakkındaki nicel verileri hem de morfolojilerine ilişkin ayrıntılı bilgileri kapsayan sinaptik bilgi edinmelerini sağlar. Bununla birlikte, TEM'in dağınık dağılımı ve sınırlı görsel aralığı, ultrastrüktürel analiz için zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma, geleneksel yaklaşımı aşan yenilikçi ve verimli bir numune hazırlama yöntemini tanıtmaktadır. Prosedür, düz tabanlı bir şişenin veya test tüpünün tabanına metal bir ağ yerleştirilerek başlar, ardından sabit larva örneklerini ağ üzerine yerleştirir. Numunelerin üzerine ek bir ağ yerleştirilir ve iki ağ arasına yerleştirilmelerini sağlar. Sabitlenen numuneler, gömme prosedürüne devam etmeden önce iyice kurutulur ve sızar. Daha sonra numunelerin epoksi reçineye gömülmesi, konumlandırma ve kesitleme için kasların hazırlanmasına izin veren düz bir tabaka şeklinde gerçekleştirilir. Bu adımlardan yararlanarak, Drosophila larvalarının tüm kasları ışık mikroskobu altında görselleştirilebilir, böylece sonraki konumlandırma ve kesitleme işlemleri kolaylaştırılır. Fazla reçine, A2 ve A 3 vücut segmentlerinin 6. ve 7. kasları yerleştirildikten sonra çıkarılır. 6. veya 7. kasın seri ultra ince kesiti yapılır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektron mikroskobu, nano ölçekli seviye1'de hücrelerin iç yapısını görsel ve doğru bir şekilde gösterebilen biyolojik malzemelerin üst yapısını incelemek için en ideal yöntemlerden biridir. Bununla birlikte, numune hazırlama işleminin karmaşıklığı ve yüksek maliyeti nedeniyle, elektron mikroskobu ışık mikroskobu kadar popüler değildir. Elektron mikroskobu tekniklerindeki son gelişmeler, görüntü kalitesinde önemli gelişmelere yol açmış ve ilgili iş yükünde kayda değer bir azalmaya yol açmıştır. Sonuç olarak, elektron mikroskobu çeşitli alanlarda bilimsel bilginin ilerlemesinde önemli bir rol üstlenmiştir2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu makalede kullanılan transmisyon elektron mikroskobu numune hazırlama yöntemi daha önce bildirilmiştir16. Numuneye bağlı olarak reaktiflerin seçiminin ve dozajın ayarlanmasının gerekli olduğuna dikkat etmek önemlidir. Numune hazırlama sürecinde kullanılan birçok toksik kimyasal reaktif vardır, bu nedenle operatörün koruyucu giysi ve eldiven giymek ve çeker ocakta çalışmak gibi belirli koruyucu önlemleri alması gerekir.

1. Diseksiyon, fiksasyon ve yerleştirme işlemi

  1. Diseksiyonu
    1. Dolaşan 3. instar larvalarını Jan solüsyonunda inceleyin ve standart prosedürlere göre tüm vücut duva....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila larva vücut duvarı, düzenli bir düzende düzenlenmiş 30 tanımlanabilir kas lifinden oluşur ve diseksiyon ve fiksasyondan sonra ince bir dilim gibi görünür21 (Şekil 1A). Numune, metal ağların varlığından dolayı dehidrasyon işlemi sırasında düz kalır (Şekil 1B, C). Larva vücut kası, epoksi reçineden (Şekil 1D-G) yapılmış ince bir plakaya gömü.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila larva örnekleri, örnekler ince olduğu için dehidrasyon sırasında kıvrılma eğilimindedir, bu da nöromüsküler kavşağın doğru bir şekilde bulunmasını zorlaştırır, böylece örnek hazırlama için zorluğu ve iş yükünü artırır. Geleneksel iyileştirme, numune7'yi kısaltmaktır, ancak numuneler hala farklı derecelerde kıvrılmıştır.

Yöntemimizde iki kritik adım vardır: birincisi, metal ağların kısıtlanması nedeniyle numuneler dehidrasyon işlemi boyunca düz kalır........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı Hibe 32070811 ve Güneydoğu Üniversitesi (Çin) Analiz Test Fonu 11240090971 tarafından desteklenmiştir. Elektron Mikroskobu Laboratuvarı ve Morfolojik Analiz Merkezi, Tıp Fakültesi, Güneydoğu Üniversitesi, Nanjing, Çin'e teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-EpoksipropanSHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTDJYJ 037-2015Penetran Ajan
Drosophila Hisse SenetleriBloomingtonyokBu araştırmada kullanılan vahşi tip kontrol Drosophila suşlarının tümü W1118 idi ve standart kültür yöntemlerine göre yetiştirildi
Düz tabanlı cam test tüpleriHaimen Chenxing Deneysel ekipman Şirketi yokDüz tabanlı cam test tüpleri (şişe) sünger tapalı (veya şişe tıpalı)
K4M çapraz bağlayıcıve nbsp; Agar ScientificCat# 1924BGömme reçineleri, yüksek oranda çapraz bağlı bir akrilat ve metakrilat formülüne dayanmaktadır 
K4M reçinesi (monomer B)  Agar BilimselLot # 631557Reçine Monomer
Polivinil filmHaimen Chenxing Deneysel ekipman Şirketi YokŞeffaf polietilen film en iyisidir, yaklaşık 0,2 mm kalınlık
SPI Chem DDSASPISpI # 02827-AFDodecenyl Süksinik Anhidrit
SPI-Chem DMP-30 EpoksiSPI02823-DAHızlandırıcı
SPI-Chem NMASPISpI # 02828-AFMonomeri
için SertleştiriciÇelik hasır Yuhuiyuan Bahçecilik Mağazası (çevrimiçi)yokBakır veya paslanmaz çelik ağ
Transmisyon elektron mikroskobuHitachi H-765011416692Tüm ızgaralar (numunelerin toplandığı) kurşun sitrat ile boyandı ve bir transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemlendi.
Ultra ince mikrotomLeica UC7 ultra ince mikrotom595915Tüm kesit alma işlemleri, elmas bıçak kullanılarak bir Leica UC7 ultra ince mikrotom üzerinde gerçekleştirilir
Epoksi SPI-PON 812 Epoksi SPI SPI # 0259-AB Reçine

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
  2. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Me....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Neuromuscular JunctionTransmission Electron MicroscopySample PreparationUltra Thin SectioningEpoxy Resin EmbeddingConfocal MicroscopyMuscle PositioningMetal Mesh TechniqueLarval Body WallSynaptic Structure

Related Articles