Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Drosophila larvalarında nöromüsküler kavşakların transmisyon elektron mikroskobu için numune hazırlama sürecinin optimize edilmesi

1.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64934

⸱

15 Eylül 2023

 ,  ,  ,  , 
1The School of Medicine, Southeast University, 2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University, 3The School of Life Science and Technology, Southeast University

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Bu rapor, Drosophila Larvalarında nöromüsküler kavşakları görselleştirmek için yeni bir numune hazırlama prosedürü sunmaktadır. Bu yöntem, geleneksel yönteme kıyasla örneklerin kıvrılmasını önlemede daha etkilidir ve özellikle Drosophila nöromüsküler kavşak ultrastrüktürel analizi için yararlıdır.

Özet

Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ), sinirbilim alanında değerli bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila NMJ'de konfokal mikroskopi uygulaması, araştırmacıların hem sinaps bolluğu hakkındaki nicel verileri hem de morfolojilerine ilişkin ayrıntılı bilgileri kapsayan sinaptik bilgi edinmelerini sağlar. Bununla birlikte, TEM'in dağınık dağılımı ve sınırlı görsel aralığı, ultrastrüktürel analiz için zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma, geleneksel yaklaşımı aşan yenilikçi ve verimli bir numune hazırlama yöntemini tanıtmaktadır. Prosedür, düz tabanlı bir şişenin veya test tüpünün tabanına metal bir ağ yerleştirilerek başlar, ardından sabit larva örneklerini ağ üzerine yerleştirir. Numunelerin üzerine ek bir ağ yerleştirilir ve iki ağ arasına yerleştirilmelerini sağlar. Sabitlenen numuneler, gömme prosedürüne devam etmeden önce iyice kurutulur ve sızar. Daha sonra numunelerin epoksi reçineye gömülmesi, konumlandırma ve kesitleme için kasların hazırlanmasına izin veren düz bir tabaka şeklinde gerçekleştirilir. Bu adımlardan yararlanarak, Drosophila larvalarının tüm kasları ışık mikroskobu altında görselleştirilebilir, böylece sonraki konumlandırma ve kesitleme işlemleri kolaylaştırılır. Fazla reçine, A2 ve A 3 vücut segmentlerinin 6. ve 7. kasları yerleştirildikten sonra çıkarılır. 6. veya 7. kasın seri ultra ince kesiti yapılır.

Giriş

Elektron mikroskobu, nano ölçekli seviye1'de hücrelerin iç yapısını görsel ve doğru bir şekilde gösterebilen biyolojik malzemelerin üst yapısını incelemek için en ideal yöntemlerden biridir. Bununla birlikte, numune hazırlama işleminin karmaşıklığı ve yüksek maliyeti nedeniyle, elektron mikroskobu ışık mikroskobu kadar popüler değildir. Elektron mikroskobu tekniklerindeki son gelişmeler, görüntü kalitesinde önemli gelişmelere yol açmış ve ilgili iş yükünde kayda değer bir azalmaya yol açmıştır. Sonuç olarak, elektron mikroskobu çeşitli alanlarda bilimsel bilginin ilerlemesinde önemli bir rol üstlenmiştir2.

Drosophila, hedef genlerin uzamsal ve zamansal ifadesini hassas bir şekilde kontrol etmek için genetik manipülasyonlar yapmak için mükemmel bir hayvan modelidir3. Ayrıca Drosophila, memeli modellerine göre kısa büyüme periyodu ve kolay yetiştirme avantajlarına sahiptir; bu nedenle, Drosophila morfoloji araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır 4,5.

Drosophila larvalarında, nöromüsküler kavşak (NMJ) butonları kaslardayaygın olarak dağılmıştır 6,7 ve NMJ'nin immün boyanması, sinaps miktarı ve morfolojisi 8,9 hakkında kolayca bilgi sağlayabilir. A2 ve A3 segmentlerinin6 / 7 inci kaslarında bulunan NMJ boutonları, ışık mikroskobu kullanılarak yapılan kantitatif ve morfolojik araştırmalar için çok uygundur. Bunun nedeni büyüklükleri ve bolluklarıdır10,11. Bu nedenle, Drosophila larvaları NMJ'leri sinirbilim araştırmaları için yararlı bir model olarak kabul edilir12.

Bununla birlikte, TEM tarafından NMJ bouton üst yapısını gözlemlemek zordur. Transmisyon elektron mikroskobunun tarama penceresi dar olduğundan, yaygın olarak dağıtılan NMJ boutonları13'ü konumlandırmak zordur. Diğer bir neden ise, Drosophila vücut duvarının, numune hazırlama protokolü7'nin alkol dehidrasyon adımı sırasında kıvrılmaya duyarlı olmasıdır.

Geleneksel çalışmalar, bollukları ve büyüklükleri nedeniyle genellikle A,2 ve A 3 segmentlerinin 6. ve 7. kasları arasındaki boutonları örnek materyal olarak seçmiştir14,15. A, 2 ve A3 segmentlerinin 6. ve 7. kasları diğer kaslardan daha büyüktür ve daha fazla bouton içerir. Bununla birlikte, elektron mikroskobu için numuneler hazırlandığında, sabit numuneler incelme ve kıvrılmaya eğilimli olma eğilimindeydi, bu da A2 ve A 3 segmentlerinin 6. ve 7. kaslarının yanlış konumlandırılmasına yol açtı.

Bu vesileyle, geleneksel numune hazırlama yöntemine 7,16 kıyasla numunelerin kıvrılmasını önlemede daha etkili olan, numunelerin müteakip dehidrasyon sırasında düz kalmasına izin veren ve böylece Drosophila larva nöromüsküler kavşaklarının daha iyi konumlandırılmasını kolaylaştıran yeni bir işleme prosedürünü rapor ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bu makalede kullanılan transmisyon elektron mikroskobu numune hazırlama yöntemi daha önce bildirilmiştir16. Numuneye bağlı olarak reaktiflerin seçiminin ve dozajın ayarlanmasının gerekli olduğuna dikkat etmek önemlidir. Numune hazırlama sürecinde kullanılan birçok toksik kimyasal reaktif vardır, bu nedenle operatörün koruyucu giysi ve eldiven giymek ve çeker ocakta çalışmak gibi belirli koruyucu önlemleri alması gerekir.

1. Diseksiyon, fiksasyon ve yerleştirme işlemi

  1. Diseksiyonu
    1. Dolaşan 3. instar larvalarını Jan solüsyonunda inceleyin ve standart prosedürlere göre tüm vücut duvarını elde edin17. Jan'ın çözeltisini aşağıdaki gibi hazırlayın: 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 35mM sükroz, 5mM HEPES, pH 7.4
      NOT: Drosophila larvalarının vücut duvarı, meyve sineği Drosophila'nın larva aşamasının dış kaplamasını veya bütünlüğünü ifade eder. Bu, kütikül, epidermal hücreler ve larva dış iskeletini oluşturan alttaki dokuları içerir. Gövde duvarı yapısal destek ve koruma sağlar ve larva gövdesi ile dış ortam arasında bir bariyer görevi görür17.
  2. Fiksasyon
    1. Larva vücut duvarını sabitleyici ile gece boyunca 4 °C'de diseksiyon odasına sabitleyin. Fiksatifi hazırlamak için, 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7.4) %2 glutaraldehit ve %2 formaldehit karıştırın
    2. Numuneleri sodyum kakodilat tamponu ile birkaç kez durulayın.
    3. Kakodilat tamponunda% 1 OsO4 hazırlayın. Numuneleri 2 saat boyunca% 1 OsO4'te sabitleyin, ardından damıtılmış suda birkaç kez durulayın.
      NOT: Aldehitler ve OsO4 ile ikili fiksasyon, hücresel üst yapının daha iyi korunmasını sağlar. Ayrıca, OsO4 numune dokusunu lekeleyebilir ve ışık ile numune arasındaki kontrastın daha belirgin olmasını sağlar18.
    4. Drosophila nöromüsküler bileşke örneklerini 2 saat boyunca %2 doymuş uranil asetat ile boyayın, ardından deiyonize su ile birkaç durulama yapın (Şekil 1A).
  3. Örnek yerleştirme
    1. Makasla benzer boyutta (gözenek boyutu 270 μm) iki yuvarlak metal ağ parçası kesin.
    2. Düz tabanlı bir şişenin tabanına önceden metal bir ağ (270 μm) yerleştirin.
    3. Sabit larva örneklerini ağın üzerine yerleştirin ve ardından örneklerin iki ağ arasına yerleştirilmesi için üzerlerine başka bir ağ yerleştirin.

2. Dehidrasyon

NOT: Bu çalışmada etanol gradyan dehidrasyon yöntemi kullanılmıştır.

  1. Numuneleri, her biri 4 ° C'de 20 dakika boyunca sırayla (%50, %70, %85, %95 her birinde bir kez, %100 iki kez) artan bir etanol konsantrasyon gradyanında kurutun.
  2. Numuneleri oda sıcaklığında propilen oksit ile her seferinde 5 dakika boyunca iki kez durulayın (Şekil 1C).

3. Sızma

NOT: Sızma, TEM numunesinin hazırlanması için gerekli adımlardan biridir. İnfiltrasyon, hücre arasının gömme ortamı19 ile doldurulmasına izin vermek için dehidrasyon ortamının numunedeki gömme ortamı ile kademeli olarak değiştirilmesine izin verir.

  1. Numuneleri, her biri 1 saat boyunca 1: 1 ve 1: 2 oranında propilen oksit ve epoksi reçinenin karışık çözeltisine, ardından oda sıcaklığında 2 saat boyunca saf epoksi reçineye yerleştirin.

4. Gömme

  1. Bir polietilen film hazırlayın ve büyük bir kare (yaklaşık 5 × 5 cm) ve küçük bir içi boş dikdörtgen destek (yaklaşık 2 × 2 cm) şeklinde kesin. Küçük kareyi büyük kareyle yapıştırın.
  2. Yeterli epoksi reçineyi büyük karenin ortasına önceden yerleştirin.
  3. Numuneleri, kas tarafı yukarı bakacak şekilde önceden konumlandırılmış epoksi reçineye yerleştirin. Bir stereoskop kullanın.
  4. Numunelere birkaç damla reçine ekleyin ve ardından bunları PE film (ara parçadan biraz daha büyük) ile kaplayın (Şekil 1D-E).
  5. Numuneleri sırasıyla 37 °C, 42 °C ve 60 °C'de 24 saat polimerize edin (Şekil 1F).

5. Bölümlendirme prosedürü

  1. Larva gövde duvarının fazla kısımlarını keskin bir bıçakla çıkarın ve A2 / A3 segmenti de dahil olmak üzere bir yamuk tutun.
    NOT: Üst çizgi 13.kasın yakınında olmalı ve taban çizgisi numuneden epoksi reçinesine kadar uzakta olmalıdır. Üst çizgi ile taban çizgisi arasındaki yükseklik yaklaşık 5-8 mm'dir.
  2. Numunenin geri kalanından yamuğu çıkarın ve A/B yapıştırıcısı ile reçine dolgulu kapsüle yapıştırın.
  3. Işık mikroskobu altında A,2 ve A 3 segmentlerinin 6. ve 7. kaslarının pozisyonunu onaylayın (Şekil 1G) ve teğet düzlemini 6. kasa paralel tutun.
  4. Numunenin beşte birini A3 segmentinin iki tarafı boyunca kesin.
    NOT: 6. kasın çoğunu çıkarın ve 7. kasın genişliğinin 1 / 3'ünü koruyun.
  5. Ultra ince bir mikrotom kullanarak, 6. kastan başlayarak numunenin ultra ince bir bölümünü hazırlayın.
    NOT: Her dilim yaklaşık 90 nm kalınlığındadır.
  6. Her bakır ağa mümkün olduğunca çok dilim tutturulur.
  7. Transmisyon elektron mikroskobunu daha önce açıklandığı gibi gerçekleştirin16.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Drosophila larva vücut duvarı, düzenli bir düzende düzenlenmiş 30 tanımlanabilir kas lifinden oluşur ve diseksiyon ve fiksasyondan sonra ince bir dilim gibi görünür21 (Şekil 1A). Numune, metal ağların varlığından dolayı dehidrasyon işlemi sırasında düz kalır (Şekil 1B, C). Larva vücut kası, epoksi reçineden (Şekil 1D-G) yapılmış ince bir plakaya gömü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Drosophila larva örnekleri, örnekler ince olduğu için dehidrasyon sırasında kıvrılma eğilimindedir, bu da nöromüsküler kavşağın doğru bir şekilde bulunmasını zorlaştırır, böylece örnek hazırlama için zorluğu ve iş yükünü artırır. Geleneksel iyileştirme, numune7'yi kısaltmaktır, ancak numuneler hala farklı derecelerde kıvrılmıştır.

Yöntemimizde iki kritik adım vardır: birincisi, metal ağların kısıtlanması nedeniyle numuneler dehidrasyon işlemi boyunca düz kalır....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Doğa Bilimleri Vakfı Hibe 32070811 ve Güneydoğu Üniversitesi (Çin) Analiz Test Fonu 11240090971 tarafından desteklenmiştir. Elektron Mikroskobu Laboratuvarı ve Morfolojik Analiz Merkezi, Tıp Fakültesi, Güneydoğu Üniversitesi, Nanjing, Çin'e teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,2-EpoksipropanSHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTDJYJ 037-2015Penetran Ajan
Drosophila Hisse SenetleriBloomingtonyokBu araştırmada kullanılan vahşi tip kontrol Drosophila suşlarının tümü W1118 idi ve standart kültür yöntemlerine göre yetiştirildi
Düz tabanlı cam test tüpleriHaimen Chenxing Deneysel ekipman Şirketi yokDüz tabanlı cam test tüpleri (şişe) sünger tapalı (veya şişe tıpalı)
K4M çapraz bağlayıcıve nbsp; Agar ScientificCat# 1924BGömme reçineleri, yüksek oranda çapraz bağlı bir akrilat ve metakrilat formülüne dayanmaktadır 
K4M reçinesi (monomer B)  Agar BilimselLot # 631557Reçine Monomer
Polivinil filmHaimen Chenxing Deneysel ekipman Şirketi YokŞeffaf polietilen film en iyisidir, yaklaşık 0,2 mm kalınlık
SPI Chem DDSASPISpI # 02827-AFDodecenyl Süksinik Anhidrit
SPI-Chem DMP-30 EpoksiSPI02823-DAHızlandırıcı
SPI-Chem NMASPISpI # 02828-AFMonomeri
için SertleştiriciÇelik hasır Yuhuiyuan Bahçecilik Mağazası (çevrimiçi)yokBakır veya paslanmaz çelik ağ
Transmisyon elektron mikroskobuHitachi H-765011416692Tüm ızgaralar (numunelerin toplandığı) kurşun sitrat ile boyandı ve bir transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemlendi.
Ultra ince mikrotomLeica UC7 ultra ince mikrotom595915Tüm kesit alma işlemleri, elmas bıçak kullanılarak bir Leica UC7 ultra ince mikrotom üzerinde gerçekleştirilir
Epoksi SPI-PON 812 Epoksi SPI SPI # 0259-AB Reçine

Kaynaklar

  1. Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
  2. Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
  3. Winans, N. J., et al. A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria. Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).
  4. Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
  5. Cardona, A., et al. An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy. PLoS Biology. 8 (10), (2010).
  6. Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction. Cell Reports. 34 (7), 108753(2021).
  7. Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions. Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).
  8. Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction. Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19(2020).
  9. Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).
  10. Ashley, J., et al. Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons. Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).
  11. Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
  12. Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).
  13. Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions. Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).
  14. Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).
  15. McCabe, B. D., et al. The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).
  16. Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy. Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).
  17. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. Journal of Visualized Experiments. (24), e1107(2009).
  18. Lovrić, J., et al. Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS. Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).
  19. Woods, P. S., Ledbetter, M. C. Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope. Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).
  20. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).
  21. Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).
  22. Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).
  23. Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability. Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).
  24. Zhang, X., et al. Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction. Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).
  25. Wu, S., et al. A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila. Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).
  26. Gan, G., Lv, H., Xie, W. Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil. PLoS One. 9 (8), 105497(2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming

to:

Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan

Etiketler

Drosophila Nöromüsküler BileşkesiUltra İnce KesişlemeEpoksi Reçine GömmeKonfokal MikroskopiKas KonumlandırmaMetal Ağ TekniğiLarval Vücut DuvarıSinaptik Yapı
Drosophila larvalarında nöromüsküler kavşakların transmisyon elektron mikroskobu için numune hazırlama sürecinin optimize edilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.