Yöntem makalesi

eGFP'nin Yapısal Ekspresyonu ile Leishmania Tür Suşlarının Gelişimi

DOI:

10.3791/64939

⸱

21 Nisan 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Biología Celular y Molecular de Enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 2Departamento de Medios y Creativo, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 3Sistema Nacional de Investigación-Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SNI-SENACYT)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, pLEXSY sistemini kullanarak eGFP genini stabil bir entegre transgen olarak eksprese eden L. panamensis ve L . donovani suşlarını oluşturmak için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Transfekte edilen parazitler, seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve her iki türde de en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar, ilaç tarama testlerinde daha fazla kullanılmak üzere seçildi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmania cinsinin protozoan parazitleri, dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen değişken klinik belirtilere sahip bir hastalık olan leishmaniasis'e neden olur. L. donovani enfeksiyonu ölümcül iç organ hastalığına neden olabilir. Panama, Kolombiya ve Kosta Rika'da, L. panamensis bildirilen kutanöz ve mukokutanöz leishmaniasis vakalarının çoğundan sorumludur. Bugüne kadar mevcut olan metodolojilerle çok sayıda ilaç adayını incelemek, bileşiklerin parazitin hücre içi formlarına karşı aktivitesini değerlendirmek veya in vivo tahliller yapmak için çok zahmetli oldukları göz önüne alındığında oldukça zordur. Bu çalışmada, 18S rRNA'yı (ssu) kodlayan lokusa entegre edilmiş gelişmiş bir yeşil floresan proteini (eGFP) kodlayan genin yapısal ekspresyonu ile L. panamensis ve L. donovani suşlarının oluşumunu açıklıyoruz. eGFP'yi kodlayan gen, ticari bir vektörden elde edildi ve onu zenginleştirmek ve BglII ve KpnI enzimleri için kısıtlama bölgeleri eklemek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edildi. eGFP amplisonu, agaroz jel saflaştırması ile izole edildi, BglII ve KpnI enzimleri ile sindirildi ve daha önce aynı enzim seti ile sindirilmiş Leishmania ekspresyon vektörü pLEXSY-sat2.1'e bağlandı. Klonlanmış gen ile ekspresyon vektörü E. coli'de çoğaltıldı, saflaştırıldı ve ekin varlığı koloni PCR ile doğrulandı. Saflaştırılmış plazmit doğrusallaştırıldı ve L. donovani ve L. panamensis parazitlerini transfekte etmek için kullanıldı. Genin entegrasyonu PCR ile doğrulandı. eGFP geninin ekspresyonu akım sitometrisi ile değerlendirildi. Floresan parazitler seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar akış sitometrisi kullanılarak seçildi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmania cinsinin protozoan parazitleri, çok çeşitli klinik belirtileri olan bir hastalık olan leishmaniasis'e neden olur. Bu hastalık 98 ülkede yaygındır ve yıllık insidansının 0,9 ila 1,6 milyon vaka olduğu tahmin edilmektedir1. İnsanlar için patojenik olan Leishmania türleri, L olmak üzere iki alt türe ayrılır. (Leishmania) ve L. (Viyana). L'ye ait bazı türlerle enfeksiyon. L. donovani ve L. infantum gibi (Leishmania) alt cinsi, tedavi edilmezse ölümcül olan visseral leishmaniasis (VL) ile sonuçlanabilir2. L'ye ait tür....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Numuneleri steril tutmak için, parazit kültürünü içeren tüm adımlar bir biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) başlığı içinde veya yerel sağlık ve güvenlik yönetmeliklerine göre gerçekleştirilmelidir. Bu protokolün grafiksel bir özeti Şekil 1'de bulunabilir.

figure-protocol-1
Şekil 1: pLEXSY-2.1 vektör ailesini kullanarak eGFP eksprese eden L. panamensis ve L. donovani parazitleri oluşturmak için protokolün özet şeması.<....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

pLEXSY-eGFP yapısını oluşturduktan ve yetkin E. coli hücrelerini dönüştürdükten sonra, yapıyı eGFP eki ile içeren koloniler, bölüm 1.2'de açıklanan koloni PCR'sini çalıştırdıktan sonra yaklaşık 859 bp'lik bir ürün üretecektir (Şekil 3A). SwaI kullanılarak pozitif kolonilerden saflaştırılmış plazmitin toplam sindirimi, jel elektroforezinde iki karakteristik fragman, PLEXSY vektörünün E. coli'de replikasyon ve seçim için gerekli tüm elementleri içeren kısmı olan 2.9 .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli raportör genlerin avantajları ve dezavantajları çeşitli protozoan parazitlerde incelenmiştir. Bunlar arasında, GFP ve eGFP doğası gereği floresandır ve kolay miktar belirleme ve görüntülemeye izin verir. Bu proteinlerin floresan aktivitesi, floresan mikroskobu, florimetri veya akış sitometrisi kullanılarak minimum manipülasyon ile tespit edilebilir. GFP eksprese eden L üretmek için çok az çalışma yapılmıştır. (Viannia) suşları, GFP ve türevlerinin Eski Dünya Leishmania türlerinde raport.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panama, NI-177-2016 hibe numarası ve Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panama, hibe numaraları SNI-169-2018, SNI-008-2022 ve SNI-060-2022 tarafından finanse edilmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 KuyuluMikroplakalar CorningCLS3340Düz dipli şeffaf, siyah polistiren, steril, kapaklı
AgarozSigma-AldrichA4718
Ampisilin sodyum tuzuSigma-AldrichA8351BioXtra, hücre kültürü
BglII kısıtlama enzimiiçin uygun New England BioLabsR0144S2.000 birim. 10.000 birim / mL
Hücre Kültürü ŞişeleriCorningCLS430168Yüzey alanı 25 cm2, eğimli boyun, kapak (tapa contası)
ChemiDoc Görüntüleme SistemiBio-Rad17001401
CyFlow SpaceSysmexMevcut
D-(+)-GlukozSigma-AldrichG7021toz, BioReagent, hücre kültürü için uygun, böcek hücre kültürü için uygun, bitki hücre kültürü için uygun, & % 99,5
Fetal Sığır SerumuSigma-AldrichF7524
Jel Yükleme TamponuSigma-AldrichG2526  Migrasyon hızı jel bileşimine göre değişir. Yüklemeden önce numune ile 1:3 ila 1:6 oranında seyreltin.
Gene Pulser Xcell Elektroporasyon SistemiBio-Rad1652660Sistem bir ana ünite, iki aksesuar modülü, kapasitans genişletici (CE modülü) ve darbe kontrolörü (PC modülü) ve bir ShockPod küvet odasından oluşur.
Gene Pulser/MicroPulser Elektroporasyon KüvetleriBio-Rad165208650, 0,2 cm– memeli ve diğer ökaryotik hücreler için Gen Pulser ve MicroPulser Sistemleri ile kullanım için boşluk steril elektroporasyon küveti
Gentamisin çözeltisiSigma-AldrichG139750 mg / mL deiyonize su, sıvı, 0.1 & mu; m filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygun
GoTaq Long PCR Master MixPromegaM4021
HEPES çözeltisiSigma-AldrichH08871 M, pH 7.0-7.6, steril filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygun
Ters mikroskopOlympusIXplore Standard
KpnI-HF kısıtlama enzimiNew England BioLabsR3142S4.000 birim. 20.000 birim / mL
LB Agarlı etsuyu Sigma-AldrichL3147Agarlı, yüksek referanslı, besin açısından zengin mikrobiyal büyüme tozu ortamı, düzenli  E.coli  kültür.
LB Et suyu Sigma-AldrichL2542Sıvı mikrobiyal büyüme ortamı
Mini-Sub Cell GT Yatay Elektroforez SistemiBio-Rad1640300Mini yatay elektroforez sistemi, 8 ve 15 oyuklu taraklar, 7 cm x 10 cm UV şeffaf tepsi
içerir pEGFP-N1-1xAddgene17228150 bazlık bir dizinin 1 tandem tekrarı ile kaynaşmış eGFP mRNA'sını eksprese eder
pLEXSYcon2.1 ekspresyon kitiJena BiyobilimEGE-1310satBütünleştirici kurucu ifade vektörü pLEXSY-sat2.1 içerir. Nourseothrisin (NTC, clonNAT) ile transfektanların antibiyotik seçimi. Tanısal PCR'ler ve dizileme için tüm primerleri içerir.
Potasyum KlorürMillipore529552Moleküler Biyoloji Sınıfı - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plazmid Miniprep SistemiPromegaA122215 & mu'ya kadar; 3 mL kültürden g Transfeksiyona Hazır Plazmit.
Schneider ve Başbakan; Böcek OrtamıSigma-AldrichS0146Laboratuvarımızda Leishmania kültürü için kullanılan ortam.
SOC OrtaSigma-AldrichS1797
Sodyum klorürSigma-AldrichS3014, hiçbiri tespit edilmedi, > % 99 (titrasyon)
Sodyum fosfat dibazikSigma-AldrichRDD038BioReagent, hücre kültürü için uygun, böcek hücre kültürü için uygun, vb; %99,0, serbest akışlı, Redi-Dri
SwaI kısıtlama enzimiNew England BioLabsR0604S2.000 birim. 10.000 birim / mL
Şırınga filtreleriCorningCLS431212rejenere selüloz membran, çap 4  mm, gözenek boyutu 0.2  μ m
T100 Termal DöngüleyiciBio-Rad1861096Termal döngüleyici sistemi, 96 kuyulu termal döngüleyici, güç kablosu, tüp destek halkası içerir
T4 DNA LigazPromegaM1801Yapışkan veya künt uçlu iki DNA zincirini birleştirir
Tris-Borat-EDTA tamponuSigma-AldrichT4415BioReagent, elektroforez için uygun, 10 kez; konsantre
Sihirbaz Genomik DNA Arıtma KitiPromegaA1120
Wizard SV Jel ve PCR Temizleme SistemiPromegaA9285
XL10-Gold Ultrayetkin HücrelerAgilent200317XL10-Gold Kanr Ultrayetkin Hücreler, 10 x 0.1 mL. Kloramfenikol dirençli vektörlerde son derece zorlu klonlama için F' epizomundaki kanamisin dirençli geni içerir. Verimlilik: > 5 x 10 9 dönüştürücü /&mikro; g pUC18 DNA'sı.
değilMoleküler biyoloji, DNaz, RNaz ve proteaz için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671(2012).
  2. Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243(2020).
  3. Saldaña, A., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Leishmania Su lareGFP EkspresyonuAk SitometrisiParazit TransfeksiyonuRekombinant ParazitlerPolimeraz Zincir ReaksiyonuPlazmid Lineerizasyonula Tarama AnalizleriPromastigot KlonlamaAgaroz Jel Purifikasyonu

İlgili makaleler