Yöntem makalesi

eGFP'nin Yapısal Ekspresyonu ile Leishmania Tür Suşlarının Gelişimi

DOI:

10.3791/64939

⸱

21 Nisan 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Biología Celular y Molecular de Enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 2Departamento de Medios y Creativo, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT-AIP), 3Sistema Nacional de Investigación-Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SNI-SENACYT)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, pLEXSY sistemini kullanarak eGFP genini stabil bir entegre transgen olarak eksprese eden L. panamensis ve L . donovani suşlarını oluşturmak için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Transfekte edilen parazitler, seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve her iki türde de en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar, ilaç tarama testlerinde daha fazla kullanılmak üzere seçildi.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmania cinsinin protozoan parazitleri, dünya çapında milyonlarca insanı etkileyen değişken klinik belirtilere sahip bir hastalık olan leishmaniasis'e neden olur. L. donovani enfeksiyonu ölümcül iç organ hastalığına neden olabilir. Panama, Kolombiya ve Kosta Rika'da, L. panamensis bildirilen kutanöz ve mukokutanöz leishmaniasis vakalarının çoğundan sorumludur. Bugüne kadar mevcut olan metodolojilerle çok sayıda ilaç adayını incelemek, bileşiklerin parazitin hücre içi formlarına karşı aktivitesini değerlendirmek veya in vivo tahliller yapmak için çok zahmetli oldukları göz önüne alındığında oldukça zordur. Bu çalışmada, 18S rRNA'yı (ssu) kodlayan lokusa entegre edilmiş gelişmiş bir yeşil floresan proteini (eGFP) kodlayan genin yapısal ekspresyonu ile L. panamensis ve L. donovani suşlarının oluşumunu açıklıyoruz. eGFP'yi kodlayan gen, ticari bir vektörden elde edildi ve onu zenginleştirmek ve BglII ve KpnI enzimleri için kısıtlama bölgeleri eklemek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile amplifiye edildi. eGFP amplisonu, agaroz jel saflaştırması ile izole edildi, BglII ve KpnI enzimleri ile sindirildi ve daha önce aynı enzim seti ile sindirilmiş Leishmania ekspresyon vektörü pLEXSY-sat2.1'e bağlandı. Klonlanmış gen ile ekspresyon vektörü E. coli'de çoğaltıldı, saflaştırıldı ve ekin varlığı koloni PCR ile doğrulandı. Saflaştırılmış plazmit doğrusallaştırıldı ve L. donovani ve L. panamensis parazitlerini transfekte etmek için kullanıldı. Genin entegrasyonu PCR ile doğrulandı. eGFP geninin ekspresyonu akım sitometrisi ile değerlendirildi. Floresan parazitler seyreltme sınırlandırılarak klonlandı ve en yüksek floresan yoğunluğuna sahip klonlar akış sitometrisi kullanılarak seçildi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Leishmania cinsinin protozoan parazitleri, çok çeşitli klinik belirtileri olan bir hastalık olan leishmaniasis'e neden olur. Bu hastalık 98 ülkede yaygındır ve yıllık insidansının 0,9 ila 1,6 milyon vaka olduğu tahmin edilmektedir1. İnsanlar için patojenik olan Leishmania türleri, L olmak üzere iki alt türe ayrılır. (Leishmania) ve L. (Viyana). L'ye ait bazı türlerle enfeksiyon. L. donovani ve L. infantum gibi (Leishmania) alt cinsi, tedavi edilmezse ölümcül olan visseral leishmaniasis (VL) ile sonuçlanabilir2. L'ye ait türler. (Viannia) alt cinsi, Orta ve Güney Amerika'da, özellikle Panama, Kolombiya ve Kosta Rika'da çoğu kutanöz leishmaniasis (CL) ve mukokutanöz leishmaniasis (MCL) vakası ile ilişkilidir ve L. panamensis bu klinik sunumların ana etiyolojik ajanıdır 3,4.

Beş değerlikli antimonyaller, miltefosin ve amfoterisin B gibi ilaçları içeren mevcut anti-leishmania kemoterapisi oldukça toksik ve pahalıdır. Ayrıca, son yıllarda artan ilaç direnci, dünya çapında hastaların etkili tedavisine müdahale eden faktörlere eklenmiştir5. Leishmania cinsinin türleri arasında, özellikle Yeni ve Eski Dünya türleri arasında, uyuşturucuya duyarlılık ile ilgili olarak önemli farklılıklar gösterilmiştir 6,7. Bu nedenlerden dolayı, türe özgü yaklaşımlara özel önem vererek, yeni anti-leishmania ilaçlarının tanımlanması ve geliştirilmesine yönelik çabaların yönlendirilmesi gerekmektedir. Geleneksel metodolojilere sahip büyük ilaç adayı kütüphanelerini incelemek oldukça zordur, çünkü bu metodolojiler, bileşiklerin hücre içi amastigotlara karşı aktivitesini değerlendirmek veya in vivo deneyler yapmak için çok zahmetlidir8; Bu nedenle, raportör genlerin uygulanması ve yüksek içerikli fenotipik tarama testlerinin geliştirilmesi de dahil olmak üzere bu dezavantajları azaltan yeni tekniklerin geliştirilmesi gerekli olmuştur9.

Raportör genlerin kullanımı, yüksek verimli ve in vivo tahlillerin geliştirilmesini kolaylaştırdığı için ilaç tarama sürecinin etkinliğini artırma potansiyelini göstermiştir. Çeşitli araştırma grupları tarafından çeşitli raportör genleri eksprese eden rekombinant Leishmania parazitleri üretilmiştir. β-galaktosidaz, β-laktamaz ve lusiferaz gibi raportör genler, epizomal vektörler kullanılarak birkaç Leishmania türüne dahil edilmiştir ve parazitin hücre dışı ve hücre içi formlarında ilaç taraması için sınırlı fayda göstermiştir 10,11,12,13,14,15. Bu yaklaşımlar, epizomal yapının ortadan kaldırılmasını önlemek için kültürde güçlü bir seçici baskı gerektirmenin yanı sıra raportör genin aktivitesini ortaya çıkarmak için ek reaktiflerin kullanılması sınırlamasına sahiptir. Tersine, yeşil floresan proteini (GFP) ve varyantı, geliştirilmiş yeşil floresan proteini (eGFP), esneklikleri ve duyarlılıkları nedeniyle in vitro ilaç tarama deneyleri için çok sayıda transgenik Leishmania suşunun üretilmesinde kullanılmıştır, ayrıca akış sitometrisi veya florometri15 kullanarak tarama sürecini otomatikleştirme olasılığı, 16,17,18,19. Umut verici sonuçlara rağmen, bu transgenik suşların kültürleri, GFP geninin kopya sayısı tüm parazitlerde aynı olmadığından, floresan seviyelerinde oldukça heterojendi. Ayrıca, floresansın korunması, GFP geni epizomal bir yapıda sokulduğundan, kültürdeki parazitler üzerinde sürekli seçici baskı gerektiriyordu.

Daha önce belirtilen nedenlerden dolayı, birçok çaba, kararlı rekombinant suşlar üretmek için yeni metodolojiler geliştirmeye odaklanmıştır. Bu çabalar çoğunlukla, ribozomal genlerin20 daha yüksek transkripsiyon oranlarından yararlanarak, raportör genlerin ribozomal lokuslara entegrasyonuna dayanmıştır. L. infantum ve L. amazonensis suşları, β-galaktosidaz21, IFP 1.4, iRFP22 ve tdTomato23'ü kodlayan genleri entegre ederek üretilmiş ve ilaç tarama testlerinde yararlılıkları açısından değerlendirilmiştir. Çeşitli gruplar, kodlama genini homolog rekombinasyon yoluyla 18S ribozomal RNA lokusuna (ssu lokusu) entegre ederek GFP'yi yapısal olarak eksprese eden L. donovani suşları geliştirmiştir24,25; hücre içi amastigotlar 24,25 dahil olmak üzere transfekte edilmiş popülasyonda stabil ve homojen GFP ekspresyonu gösterdiler ve ilaç tarama testlerinde24,25,26 başarıyla uygulandılar. Bolhassani ve ark.27, GFP'yi entegre bir transgen olarak eksprese eden L. major ve L. infantum suşları geliştirdi. Başlangıçta konakçı28 olarak L. tarentolae kullanan bir sistemde proteinlerin transgenik ekspresyonu için tasarlanmış entegrasyon vektörü pLEXSY'yi kullandılar. pLEXSY-GFP vektörünün, GFP24,25,27,29,30'u yapısal olarak eksprese eden farklı Leishmania suşlarının üretilmesi için çok etkili olduğu gösterilmiştir. Bu parazitlerde, floresan homojendir ve hücre içi formlarda korunur, enfekte farelerin ayak tabanı lezyonlarında tespit edilebilir27.

Bu çalışmada, pLEXSY sistemini kullanarak entegre bir transgen olarak eGFP'yi kodlayan geni ifade eden L. panamensis ve L . donovani suşlarını oluşturmak için kullanılan metodolojiyi açıklıyoruz. Bu işlemle üretilen suşlar, laboratuvarımızda, doğal ve sentetik kökenli moleküllerin potansiyel anti-leishmania aktivitesini değerlendiren ilaç tarama testleri yapmak için kullanılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Numuneleri steril tutmak için, parazit kültürünü içeren tüm adımlar bir biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) başlığı içinde veya yerel sağlık ve güvenlik yönetmeliklerine göre gerçekleştirilmelidir. Bu protokolün grafiksel bir özeti Şekil 1'de bulunabilir.

figure-protocol-1
Şekil 1: pLEXSY-2.1 vektör ailesini kullanarak eGFP eksprese eden L. panamensis ve L. donovani parazitleri oluşturmak için protokolün özet şeması. Makalede açıklanan altı ana bölümün tümü burada tasvir edilmiştir. 1) eGFP geninin pLEXSY-2.1 vektörüne amplifikasyonu ve eklenmesi: hedef gen amplifiye edilir, KpnI ve BglII enzimleri için tanıma bölgeleri eklenir ve hem eGFP amplikonu hem de pLEXSY plazmidi, T4 ligaz ile müteakip ligasyon için her iki enzimle sırayla sindirilir. 2) pLEXSY ekspresyon plazmidinin doğrusallaştırılması: pLEXSY + eGFP yapısı, 7-8 kbp ekspresyon kasetinin doğrusallaştırılması ve saflaştırılması için SwaI ile sindirilir. 3) Transfeksiyon ve 4) poliklonal seleksiyon: Leishmania promastigotları elektroporasyon ile ekspresyon kaseti ile transfekte edilir ve rekombinant parazitlerin antibiyotik seçimi için tekrar kültüre konur. Parazit floresansı, akış sitometrisi ile doğrulanır. 5) Genomik entegrasyonun doğrulanması ve 6) seyreltmeyi sınırlayarak klonlama: pLEXSY-eGFP ekspresyon kasetinin entegrasyonu, ekspresyon kasetine bir ileri primer hibridizasyonu, ekspresyon kasetinde bulunmayan bir kromozomal diziye hibridize olan bir ters primer kullanılarak tanısal PCR ile doğrulanır. Transfekte edilmiş kültürler, seyreltmeyi sınırlayarak klonlama yoluyla floresan parazitler için zenginleştirilebilir ve daha sonraki uygulamalar için en yüksek ortalama floresan yoğunluğuna sahip klonlar seçilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. eGFP geninin amplifikasyonu ve pLEXSY-2.1 vektörüne eklenmesi

  1. eGFP geninin amplifikasyonu
    NOT: Bu protokol, ekspresyon kasetinin Leishmania türlerinin kromozomal 18S rRNA lokusuna (ssu) entegrasyonunu takiben hedef proteinlerin yapısal ekspresyonu için pLEXSY-2.1 vektör ailesini (Malzeme Tablosuna bakınız) kullandığından, ilk adım, eGFP genine, pLEXSY-2.1 vektörlerine eklenmesine izin veren kısıtlama bölgelerini içeren dizileri tanıtmaktır. Bu durumda, eGFP'nin sadece sitozolik olarak eksprese edilmesi gerektiğinden, BglII ve KpnI enzimleri için kısıtlama bölgeleri eGFP geninin sırasıyla 5' ve 3' uçlarına eklenmiştir. KpnI ile klonlama, hedef proteinin altı kalıntıdan oluşan bir C-terminal polihistidin etiketine füzyonu ve ardından ilgilenilen proteinin daha fazla saflaştırılması için pLEXSY-2.1 plazmidinde kodlanmış bir durdurma kodonu ile sonuçlanır. Bu nedenle, ters primer dizisi bir durdurma kodonu içermez.
    1. eGFP için plazmit kaynağına bağlı olarak, klonlama için kullanılan kısıtlama enzimleri (BglII ve KpnI) veya transfeksiyondan önce vektör doğrusallaştırması için kullanılan enzim olan SwaI için dahili bölgeler içermediğinden emin olmak için NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 gibi bir kısıtlama analiz aracı kullanarak hedef diziyi analiz edin.
    2. BglII ve KpnI kısıtlama dizilerini içeren eGFP amplifikasyonu için ileri ve geri primerler tasarlayın. Örnek olarak, bu protokol için eGFP kaynağı pEGFP-N1-1X plazmid32 idi ve primer dizileri Bolhassani ve ark.27 tarafından bildirilenlerdi:
      İleri astar (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (BglII kısıtlama bölgesi kalın harflerle yazılmıştır).
      Ters astar (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (KpnI kısıtlama bölgesi kalın harflerle yazılmıştır).
    3. Kodlama dizisinin korunmasını sağlamak için yüksek kaliteli bir polimeraz kullanarak hedef geni çoğaltın. Örnek olarak, EGFP1 ve EGFP2 primerleri için, Bolhassani ve ark.27 tarafından bildirildiği gibi PCR döngü protokolünü çalıştırın. 94 °C'de 2 dakikalık bir ilk denatürasyon, ardından 94 °C'de 30 sn, 57 °C'de 30 s ve 72 °C'de 1 dakikalık 30 döngü çalıştırın. 72 °C'de 10 dakikalık son bir uzatma adımı çalıştırın. Primerleri 0,2 μM'lik bir son konsantrasyonda ekleyin.
    4. Parçayı, başka bir yerde açıklandığı gibi geleneksel bir PCR ürün saflaştırma kiti veya standart sodyum asetat ve etanol çökeltme kullanarak saflaştırın33.
  2. eGFP'nin pLEXSY-2.1 ekspresyon vektörüne eklenmesi
    1. Üreticinin talimatlarını izleyerek BglII ve KpnI kullanarak eGFP-PCR ürününün uçlarını kesin.
      1. İlk olarak, üreticinin talimatlarına göre en düşük tuz konsantrasyonunu (bu durumda KpnI) gerektiren enzim için reaksiyonu ayarlayın ve 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
      2. Daha sonra 100 mM NaCl ve 10 birim BglII ekleyin ve 15 dakika inkübe edin. Adım 1.1.4'te açıklandığı gibi reaksiyonu saflaştırın.
    2. Adım 1.2.1'de açıklanan sıralı sindirim protokolünü izleyerek pLEXSY ekspresyon vektörünü BglII ve KpnI ile sindirin.
    3. pLEXSY vektörünü ve eGFP genini 1:3'lük bir molar oran kullanarak T4 ligaz ile bağlayın (vektör:insert). 100x ve 28 birim T4 DNA ligazının nihai konsantrasyonunda ligaz tamponu içeren 20 μL'lik bir reaksiyona kısaca 1 ng sindirilmiş pLEXSY ve 3 ng sindirilmiş eGFP ürünü ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    4. XL-10, DH5α veya DH10B gibi yetkin E. coli hücrelerini, standart dönüşüm protokollerini33 kullanarak adım 1.2.3'te elde edilen ligasyon ürünü ile dönüştürün. Dönüştürülmüş hücreleri Luira-Bertani (LB)-ampisilin agarda kaplayın ve rekombinant klonları seçmek için 30 ° C'de 24 saat inkübe edin (pLEXSY plazmitleri E. coli'de 30 ° C'de 37 ° C'den daha kararlıdır).
    5. Koloni PCR ile plazmitlerde ekin varlığını tarayın.
      1. Tek tek kolonileri seçin, 20 μL nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin, 95 °C'de 15 dakika ısıtın ve koloni PCR için bir DNA şablonu olarak 1 μL lizat alın. Adım 1.1.2'de (bu örnekte, EGFP1) açıklanan eGFP amplifikasyonu için ileri astarı ve ters astar29 olarak astar A264'ü (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') kullanın.
      2. Primer A264, pLEXSY-2.1 ekspresyon vektörlerinde kesici ucun durdurma kodonundan sonra 80 bp'yi tavlamak üzere tasarlanmıştır. Örnek olarak, EGFP1 + A264 primer çifti için, 94 °C'de 2 dakikalık bir başlangıç denatürasyonu, ardından 94 °C'de 30 s'lik 30 s'lik 30 s'lik bir döngü, 50 °C'de 30 sn ve 72 °C'de 1 dakikalık bir döngüden oluşan bir PCR döngü protokolü kullanın. 72 °C'de 10 dakikalık son bir uzatma adımı çalıştırın. Primerler, 0.2 μM'lik bir nihai konsantrasyonda eklenir.
        NOT: Bu astar setini kullanan beklenen ürün 859 bp uzunluğundadır. EGFP1 ve A264 primerleri için tavlama bölgeleri Şekil 2'de gösterilmektedir.
    6. Ticari bir plazmit izolasyon kiti veya standart alkali çökeltme33 kullanarak sonraki transfeksiyon için pozitif bir klondan saflaştırılmış plazmit DNA'yı hazırlayın. Minimum 10 μg plazmid/pozitif klonun izolasyonu için 30 °C'de 50 mL gece kültürü kullanın.

2. pLEXSY ekspresyon plazmidinin doğrusallaştırılması

  1. SwaI ile sindirim için en az 10 μg saflaştırılmış pLEXSY-eGFP plazmidi kullanın (tanıma bölgesi: 5'-ATTTAAAT-3'). 25 °C'de 3-4 saat sindirim yapın ve 65 °C'de 20 dakika ısıyla etkisiz hale getirin.
  2. Elde edilen parçaları ayırmak için sindirim ürününü agaroz jel elektroforezinde çalıştırın. Bu sindirim, E. coli'de replikasyon ve seçim için gerekli elementleri temsil eden 2.9 kbp'lik bir fragman ve doğrusallaştırılmış ekspresyon kasetini temsil eden 7-8 kbp'lik bir fragman olmak üzere iki fragman üretecektir.
  3. Ticari bir agaroz jel ekstraksiyon kiti kullanarak ekspresyon kasetini saflaştırın.

3. L. panamensis ve L. donovani'nin elektroporasyon ile transfeksiyonu

NOT: Leishmania kültürü başka bir yerde anlatıldığı gibi gerçekleştirilir34. Bu örnekte, L. panamensis ve L . donovani promastigotları, Schneider'in böcek ortamında kültürlendi,% 20 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) ve 50 μg / mL gentamisin ile desteklendi ve 26 ° C'de inkübe edildi.

  1. Transfeksiyon başına yaklaşık 4 x 107 parazit kullanmak için yeterli log faz veya erken durağan faz promastigot olana kadar parazit kültürlerini büyütün. Durağan faza ulaşmadan önce kültür şişesi başına maksimum hücre yoğunluğu, Leishmania türüne ve suşların laboratuvar koşullarına ne kadar iyi adapte edildiğine bağlı olarak değişebilir. Gerekirse birden fazla kültür şişesinin içeriğini bir havuzda toplayın.
  2. Parazit kültürünü oda sıcaklığında (RT) 3 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüjleyin.
  3. 1 x 108 parazit/mL konsantrasyon elde etmek için peleti 4 °C'de (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.7 mM Na2HPO4 ve6 mM glikoz; pH 7.5)27'de elektroporasyon tamponunda yeniden süspanse edin. 10 dakika buza koyun.
    NOT: Elektroporasyon tamponu kullanımdan önce filtrelenerek sterilize edilmelidir.
  4. Paralel olarak, maksimum 50 μL su veya 10 mM tris tamponu (pH 8.0) hacminde ve d = 2 mm'lik elektroporasyon küvetlerinde 2-10 μg doğrusallaştırılmış pLEXSY-eGFP içeren ön soğutma tüpleri oluşturur.
  5. Doğrusallaştırılmış plazmid ile tüpe 350 μL önceden soğutulmuş parazit ekleyin ve 400 μL'nin tamamını buz üzerindeki elektroporasyon küvetine aktarın. Paralel olarak, negatif kontrol olarak plazmit DNA'sı olmayan parazit hücrelerini elektropore edin.
  6. Bu iki protokolden birini kullanarak elektropoze edin:
    Üstel bozulma: 450 V, 450 μF, bir darbe.
    Zaman sabiti: 450 V, T = 3,5 ms, bir darbe.
    NOT: Bu protokoller, PC ve CE modüllerine sahip ticari bir gen pulseri (Malzeme Tablosu) kullanılarak çalıştırılmıştır.
  7. Küveti 10 dakika boyunca tekrar buza koyun ve elektroporasyonlu parazitleri uygun kültür ortamının 5 mL'sine aktarın. Bu örnek, Schneider'in (h/h) FBS ile desteklenmiş böcek ortamını kullanmıştır. 26 °C'de 20 saat inkübe edin.

4. Kültürde poliklonal seleksiyon

  1. Elektroporasyondan yaklaşık 20 saat sonra, kültürleri mikroskop altında gözlemleyin. Parazit popülasyonunun en az yarısı görsel olarak iyi morfoloji ve hareketlilik göstermelidir (ortamda hareket eden ve/veya aktif parazit agregaları oluşturan salınımlı kamçılı damla benzeri promastigotlar). Kullanılan pLEXSY plazmidine bağlı olarak uygun seçici antibiyotiği ekleyin. Bu örnekte, bir seçim belirteci olarak streptotrisin asetiltransferaz içeren pLEXSY-sat2.1 kullanılmıştır. Bu nedenle, 0.1 mg / mL konsantrasyonda seçici bir antibiyotik olarak nourseothrisin kullanın.
  2. Plazmid DNA'lı ve plazmidsiz elektroporasyonlu parazitler arasında net bir fark görülene kadar kültürleri mikroskobik olarak takip edin.
  3. Parazit floresansını akış sitometrisi ile doğrulayın.
    1. RT'de 3 dakika boyunca 2.000 x g'de 1 mL sabit faz kültürünü santrifüjleyin. PBS'de iki kez yıkayın ve son peleti 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
      NOT: eGFP'nin floresansı, çoğu ticari sitometrenin FL1 kanalında tespit edilebilir. İleri ve yan saçılma için kazanç ayarları ve FL1 kanalı sitometreler arasında değişebilir. Bu örnekte bir CyFlow uzay (Sysmex) sitometresi kullanılmıştır.
    2. 0,5 μL/sn hızında 20.000 olay toplayarak örnekleri çalıştırın ve ileri saçılma (FSC), yan saçılma (SSC) ve floresan 1 (FL-1) kanalları için kazanç değerlerini sırasıyla 225,0, 200,0 ve 520,0 olarak ayarlayın. Bir FSC'ye karşı SSC nokta grafiğindeki parazit popülasyonunu belirlemek için floresan olmayan parazitlerle bir kontrol numunesi çalıştırın.
    3. Parazit popülasyonunu içeren bir kapı (G1) oluşturun ve promastigotların otofloresansını belirlemek ve FL-1 kanalı için bir aralık kapısı (G2) ayarlamak için FL-1 kanalını bu kapıdan filtreleyin.
    4. Floresan olup olmadığını doğrulamak için transfekte edilmiş parazitleri çalıştırın. G1'deki floresan parazitlerin yüzdesini ve G2'deki floresan yoğunluğunun ortalamasını kaydedin.

5. Genomik entegrasyonun doğrulanması

NOT: pLEXSY-eGFP ekspresyon kasetinin entegrasyonu, ekspresyon kasetine hibridize eden bir ileri primer (kullanılan pLEXSY-2.1 vektörüne bağlı olarak değişir) ve ters primer F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') kullanılarak teşhis PCR ile doğrulanabilir. Bu örnekte, F2999 ileri primer (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3'), pLEXSY-sat2.1 ekspresyon kasetinde hibritleşirken kullanılmıştır. Tanısal PCR için entegre ekspresyon kaseti ve primer tavlama bölgelerinin şematik bir gösterimi Şekil 2'de gösterilmektedir.

  1. Genomik DNA'yı 2-5 mL sabit fazlı parazit kültüründen geleneksel fenol / kloroform ekstraksiyonu35 veya ticari bir kit ile saflaştırın.
  2. 94 °C'de 2 dakikalık bir başlangıç denatürasyonu, ardından 94 °C'de 30 s'lik 30 s'lik 30 s'lik bir döngü, 53 °C'de 30 sn ve 72 °C'de 1 dakikalık bir döngüden oluşan bir döngü protokolü kullanarak pLEXSY-sat2.1 için tanısal PCR'yi gerçekleştirin. 72 °C'de 10 dakikalık son bir uzatma adımı çalıştırın. Primerler, 0.2 μM'lik bir nihai konsantrasyonda eklenir.

figure-protocol-2
Şekil 2: Entegre ifade kasetinin şematik gösterimi. Chr-S (gri) olarak etiketlenen kutular, ekspresyon kasetinin entegre edildiği 18S rRNA lokusunun (ssu) bitişik kromozomal dizilerini temsil eder. Entegre ekspresyon kaseti, ssu lokusuna homolog rekombinasyon için 5' ve 3' dizilerden (mavi), gelişmiş protein üretimi için ek bir Leishmania ribozomal promotöründen (kırmızı), eGFP geninden (yeşil), bir seçim işaretleyici geninden (sarı) ve üç çevrilmemiş bölgeden (açık gri) oluşur), yani eGFP'nin optimize edilmiş ekspresyonu ve Leishmania parazitlerinde seçim belirteci için transkripsiyon sonrası mRNA işleme için ekleme sinyallerini sağlayan utr1, 2 ve 3. Koloni PCR (adım 1.2.5) ile kesici uç varlığının doğrulanması için kullanılan ileri ve geri primerler için tavlama bölgeleri, 859 bp'lik bir ürünü sınırlayan sırasıyla cpcr-fwd (EGFP1 primer) ve cpcr-rev (A264 primer) olarak etiketlenmiş siyah oklarla işaretlenir. Tanısal PCR (adım 5) ile genomik entegrasyonun doğrulanması için kullanılan ileri ve geri primerler için tavlama bölgeleri, sırasıyla sat-fwd (F2999 primer) ve ssu-rev (F3002 primer) olarak etiketlenmiş siyah oklarla işaretlenmiştir ve bu da 2.271 bp'lik bir ürünü sınırlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. Seyreltmeyi sınırlayarak klonlama (isteğe bağlı)

  1. Akış sitometrisi ile floresan onaylandıktan sonra, beş promastigot / mL36 konsantrasyonunda rekombinant parazitlerin bir seyreltilmesini hazırlayın.
  2. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bu seyreltmenin 100 μL'sini ekleyin. Bu şekilde, plakalar ortalama 0.5 promastigot/kuyu yoğunluğunda tohumlanır, bu da bazı kuyucukların tek bir parazit almasını sağlarken kuyucuk başına birden fazla parazit olma olasılığını en aza indirir36.
  3. Plakayı en az 12 saat rahatsız etmeden bırakın. Parazit büyümesi olan kuyucuklar tespit edilene kadar plakayı mikroskobik olarak minimum 100x büyütmede takip edin.
  4. Bir plaka kuyusu parazitlerle dolu olduğunda, içeriği 5 mL'lik bir kültürü aşılamak için kullanın. Bu 1-2 hafta sürer.
  5. Klon tohumlu kültürler durağan faza ulaştığında, adım 4.3'te açıklandığı gibi akış sitometrisi kullanarak floresansı doğrulayın. Floresan parazitlerin yüzdesine ve FL-1 kanalında ölçülen ortalama floresan yoğunluğuna bağlı olarak in vitro ve in vivo

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

pLEXSY-eGFP yapısını oluşturduktan ve yetkin E. coli hücrelerini dönüştürdükten sonra, yapıyı eGFP eki ile içeren koloniler, bölüm 1.2'de açıklanan koloni PCR'sini çalıştırdıktan sonra yaklaşık 859 bp'lik bir ürün üretecektir (Şekil 3A). SwaI kullanılarak pozitif kolonilerden saflaştırılmış plazmitin toplam sindirimi, jel elektroforezinde iki karakteristik fragman, PLEXSY vektörünün E. coli'de replikasyon ve seçim için gerekli tüm elementleri içeren kısmı olan 2.9 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli raportör genlerin avantajları ve dezavantajları çeşitli protozoan parazitlerde incelenmiştir. Bunlar arasında, GFP ve eGFP doğası gereği floresandır ve kolay miktar belirleme ve görüntülemeye izin verir. Bu proteinlerin floresan aktivitesi, floresan mikroskobu, florimetri veya akış sitometrisi kullanılarak minimum manipülasyon ile tespit edilebilir. GFP eksprese eden L üretmek için çok az çalışma yapılmıştır. (Viannia) suşları, GFP ve türevlerinin Eski Dünya Leishmania türlerinde raport...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panama, NI-177-2016 hibe numarası ve Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panama, hibe numaraları SNI-169-2018, SNI-008-2022 ve SNI-060-2022 tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 KuyuluMikroplakalar CorningCLS3340Düz dipli şeffaf, siyah polistiren, steril, kapaklı
AgarozSigma-AldrichA4718
Ampisilin sodyum tuzuSigma-AldrichA8351BioXtra, hücre kültürü
BglII kısıtlama enzimiiçin uygun New England BioLabsR0144S2.000 birim. 10.000 birim / mL
Hücre Kültürü ŞişeleriCorningCLS430168Yüzey alanı 25 cm2, eğimli boyun, kapak (tapa contası)
ChemiDoc Görüntüleme SistemiBio-Rad17001401
CyFlow SpaceSysmexMevcut
D-(+)-GlukozSigma-AldrichG7021toz, BioReagent, hücre kültürü için uygun, böcek hücre kültürü için uygun, bitki hücre kültürü için uygun, & % 99,5
Fetal Sığır SerumuSigma-AldrichF7524
Jel Yükleme TamponuSigma-AldrichG2526  Migrasyon hızı jel bileşimine göre değişir. Yüklemeden önce numune ile 1:3 ila 1:6 oranında seyreltin.
Gene Pulser Xcell Elektroporasyon SistemiBio-Rad1652660Sistem bir ana ünite, iki aksesuar modülü, kapasitans genişletici (CE modülü) ve darbe kontrolörü (PC modülü) ve bir ShockPod küvet odasından oluşur.
Gene Pulser/MicroPulser Elektroporasyon KüvetleriBio-Rad165208650, 0,2 cm– memeli ve diğer ökaryotik hücreler için Gen Pulser ve MicroPulser Sistemleri ile kullanım için boşluk steril elektroporasyon küveti
Gentamisin çözeltisiSigma-AldrichG139750 mg / mL deiyonize su, sıvı, 0.1 & mu; m filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygun
GoTaq Long PCR Master MixPromegaM4021
HEPES çözeltisiSigma-AldrichH08871 M, pH 7.0-7.6, steril filtreli, BioReagent, hücre kültürü için uygun
Ters mikroskopOlympusIXplore Standard
KpnI-HF kısıtlama enzimiNew England BioLabsR3142S4.000 birim. 20.000 birim / mL
LB Agarlı etsuyu Sigma-AldrichL3147Agarlı, yüksek referanslı, besin açısından zengin mikrobiyal büyüme tozu ortamı, düzenli  E.coli  kültür.
LB Et suyu Sigma-AldrichL2542Sıvı mikrobiyal büyüme ortamı
Mini-Sub Cell GT Yatay Elektroforez SistemiBio-Rad1640300Mini yatay elektroforez sistemi, 8 ve 15 oyuklu taraklar, 7 cm x 10 cm UV şeffaf tepsi
içerir pEGFP-N1-1xAddgene17228150 bazlık bir dizinin 1 tandem tekrarı ile kaynaşmış eGFP mRNA'sını eksprese eder
pLEXSYcon2.1 ekspresyon kitiJena BiyobilimEGE-1310satBütünleştirici kurucu ifade vektörü pLEXSY-sat2.1 içerir. Nourseothrisin (NTC, clonNAT) ile transfektanların antibiyotik seçimi. Tanısal PCR'ler ve dizileme için tüm primerleri içerir.
Potasyum KlorürMillipore529552Moleküler Biyoloji Sınıfı - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plazmid Miniprep SistemiPromegaA122215 & mu'ya kadar; 3 mL kültürden g Transfeksiyona Hazır Plazmit.
Schneider ve Başbakan; Böcek OrtamıSigma-AldrichS0146Laboratuvarımızda Leishmania kültürü için kullanılan ortam.
SOC OrtaSigma-AldrichS1797
Sodyum klorürSigma-AldrichS3014, hiçbiri tespit edilmedi, > % 99 (titrasyon)
Sodyum fosfat dibazikSigma-AldrichRDD038BioReagent, hücre kültürü için uygun, böcek hücre kültürü için uygun, vb; %99,0, serbest akışlı, Redi-Dri
SwaI kısıtlama enzimiNew England BioLabsR0604S2.000 birim. 10.000 birim / mL
Şırınga filtreleriCorningCLS431212rejenere selüloz membran, çap 4  mm, gözenek boyutu 0.2  μ m
T100 Termal DöngüleyiciBio-Rad1861096Termal döngüleyici sistemi, 96 kuyulu termal döngüleyici, güç kablosu, tüp destek halkası içerir
T4 DNA LigazPromegaM1801Yapışkan veya künt uçlu iki DNA zincirini birleştirir
Tris-Borat-EDTA tamponuSigma-AldrichT4415BioReagent, elektroforez için uygun, 10 kez; konsantre
Sihirbaz Genomik DNA Arıtma KitiPromegaA1120
Wizard SV Jel ve PCR Temizleme SistemiPromegaA9285
XL10-Gold Ultrayetkin HücrelerAgilent200317XL10-Gold Kanr Ultrayetkin Hücreler, 10 x 0.1 mL. Kloramfenikol dirençli vektörlerde son derece zorlu klonlama için F' epizomundaki kanamisin dirençli geni içerir. Verimlilik: > 5 x 10 9 dönüştürücü /&mikro; g pUC18 DNA'sı.
değilMoleküler biyoloji, DNaz, RNaz ve proteaz için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671(2012).
  2. Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243(2020).
  3. Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
  4. Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266(2016).
  5. Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052(2017).
  6. Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
  7. Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
  8. Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
  9. Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
  10. Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
  11. Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
  12. Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
  13. Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
  14. Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
  15. Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
  16. Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
  17. Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
  18. Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
  19. Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
  20. Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
  21. da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732(2019).
  22. Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666(2015).
  23. García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746(2021).
  24. Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
  25. De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
  26. Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771(2015).
  27. Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
  28. Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
  29. Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
  30. Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
  31. Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
  32. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).
  33. Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  34. Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
  35. Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
  36. Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16(2021).
  37. Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
  38. Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Leishmania Su lareGFP EkspresyonuAk SitometrisiParazit TransfeksiyonuRekombinant ParazitlerPolimeraz Zincir ReaksiyonuPlazmid Lineerizasyonula Tarama AnalizleriPromastigot KlonlamaAgaroz Jel Purifikasyonu

İlgili makaleler