Hücre yüzeyi proteomunun etiketsiz miktar tayini için "hücre yüzeyi yakalama" iş akışı

Summary

Burada, çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyi proteomunun karakterizasyonu için bir proteomik iş akışını açıklıyoruz. Bu iş akışı, hücre yüzeyi proteini zenginleştirmeyi, müteakip numune hazırlamayı, bir LC-MS/MS platformu kullanarak analizi ve özel yazılımla veri işlemeyi içerir.

Abstract

Son on yılda, kütle spektrometresi tabanlı proteomik, geniş bir uygulama yelpazesinde biyolojik sistemlerin derinlemesine karakterizasyonunu mümkün kılmıştır. Plazma zarı proteinleri, klinik olarak onaylanmış terapötiklerin çoğunun birincil hedefi olmasının yanı sıra, hastalıklı hücreleri sağlıklı dokulardan tanısal olarak ayırt etmek için anahtar bir özellik olduğundan, insan hastalığında hücre yüzeyi proteomu ("surfaceome") önemli bir ilgi alanıdır. Bununla birlikte, hücrenin zar ve yüzey proteinlerinin odaklanmış karakterizasyonu, esas olarak diğer yüksek bolluktaki proteinler tarafından ilgilenilen proteinleri maskeleyen hücresel lizatların karmaşıklığı nedeniyle zor kalmıştır. Bu teknik engelin üstesinden gelmek ve kütle spektrometresi proteomiği kullanarak çeşitli hücre tiplerinin hücre yüzeyi proteomunu doğru bir şekilde tanımlamak için, kütle spektrometresinde analizden önce hücre yüzey proteinleri için hücre lizatını zenginleştirmek gerekir. Bu makale, kanser hücrelerinden hücre yüzey proteinlerini etiketlemek, bu proteinleri hücre lizatından zenginleştirmek ve ardından kütle spektrometresi analizi için numune hazırlamak için ayrıntılı bir iş akışı sunmaktadır.

Introduction

Proteinler, hücresel işlevlerin çoğunun gerçekleştirildiği temel birimler olarak hizmet eder. İlgili proteinlerin yapısını ve işlevini karakterize etmek, biyolojik süreçleri anlamak için önemli bir adımdır. Son on yılda, kütle spektrometresi teknolojisi, analiz yazılımı ve veri tabanlarındaki ilerlemeler, proteinlerin proteom çapında bir ölçekte doğru bir şekilde tespit edilmesini ve ölçülmesini sağlamıştır¹. Kütle spektrometresi tabanlı proteomik, biyokimyasal yolların temel bilim analizinden, translasyonel bir ortamda yeni ilaç hedeflerinin tanımlanmasına, clinic^{2'de hastalıkların teşhisi ve izlenmesine kadar çok çeşitli uyg....}

Protocol

NOT: Bu hücre yüzeyi proteom deneyi için AMO1 plazmasitom hücreleri kullanıldı. Aynı protokol, çok çeşitli süspansiyon ve yapışık hücre hatları dahil olmak üzere diğer hücre türleri için de kullanılabilir⁹ ve ayrıca çeşitli birincil numune türleri¹⁰. Bununla birlikte, hücre sayılarının (deney için başlangıç materyali) tipik olarak eşdeğer proteom kapsamı için optimize edilmesi gerekir. Malzeme ve ekipmanla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Tamponlar ve reaktif çözeltileri ve bunların bileşimi ile ilgili ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.

1. B....

Results

Bu deney için, bir tümör hücre hattının hücre yüzeyi proteomunu, sağlam hücrelerin N-glikosile membran proteinlerini biotin ile etiketleyerek ve bu etiketli proteinleri tüm hücre lizatından bir nötravidin pulldown ile zenginleştirerek karakterize ettik (Şekil 1). Ayrıca, zenginleştirilmiş hücre yüzey proteinlerini karakterize etmek için LC-MS/MS kullanarak proteom analizi gerçekleştirdik. Tüm hücre proteom analizinden farklı olarak, burada amaç sadece hücre yüzey proteinlerini karak.......

Discussion

Kütle spektrometrisi tabanlı proteomik, binlerce bilinmeyen proteinin daha önce imkansız bir ölçekte tarafsız karakterizasyonunu sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yaklaşım, belirli bir numunede bulunan protein çeşitliliğini karakterize ederek, proteinleri tanımlamamıza ve ölçmemize ve ayrıca hücrelerin ve dokuların yapısal ve sinyal kapasiteleri için bir dizi içgörü toplamamıza olanak tanır. Bir numunedeki küresel protein profilinin ötesine geçen kütle spektrometrisi, bu proteinler üzerindeki çeşitli translasyon sonrası mod.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kitler
96X iST Numune Hazırlama Kiti	PreOmics	P.O.00027	Proteomics numune hazırlama kiti. İndirgeme, alkilasyon ve sindirim için reaktifler içerir. Ayrıca tuzdan arındırma kolonlarını ve reaktifleri de içerir.
Pierce Kantitatif Kolorimetrik Peptit Testi	Termo	23275	Peptit miktar tayin kiti. Peptit standartlarını ve çalışma reaktiflerinin bileşenlerini içerir.
Reaktifler< / güçlü >
Asetonitril	Fisher	A955-1
Amonyum bikarbonat	Millipore Sigma	09830-1KG
Biyosit hidrazid	Biotium	90060
D-PBS (Kalsiyum ve Magnezyum Tuzları olmadan)	UCSF Hücre Kültürü Tesisi	CCFAL003-225B01
Formik Asit	Honeywell	94318
Halt Proteaz ve Fosfataz İnhibitörü Tek Kullanımlık Kokteyl	Thermo	1861280
Yüksek Kapasiteli Nötravidin Agaroz Reçine	Thermo	29204
Fosfat Tamponlu Salin	UCSF Hücre Kültürü Tesisi	CCFAL001-22J01
RIPA Lizis Tamponu, 10x	Milipor Sigma	20-188
Sodyum klorür	Fisher	BP358-212
Sodyum metaperiodat	Alfa Aesar	13798
Tripan Mavi Leke (% 0.4)	Gibco	15250-061
Ultra saf 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575-038
Üre (Proteomik Sınıfı)	VWR	M123-1KG
güçlü > Ekipman< / güçlü>
TC20 Otomatik Hücre Sayacı	Bio-Rad	1450102
PrismR Mikrosantrifüj	Labnet International	C2500-R-230V
Sonikatör	VWR	Branson Sonifier 240
Vakum Manifoldu	Promega	Promega Vac-Man
Titreyen Isı Bloğu	Eppendorf	Eppendorf Termomikser C
Uçtan Uca Döndürücü	Labnet	Tabanca Ayarlanabilir Döndürücü
LC	Thermo	Ultimate 3000 HPLC ve UHPLC
Q Exactive Plus Hibrit Quadrapole Orbitrap Kütle Spektrometresi	Termo	IQLAAEGAAPFALGMBDK
Mikroplaka Okuyucu	Biotek Biotek	Synergy 2
Vakum Konsantratörü	Labconco	7810010
Malzemeler< / güçlü>
1.5 mL Protein LoBind Tüpleri	Eppendorf	22431081
1.7 mL Mikrosantrifüj Tüpleri Filtrasyon Sütunları
	Bio-Rad	7326008
Spin Sütunları	Termo	69725