Method Article

Yağ Dokusu Fonksiyonlarının Araştırılması

DOI:

10.3791/64957

⸱

March 3rd, 2023

 , 
1Team Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity and Diabetes, C3M, Université Côte d'Azur, Inserm

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TARTIŞILAN MAKALELER:

Cho, D. S., Doles, J. D. Fare epididimal yağ dokularından adipoz progenitör hücrelerin hazırlanması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (162), doi: 10.3791/61694 (2020).

Peics, J. ve ark. Murin intraabdominal yağ depolarından adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarının izolasyonu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (162), doi: 10.3791/61610 (2020).

Estrada-Gutierrez, G. et al. RNA analizi ve makrofaj fenotiplemesi için uygun insan viseral yağ dokusundan canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyonun izolasyonu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (164), DOI: 10.3791/61884 (2020).

Gilleron, J. et al. Metilsalisilat temizleme ve 3D görüntüleme ile yağ dokusu yapısını keşfetme. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (162), doi: 10.3791/61640 (2020).

Czepielewski, R. S. ve ark. Obezite sırasında lenfatik ve kan ağı analizi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (165), doi: 10.3791/61814 (2020).

Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. Protein ve mikro-RNA modülasyonunun adiposit fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için bir adiposit hücre kültürü modeli. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (171), doi: 10.3791/61925 (2021).

Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Rhesus makak adipoz türevli kök hücrelerin izolasyonu, proliferasyonu ve farklılaşması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (171), doi: 10.3791/61732 (2021).

Batista Jr., M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Kaşeksi kaynaklı beyaz yağ dokusu yeniden şekillenmesini incelemek için bir model olarak üç boyutlu adiposit kültürü. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (167), doi: 10.3791/61853 (2021).

Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Filtrasyon ve ultrasantrifüjleme kullanılarak insan adiposit türevi hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (170), doi: 10.3791/61979 (2021).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ dokusu (AT) kütlesinde artış ve AT bağışıklık hücrelerinin proinflamatuar yeniden şekillenmesi ile karakterize edilen obezite, kardiyovasküler hastalık, tip 2 diyabet ve karaciğer hastalıkları geliştirme riskini önemli ölçüde artırdığı için dünya çapında önemli bir halk sağlığı sorunu olarak ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, AT yapısını ve işlevini keşfetmek önemli bir klinik zorluk haline gelmiştir. Bu yöntem koleksiyonunda, fizyolojik ve patolojik koşullar altında AT yapısını ve işlevini araştırmak için geliştirilmiş birkaç son teknoloji yöntem sunuyoruz.

AT, olgun adipositler, yağ progenitör hücreleri (APC'ler), fibro-inflamatuar progenitörler (FIP'ler), endotel hücreleri ve bağışıklık hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre popülasyonlarından oluşan heterojen bir dokudur. Bu nedenle bu dokuyu karakterize etmek için tek hücre fenotiplemesi yapılabilir. Makalelerinde, Cho ve ark. ve Peics ve ark. floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) 1,2 ile fare beyaz AT'de yerleşik APC'leri izole etmek ve karakterize etmek için protokoller sağlar. Bu adım, yalnızca AT genişleme kapasitesinin belirlenmesinde önemli bir faktör olan yerleşik APC'lerin sayısının sayılmasında değil, aynı zamanda bu hücrelerin işlevinin tek hücre düzeyinde daha fazla araştırılmasında da çok önemlidir. Peics et al. ayrıca, AT disfonksiyonunda rol oynadığı bilinen bir pro-inflamatuar fenotipin gelişimine katkıda bulunabilecek adipojenik olmayan kollajen üreten hücreler olan fare beyaz AT'de yerleşik FIP'leri2'yi izole etmek için bir yöntem sağlar. Benzer şekilde, Estrada-Gutierrez ve ark. canlı olgun adipositleri ve stromal vasküler fraksiyon hücrelerini insan viseral AT biyopsilerinden aynı anda izole etmek için bir protokol tanımlayın3. Toplamda, bu protokoller, farklı AT hücre alt popülasyonlarını daha fazla saymak ve işlevsel olarak fenotip oluşturmak için ilk kritik adım olan insan ve fare AT'sinden tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için altın standarttır.

Yapı ve işlev arasındaki ilişki AT'de oldukça önemlidir. Obezite sırasında AT disfonksiyonunun ayırt edici özelliği, adiposit boyutundaki artış ve AT'nin derin bir şekilde yeniden şekillenmesi ile ilgilidir. Bu yeniden şekillenme sadece adiposit ve bağışıklık hücresi popülasyonlarını değil, aynı zamanda lenfatik ve kan damarları ağını da etkiler. AT'nin tamamındaki bu değişiklikleri takdir etmek için Gilleron ve ark. çok basit, ucuz ve hızlı bir AT temizleme protokolü geliştirin4. Bu basit protokol, tüm fare AT'sinin ve büyük insan AT biyopsilerinin morfolojisini üç boyutlu olarak görselleştirir. Bu, obezite ve ilişkili patolojilerde incelenmesi gereken önemli parametreler olan nöronal ve vasküler ağları, adipositleri ve doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücresi dağılımını içerir. Obezitenin AT lenfatik ve kan damarları üzerindeki etkisini karakterize etmek için Czepielewski ve ark. florokrom konjuge lektinler enjekte ederek lenfatik arborizasyonu ve kan damarlarını aynı anda boyamak için in vivo bir yöntem sağlar5. Bu protokol, yoğunlukları, hacimleri ve dallanmaları dahil olmak üzere her iki ağın in vivo morfolojisini analiz etmenin bir yolunu sağlar. İlginç bir şekilde, bu etiketleme stratejisini bir AT temizleme prosedürü4 ile birleştirmek, tüm fare AT'sinin üç boyutlu (3D)5 olarak yüksek çözünürlüklü haritalanmasına izin verir. Toplamda, bu yaklaşımlar AT'nin yapısını fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında karakterize edebilir ve AT yapısı ve işlevi arasındaki korelasyon hakkında fikir edinebilir.

Yüksek heterojenliği ve muazzam yeniden şekillenme kapasitesi nedeniyle, AT içindeki adipositlerin işlevini in vivo olarak analiz etmek basit değildir ve bu nedenle çeşitli kültür sistemleri geliştirilmiştir. Tüm bu hücre kültürü sistemlerinin temel avantajı, hücre popülasyonu ve mikro çevre üzerinde yüksek düzeyde kontrol sağlamasıdır. Jager ve ark. 3T3-L1 farklılaşmış olgun adipositlerde RNA ekspresyonunu manipüle etmek için basit bir protokol geliştirir6. Bu kültür sistemi ideal fizyolojik koşullardan uzak olmasına rağmen, 3T3-L1 adipositleri insülin sinyali, glukoz alımı, lipogenez ve lipoliz açısından işlevsel kalır. Bu nedenle, bu protokol, protein ve kodlamayan RNA ekspresyonunu manipüle etmek ve bunların adiposit fonksiyonları üzerindeki rollerini incelemek için güçlü bir araç sağlar. İdeal fizyolojik koşullara yaklaşmak için Poret ve ark. al yanaklı makak AT7'den elde edilen adipoz kaynaklı kök hücreleri (ADSC'ler) kullanarak fonksiyonel olgun adipositler üretmek için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu protokol, birincil ADSC'lerin nasıl izole edileceğini ve bunların çoğalmasını ve farklılaşmasını nasıl indükleyeceğini açıklar. Yazarlar ayrıca bu prosedürün diğer türlere de uyarlanabileceğini öne sürüyorlar. Bu kültür sistemi, 3T3-L1 hücre hattına kıyasla ideal fizyolojik koşullara daha yakın olmasına rağmen, birincil ADSC'lerden türetilen olgun adipositler, in vivo'dan farklı olarak 2D'de büyütülür. Bu sorunla başa çıkmak için Batista Jr. ve ark. üç boyutlu baskı doku kültürü sistemi için verimli bir protokol sağlar8. Bu çalışmada, yazarlar fare stromal vasküler fraksiyon hücrelerinden adiposferoidler üretirler ve adiposit öncüllerini doğrudan bu 3D kültür sistemi içinde ayırt ederler. Bu yaklaşım, ideal fizyolojik koşullara 2D kültür yönteminden geri dönülmez bir şekilde daha yakındır, ancak sferoidlerin merkezindeki adipositlere besin getirebilecek damarların eksikliği dikkate alınmalıdır. Bu kültür sistemleri içindetarif edildiği gibi protein ve kodlamayan RNA ekspresyonunun modüle edilmesi, fizyolojik olarak daha ilgili adipositlerde bu hedeflerin fonksiyonel rolü hakkında daha fazla anlayışa yol açabilir. Ancak, böyle karmaşık bir sistemin kurulması gerekiyor. Bu ex vivo/in vitro kültür sistemlerinin en büyük ilgisi, hücreler tarafından salgılanan faktörleri de içeren mikro çevre üzerindeki yüksek düzeyde kontroldür. Bu bağlamda, Akbar ve ark. insan adipositleri tarafından salgılanan hücre dışı vezikülleri (EV'ler) izole eder ve karakterize eder9. Son zamanlarda, EV'lerin önemli metabolik düzenleyiciler olduğu bulundu; bu yöntem, bu adiposit türevli EV'lerin farklı metabolik durumlar altında metabolik etkisini analiz etmek için zorunludur.

Mevcut yöntem koleksiyonunda, ex vivo ve in vitro kültür sistemleri, 3D tüm doku keşfi ve tek hücre analizi dahil olmak üzere AT analizinin çeşitli yönlerini kapsayan son teknoloji protokollere genel bir bakış sunuyoruz. Hiçbir kültür sistemi mükemmel olmasa da, biyolojik soruna uyarlanmış kültür sistemini seçmek önemlidir. Bu nedenle, bu yöntem koleksiyonu, adipositleri in vitro olarak izole etmek, farklılaştırmak ve manipüle etmek için geniş bir prosedür araç kutusu sağlar. Burada açıklanan tüm farklı yöntemlerin birleştirilmesi, AT'nin morfolojisi ve işlevi hakkında fikir sahibi olmanızı sağlayacaktır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bilimsel destekleri ve girdileri için Jean-Francois Tanti ve Mireille Cormont'a müteşekkirdir. Bu çalışma INSERM, Université Côte d'Azur tarafından ve Fransız Ulusal Araştırma Ajansı'ndan (ANR) Geleceğe Yönelik Yatırımlar Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) programı ve Genç Araştırmacı Programı aracılığıyla JG (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON) ve JJ'ye (ANR-20-CE14-0010-01) hibelerle desteklenmiştir.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).">Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).
  2. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).">Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).
  3. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).">Estrada-Gutierrez, G., et al. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).
  4. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).">Gilleron, J., et al. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  5. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).">Czepielewski, R. S., et al. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).
  6. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).">Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).
  7. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).">Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).
  8. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).">Batista, M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).
  9. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).">Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Adipose TissueAdipose Progenitor CellsMurine Adipose DepotsViable AdipocytesStromal Vascular FractionObesity AnalysisAdipocyte FunctionExtracellular VesiclesAdipocyte Culture ModelRNA AnalysisMacrophage Phenotyping3D Imaging

Related Articles