Uygulanamaz
Yöntem makalesi
14 Temmuz 2023
Uygulanamaz
İnsan vücudunun ~%40'ını kaplayan iskelet kası, hareketten solunum ve metabolizmaya kadar kritik fonksiyonları destekleyen önemli bir organdır. Daha da önemlisi, yaralanma sonrasında kendi kendini onarma konusunda benzersiz bir kapasiteye sahiptir ve bu rejeneratif kapasite, ciddi hasarlardan bir aydan kısa sürede tam işlevsel ve yapısal iyileşme sağlar. Bu olağanüstü onarım kapasitesinde, kas kök hücrelerinin merkezi bir role sahip olduğu çeşitli hücre tipleri rol oynamaktadır.
Dünyanın dört bir yanındaki kas araştırmacıları, iskelet kasını fonksiyonel, moleküler ve hücresel seviyelerde analiz etmek için çeşitli testler geliştirdiler. Her tekniğin kendine has güçlü yönleri vardır ve hayvan modelleri üzerinde yapılan in vivo testler, insanlarla ve canlı organizmaların karmaşıklığıyla en alakalı seçeneği temsil eder. Dünya çapındaki araştırma grupları, uluslararası kabul görmüş Değiştirme-Azaltma-İyileştirme (3R) ilkesini göz önünde bulundurarak hayvan araştırmalarını en aza indirmeye çalışırken, in vitro ve ex vivo muadilleri zemin kazanıyor. Bu Yöntemler Koleksiyonu, türler arasında moleküler, hücresel ve fonksiyonel kas çalışmaları için in vivo ve ex vivo modeller sağlamayı amaçlamıştır.
Montandon ve ark.1 , kontrol ve mutant genotipli zebra balıklarında kas rejenerasyon fenotiplerini hızlı bir şekilde karakterize etme tekniklerini tanımlar. İlk olarak, anestezi uygulanmış hayvanlardan çalkalanan materyal kullanılarak embriyolar genotiplendirilir. Genetiği değiştirilmiş embriyoların genotiplenmesini içeren çoğu protokol, embriyonun aynı anda feda edilmesini gerektirdiğinden, bu heyecan verici bir olasılıktır. Daha sonra, zebra balığı larva kas sisteminin belirli bir bölgesinin bıçaklanmasıyla rejenerasyon sağlanır. Sarkomerin optik özellikleri sayesinde, yaralanma sonrası görüntüleme kullanılarak yaralanan kasın bütünlüğü değerlendirilebilir. Bu protokol, rejeneratif kusurlar için farklı mutantları araştırmak için hızlı, potansiyel olarak yüksek verimli bir yöntem olduğu için kas rejenerasyonunu inceleyen bilim adamları için büyük ilgi görmektedir.
Hüttner ve ark.2 ve Pegoli ve ark.3 , kas rejenerasyonunun merkezinde yer alan hücre popülasyonu olan kas kök hücrelerinin hücresel ve moleküler çalışmalarına izin veren bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, erken aktivasyon çalışmalarına ve hücre-niş etkileşimlerine odaklanan araştırmacılar için oldukça ilgi çekicidir. Tek miyofiber kültür yöntemi, kas kök hücrelerinin 96 saate kadar kültürlenmesine ve incelenmesine izin verirken, hala kas lifleriyle ilişkiliyken, bu yakın, endojen, nişten sinyaller alır. Hüttner ve ark.'nın2 dikkatle açıkladığı birçok hassas adım (örneğin, hafif kas diseksiyonu ve dissosiyasyon) nedeniyle tekniğin oluşturulması özellikle zordur. Bir adım daha ileri giderek, yazarlar, kök hücre davranışını etkileyebilecek faktörlerin fonksiyonel analizleri için siRNA hedeflemesini detaylandırıyor ve aynı fare ve kastan siRNA ile transfekte edilmiş hücrelerle kontrol transfekte edilmiş hücreleri karşılaştırmanın öneminin altını çiziyorlar. Buna paralel olarak, Pegoli ve ark.3 bu yöntemin Emery-Dreifuss kas distrofisi ve erken doğum sonrası yaşam bağlamında kas kök hücrelerini incelemek için nasıl ayarlanabileceğini açıklamakta ve bu bağlamda kas kırılganlığı ile bağlantılı zorluklara odaklanmaktadır. Protokol verimliliğini artırmak için, okuyuculara iyi ve kötü hayatta kalma oranına sahip liflerin görüntüleri ile rehberlik ederler ve sindirim süresini "ampirik olarak doğrulama" ihtiyacını vurgularlar.
Zaidan ve ark.4 , her ikisi de alternatif kültür sistemleri altında zorluklar sunan bir dizi başka hücre tipini korurken, hareketsiz benzeri yedek hücrelerin üretimini destekleyen iskelet kasının bir ex vivo kültür sistemini tanımlamaktadır. Bu nedenle, bu yöntem, ilaçlar, siRNA'lar veya vektörler kullanarak moleküler yolları değiştiren koşullar da dahil olmak üzere, sessizlik çalışmalarına veya niş-kök hücre etkileşimlerine odaklanan araştırmacılar için yararlı olabilir. Protokol, arka bacak kaslarının hızlı bir şekilde diseksiyonunu, ardından enzimatik sindirim ve filtrasyonu gerektirir. Daha sonra hücreler kültüre yerleştirilir ve bir hafta içinde yedek hücreler ortaya çıkar. Protokol, Pax7nGFP gibi genetik olarak etiketlenmiş fareler kullanılarak canlı hücre görüntüleme olasılığı ile bu yedek hücrelerin büyük ölçekli amplifikasyonuna izin verir.
Park ve ark.5 nitrat ve nitritin başlıca nitrat depolama organlarından biri olan iskelet kasında nasıl ölçülebileceğini göstermektedir. Açıklanan yöntem, egzersiz fizyolojisi ve nitrik oksit döngüsü ile ilişkili nöromüsküler veya metabolik bozuklukları inceleyen araştırmacılar için özellikle ilgi çekicidir. Nitrat ve nitrit ölçümlerini kolaylaştırmak için önemli teknolojik gelişmeler olmasına rağmen, nihai sonucu etkileyebilecek ve yazarlar tarafından dikkatlice tanımlanan ve karşılaştırılan birkaç parametre vardır (örneğin, homojenizasyon yöntemi, biyopsi boyutu, kas tipi).
Hessel ve ark.6 , mekanik deneyler için yeterli uzunlukta lifler elde etmek amacıyla insan hastaların Tibialis ön kasından biyopsi alınmasına yönelik bir prosedürü ayrıntılı olarak tanımlamaktadır. Yazarlar, yakın zamanda kas hasarı olan hastaların dışlanması gerektiğini vurgulamaktadır. Uygun hastaların bilgilendirilmiş onamı alındıktan sonra, biyopsi toplanması için kastaki en iyi bölgeyi değerlendirmek için ultrason kullanılır. İdeal enjeksiyon yolunu tartıştıktan sonra ekip, özel bir iğne kullanarak biyopsiyi gerçekleştirir. Son olarak, ameliyat sonrası hasta bakımı ve doku işleme yöntemleri detaylandırılır. Bu yöntem, kas liflerinin mekanik çalışmaları için hastalardan doku toplamayı standartlaştırmak isteyen doktor-bilim adamlarının özellikle ilgisini çekmektedir.
Bu Yöntemler Koleksiyonu'nda Brightwell ve ark.7 ve Corona ve ark.8 tarafından mekanik çalışmalar sunulmaktadır. Bu makaleler, küçük ve büyük hayvan modellerinde gücü ölçme yöntemlerini tartışmaktadır. Nöromüsküler hastalık veya yaralanma kas gücünü olumsuz etkiler; Bu nedenle, egzersiz, beslenme ve terapötik müdahaleler onu eski haline getirmeyi amaçlar. Brightwell ve ark.7 , farelerde kuadriseps kas fonksiyonunu insan hastalarda kullanılan yöntemlere benzer bir şekilde değerlendirmek için bir yöntemi detaylandırmıştır. İlk olarak, deney için gerekli ekipman ve yazılımı hazırlamak için adımlar sağlarlar. Daha sonra, fare uyuşturulur ve ekstansör fonksiyonun değerlendirilmesi için pozisyona getirilir. Elektrotlar, kasılmanın indüklenmesi için kuadrisepsin distal kısmına yerleştirilir, optimal bir akım değerlendirilir ve tepe izometrik tetanik tork ölçümleri kaydedilir ve analiz edilir. Corona ve ark.8 daha büyük bir hayvan modeli kullanarak domuz arka bacak dorsifleksör kasındaki izometrik torku değerlendirerek adım adım ekipman ayarlarını ve kuvvet ölçüm protokolünü göstermiştir. Optimum sonuç elde edilmesini sağlamak için yüksek ve düşük kaliteli dalga cepheleri gösterdiklerini belirtmek gerekir. Aynı hayvanın boylamsal analizlerine izin veren bu non-invaziv tekniğin güçlü yönlerinin farkındalar, ancak aynı zamanda kritik adımları (örneğin, sinir stimülasyonu, mekanik hizalama) ve yöntem sınırlamalarını uzun uzadıya tartışıyorlar.
İskelet kası araştırmaları alanında hala birçok önemli soru var: kas rejenerasyonu için hangi genlerin çok önemli olduğu, uydu hücrelerinin bu kadar çok farklı organizmanın yaşamı boyunca rejeneratif potansiyeli nasıl koruduğu ve farklı hastalık koşullarında kas fonksiyonunun nasıl etkilendiği. Bu koleksiyon, çok çeşitli model sistemleri kullanarak moleküler ve mekanik seviyelerde kas fonksiyonunu ve onarımını araştırmak için bir dizi modern tekniği sergiliyor. Bu makalelerin yazarları, ayrıntılı protokoller sağlayarak, temel ve uygulamalı iskelet kası araştırmaları için tutarlılığı ve şeffaflığı artırmaya yardımcı oldular.
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Bu çalışmayı hiçbir dış fon desteklemedi.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste