Method Article

Hücre İçi Organelleri Görselleştirme Yöntemleri

DOI:

10.3791/64966

⸱

March 3rd, 2023

 , 
1Chan Zuckerberg Biohub, 2Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, 3Programs in Human Genetics and Biological Sciences, University of California, San Francisco

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TARTIŞILAN MAKALELER:

Aishwarya, R. et al. Kuantum noktaları aracılı immüno-etiketleme ve ardından transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak kalpteki bir proteinin hücre altı lokalizasyonunun görselleştirilmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi.(187), E64085 (2022).

Liu, B. et al. Mitokondri ve lizozom için floresan boyalarla mitofajinin görselleştirilmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi.(189), E64647 (2022).

Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Floresan protein belirteçleri ile maya organellerini görselleştirme. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi.(182), E63846 (2022).

Zhao, X., Guo, S. Zebra balığı radyal glia progenitörlerinin asimetrik bölünmesi sırasında Notch / Delta endositozunu izlemek için antikor alım testi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 65030 (2022).

Park, S., Zhuang, Y., Shi, X. Etiket tutma genişletme mikroskobu (LR-ExM), süper çözünürlüklü görüntüleme ve yüksek verimli etiketleme sağlar. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi.(188), E63793 (2022).

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlar ve bitkiler de dahil olmak üzere dünyadaki tüm çok hücreli organizmalar, ~1,7 milyar yıl önce tek hücreli ökaryotlardan evrimleşmiştir1. İlkel prokaryotlardan farklı olarak, ökaryotik hücreler, mitokondri, Golgi aygıtı, endoplazmik retikulum (ER), lizozomlar ve veziküller dahil olmak üzere sitoplazmalarında zara bağlı bir çekirdeğe ve zarla çevrili birçok organele sahiptir. Bu organeller, özel biyolojik fonksiyonların ve yüksek verimli metabolik aktivitelerin lokalize olduğu bölmeler oluşturur. Işık mikroskobunun sınırlı çözünürlüğü nedeniyle, hücre içi organellerin çoğu, ışık kırınımı sınırının altına düşen fonksiyonel yapılar içerir ve bu da görselleştirmelerini zorlaştırır2. Yenilikçi mikroskobik ve biyolojik etiketleme teknikleri, ultra ince mimarilerin ve organellerin in vivo dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü görselleştirilmesini sağlamaya başlıyor. Bu koleksiyon, farklı türler arasında farklı hücre içi organelleri başarılı bir şekilde etiketleyen ve görüntüleyen ve böylece organel biyolojisinin uzay-zamansal düzenlemesi hakkındaki anlayışımızı ilerleten son yöntemleri bir araya getiriyor.

Son yıllarda, floresan sensörlerin geliştirilmesi ve canlı hücrelerdeki proteinlerin etiketlenmesi, hücre içi ağların dinamiklerini, sinyal iletimini ve hücre-hücre etkileşimlerini anlamamızı büyük ölçüde kolaylaştırdı. Gelişmiş inorganik sentetik yöntemler kullanılarak, kuantum noktaları veya QD olarak da bilinen nano ölçekli boyuta sahip floresan yarı iletken nanokristaller, yeni bir optik raportör sınıfı olarak icat edilmiştir. Normalde, QD partikülleri 2-10 nm boyutundadır ve hücrelere karşı yüksek ışığa duyarlılık, stabilite ve düşük sitotoksisiteye sahiptir. QD parçacıkları, hücre içi süreçleri yüksek çözünürlükte görüntülemek için organik boyalara ve floresan proteinlere alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Aishwarya ve arkadaşlarının protokolünde, yazarlar QD aracılı immüno-etiketlemeyi ve ardından transmisyon elektron mikroskobu (TEM)3 ile görüntülemeyi tanımlamaktadır. Yazarlar, süper çözünürlükte TEM altında antikor hedefli QD etiketleme ve görüntüleme gerçekleştirerek, yetişkin fare kalp hücrelerinde çoklu hücre organellerinde Sigmar1 lokalizasyonunu başarıyla görselleştirdiler ve lizozomlar ve mitokondriyal zarlar üzerindeki zenginleşmesini vurguladılar. Yazarlar, QD-TEM'in yüksek çözünürlüğünü ve yüksek hassasiyetini vurgulamanın yanı sıra, yöntemlerin çeşitli dezavantajlarından da bahsetmektedir. Örneğin, QD aracılı immün etiketlemede kullanılan osmiyum tetroksit, numunenin özelliklerini geri döndürülemez şekilde yok eder ve fiksasyon ve antijen maskesini kaldırma adımlarının optimizasyonu, yüksek kaliteli görüntüler sağlamak için önemli ancak zorlu bir unsurdur.

QD'nin yanı sıra, canlı hücrelerde organelleri etiketlemek için birçok farklı boya başarıyla uygulanmıştır. Bu yöntemler, hücre organellerinin in vivo transformasyon veya translokasyon sürecinin canlı görüntülenmesini kolaylaştırmıştır. Bazen, farklı organel türlerini aynı anda görselleştirmek için birden fazla organele özgü boya kullanılır. Liu, Li ve ark.4 tarafından hazırlanan protokolde, yazarlar iki farklı boya kullanarak fare embriyonik fibroblast (MEF) hücrelerinde hem mitokondri hem de lizozomların canlı boyanması ve görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır: MitoTracker Green ve LysoTracker Red4. Bu çalışmada, her iki boya da sırasıyla mitokondri ve lizozomlara özgü yüksek floresan duyarlılığı ve stabilite gösterdi. Ayrıca yazarlar, protokolü kullanarak MEF hücrelerinde karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) tarafından indüklenen kritik in vivo hücresel mitofaji sürecini başarıyla gözlemlediler ve kaydettiler. Tartışmada yazarlar, protokolün boya konsantrasyonunu ve boyama süresini optimize ederek farklı hücre dizileri veya dokulardan alınan hücrelerle uygulanabileceğinden bahsetmektedir.

Floresan etiketlere kaynaşmış organele özgü proteinlerden oluşan raportör yapılarından yararlanılarak, immünoetiketleme olmadan in vivo organel dinamikleri ve ekspresyon modelleri gözlemlenebilir. Liu, Zhu ve ark.5 tarafından hazırlanan protokolde, yazarlar, canlı tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae5'teki çoğu hücre altı organel tipinin görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar. Tomurcuklanan maya ile çalışmaya yeni başlayanlar için bu protokol, protein hücre altı lokalizasyonunun nasıl tanımlanacağını ve hızlandırılmış görüntüleme kullanılarak ilgilenilen organellerin nasıl izleneceğini öğrenmek için yararlıdır. Protokolün bir sınırlaması, protokolde kullanılan yapıların çoğunun diğer türlerdeki organelleri etiketlemek için kullanılamamasıdır. Farklı ökaryotik hücre türleri için, organele özgü floresan protein modellerinin yine de antikor immün boyama ile doğrulanması gerekecektir.

İlk olarak Drosophila notum6'nın duyu organı öncüllerinde endozomal Çentik/Delta sinyalinin spesifik canlı etiketlenmesi için bir antikor alım testi geliştirildi. Notch/Delta sinyallemesinin doza duyarlı doğası nedeniyle, hücrelerin içinde bir raportör yapısının eksprese edilmesi, Notch/Delta sinyalini in vivo olarak görselleştirmek için uygun değildir, çünkü raportörle kaynaşmış genin fazladan bir kopyası normal sinyalleşmeyi ve dolayısıyla hücre kaderini kesintiye uğratacaktır. Zhao ve Guo7 tarafından hazırlanan protokolde, yazarlar, gelişmekte olan zebra balığı beyninin7 radyal glia atalarında Notch/Delta endozomal trafiğini görüntülemek için antikor alım testini uygularlar. Protokolde, anti-DeltaD-Atto647N konjuge antikorunun tam olarak 24 hpf (döllenmeden saatler sonra) embriyonik arka beyin ventrikülüne mikroenjekte edilmesinden sonra, tüm endozomal kaçakçılık süreci, radyal glia progenitörlerinin mitozu boyunca içselleştirilmiş anti-DeltaD-Atto647N antikoru kullanılarak kaydedilir. Çalışmada, antikor alım testinin Notch/Delta sinyallemesine müdahale etmediği bulundu. Bu protokol, ilgilenilen proteinin hücre dışı alanına karşı bir antikorun mevcut olması koşuluyla, diğer membran ligand-reseptör sinyallerini görselleştirmek için kullanılabilir.

Numunenin şişebilen bir hidrojel içinde fiziksel olarak genişletilmesini içeren genleşme mikroskobundaki (ExM) son gelişmeler, geleneksel konfokal mikroskopların süper çözünürlüklü görüntüleme için kullanılmasını sağlamıştır. ExM, icadından bu yana birçok farklı biyolojik numune türüyle test edilmiştir8. ExM'nin ana zorluklarından biri, polimerizasyon ve sindirim adımları sırasında floresan sinyal kaybıdır. Yakın zamanda geliştirilen etiket tutma ExM, üç işlevli ankrajlar9 ile ilgili sorunu çözmüştür. Park ve ark.10 tarafından hazırlanan protokolde, yazarlar bir dizi üç işlevli çapa10 ile etiket tutma ExM'nin (LR-ExM) nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır. Protokol, yalnızca sinyal kaybını önleyerek değil, aynı zamanda SNAP veya CLIP etiketleriyle yüksek verimli etiketlemeyi teşvik ederek genişleme mikroskobu görüntülemeyi geliştirir. Yazarlar çalışmalarında, çeşitli hücre altı yapılar için çok renkli LR-ExM'yi başarıyla gösterdiler ve LR-ExM'yi süper çözünürlüklü stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) ile birleştirirken tek moleküler çözünürlük elde ettiler.

Süper çözünürlüklü mikroskopinin hızlı gelişimi ve yeni floresan etiketleme tekniklerinin ortaya çıkmasıyla, hücre içi organelleri benzeri görülmemiş bir çözünürlükte görselleştirmek için yöntem ve protokollerde daha fazla gelişme bekleyebiliriz. Bu çabalar, hücre içi organellerin dinamiklerini ve işlevlerini anlamada yeni atılımlar getirmeye hazırlanıyor.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proje, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH), R01NS120218 numaralı hibe, UCSF Mary Anne Koda-Kimble Tohum İnovasyon Ödülü ve Chan Zuckerberg Biohub tarafından desteklenmiştir.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooper, G. The Cell: A Molecular Approach. Second edition. , Sinauer Associates. Sunderland, MA. (2000).
  2. Myers, K., Janetopoulos, C. Recent advances in imaging subcellular processes [version 1; peer review: 2 approved. F1000Research. 5, F1000 Faculty Rev 1553(2016).
  3. Aishwarya, R., et al. Visualizing subcellular localization of a protein in the heart using quantum dots-mediated immuno-labeling followed by transmission electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (187), e64085(2022).
  4. Liu, B., et al. Visualizing mitophagy with fluorescent dyes for mitochondria and lysosome. Journal of Visualized Experiments. (189), e64647(2022).
  5. Liu, C. Y., Zhu, J., Xie, Z. Visualizing yeast organelles with fluorescent protein markers. Journal of Visualized Experiments. (182), e63846(2022).
  6. Le Borgne, R., Schweisguth, F. Unequal segregation of neuralized biases Notch activation during asymmetric cell division. Developmental Cell. 5 (1), 139-148 (2003).
  7. Zhao, X., Guo, S. Antibody uptake assay for tracking Notch/Delta endocytosis during the asymmetric division of zebrafish radial glia progenitors. Journal of Visualized Experiments. , e65030(2023).
  8. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: Principles and uses in biological research. Nature Methods. 16, 33-41 (2019).
  9. Shi, X., et al. Label-retention expansion microscopy. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202105067(2021).
  10. Park, S., Zhuang, Y., Shi, X. Label-retention expansion microscopy (LR-ExM) enables super-resolution imaging and high-efficiency labelin. Journal of Visualized Experiments. (188), e63793(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

VisualizationIntracellular OrganellesQuantum DotsImmuno labelingTransmission Electron MicroscopyMitophagyFluorescent DyesMitochondriaLysosomeYeast OrganellesFluorescent Protein MarkersNotch Delta EndocytosisAsymmetric DivisionZebrafish Radial Glia ProgenitorsLabel retention Expansion MicroscopySuper resolution Imaging

Related Articles