Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Bu protokol, polimer destekli damlacık arayüzlü çift katmanlı (DIB) membranlarda membran proteinlerinin membran mobilitesi ile iyon kanalı geçirgenliği arasındaki korelasyonun nasıl çalışılacağını açıklamayı amaçlamaktadır ^1,2,3.

Mevcut teknik, tek parçacık izleme ^4,5, floresan korelasyon spektroskopisi ^6,7 ve yüksek hızlı atomik kuvvet mikroskobu ^8,9,10 gibi etkileyici bir dizi gelişmiş optik ve yüzey analitik aracını tamamlamaktadır. Bunlar, membran bazlı reaksiyonları etkileyen membranların dinamik bileşimi ve yapısı hakkında değerli bilgiler sağlar^11,12,13. Proteinlerin hareketi ve yanal difüzyonu, membrandaki proteinlerin yerel yoğunluğuna bağlı olsa da, bireysel protein molekülleri de lipit sallarında¹⁴ ve protein-protein etkileşimleri ^15,16 ile tutulabilir. Membrandan hücre dışı ortama veya sitosol'e çıkıntı yapan protein alanlarına bağlı olarak, protein hareketliliği oldukça hareketliden tamamen hareketsizliğe kadar değişebilir. Bununla birlikte, membranın karmaşıklığı ve periferik yapıları nedeniyle, yanal hareketliliğin doğası ile protein fonksiyonu arasındaki etkileşimi deşifre etmek genellikle zordur¹⁷.

DIB membranlarının, membran proteinlerinin biyofiziksel tek moleküllü analizleri için etkili bir platform olduğu kanıtlanmıştır 18,19,20,21,22. Bir lipit/yağ fazında sulu damlacıkların hidrojel destekli substratlarla teması yoluyla lipitlerin kendi kendine montajı ile oluşurlar. Yaygın olarak kullanılan desteklenen lipit çift katmanlarına (SLB'ler)1,23,24,25 benzer şekilde, DIB'ler^, uygun ligandlarla işlevselleştirildiğinde proteinlerin polimer matrisine geçici veya kalıcı olarak bağlanmasıyla yanal hareketliliğin lokal olarak ayarlanmasına izin verir¹⁷. İkincisi, heterojen bir protein dağılımına sahip hücre zarlarındaki biyokimyasal işlemler için bir model sistem olarak hizmet edebilir¹⁰.

Burada açıklanan deneysel yaklaşım, TIRF mikroskobu kullanarak membran ^2,22'ye yakın bir yerde bireysel kanallardan Ca2+ iyon akısını ölçmek için Ca2⁺ duyarlı boyaların floresansına dayanır. Bu optik yaklaşım, numunenin aydınlatılmasını, kaçan uyarma ışığının fiziksel özellikleri nedeniyle, floresan arka planın önemli ölçüde azalmasına yol açan membrana yakın bir mesafeyle sınırlar. İkincisi, tek moleküllerin tespiti için yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük gerekiyorsa bir önkoşuldur. Klasik elektrofizyolojik yöntemlerin^{aksine 26,27,} iyon akısını tek tek kanallardan incelemek için membran voltajlarına gerek yoktur. Ayrıca, yöntem, membrandaki kanalların yanal hareketine müdahale edebilecek floresan boyalar veya moleküllerle etiketleme gerektirmez.

Bu yöntem, klasik elektrofizyolojiyi kullanmadan membrana gömülü protein kanallarını tek molekül seviyesinde incelemek için özellikle yararlıdır. Neurospora crassa 28,29,30'dan mitokondriyal protein ileten kanal TOM-CC'yi ve Escherichia coli 17,31'in dış zarı boyunca küçük hidrofilik moleküllerin difüzyonunu destekleyen OmpF'yi kullanarak, iki proteinin membran hareketliliklerinin ve kanal aktivitelerinin nasıl incelenebileceğini ve ilişkilendirilebileceğini gösteriyoruz. Bu yaklaşımın, TOM-CC ve OmpF için optimize edilmiş olmasına rağmen, diğer protein kanallarına kolayca uygulanabileceğini öneriyoruz.

1. Protein üretimi

NOT: Bu bölümde, LamB ve OmpC'den yoksun olan Escherichia coli BE BL21(DE3) omp6^31,32'den OmpF'yi ve Neurospora crassa'dan TOM çekirdek kompleksini izole etme prosedürü açıklanmaktadır (Şekil 1)^28,29. İkincisi, TOM alt birimi Tom22'nin 6xHis etiketli bir formunu içeren bir N. crassa suşu^28'den izole edilmiş mitokondri gerektirir (Şekil 1A), tarif edildiği gibi izole edilebilir²⁸. Aşağıdaki protokoller genellikle 1-2 mg N. crassa TOM-CC ve 10 mg E. coli OmpF verir. Miktar ayarlanacaksa, protein/deterjan oranlarının tam olarak korunması önemlidir. Aksi belirtilmedikçe, tüm adımlar 4 °C'de gerçekleştirilmelidir.

1. TOM çekirdek kompleksinin izolasyonu
   1. Bausewein ve ark.30'a göre, yaklaşık 1.5 kg (ıslak ağırlık) hiften diferansiyel çökeltme ile elde edilen saflaştırılmış N. crassa mitokondrisini (2 g protein), 20 mM Tris-HCl (pH 8.5), %1 (w/v) DDM, (v/v) gliserol, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol ve 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) içinde 10 mg/mL'lik bir protein konsantrasyonunda 4 °C'de ³⁰ dakika boyunca çözün.
      DİKKAT: PMSF toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
   2. Çözünür mitokondrileri ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve çözünmeyen membranları, 4 ° C'de 40 dakika boyunca 130.000 x g'de ultrasantrifüjleme ve standart sınıf filtre kağıdı ile filtreleme yoluyla çözünür membran proteinlerinden ayırın.
   3. Otomatik bir protein saflaştırma sistemi kullanarak önceden paketlenmiş bir Ni-NTA sütununu (5 mL hacim) yaklaşık 5 sütun hacmi (CV) tampon A1 (Tablo 1) ile dengeleyin. Ni-NTA sütununu tüm adımlarda 1 mL/dak sabit akış hızında çalıştırın. Proteinler 2 g'dan az mitokondriden izole edilmişse daha düşük hacimli bir sütun (1 mL) kullanın.
   4. Çözünür protein numunesini Ni-NTA kolonuna 1 mL/dak akış hızında yükleyin.
   5. Bağlanmamış proteinleri çıkarmak için Ni-NTA sütununu 5 CV tampon A1 (Tablo 1) ile yıkayın.
   6. His etiketli TOM-CC'yi 0 tampon A2 (Tablo 1; 300 mM imidazol) ile elute edin ve 280 nm kromatogramda göründüğü gibi protein tepesini toplayın (Şekil 1B).
   7. TOM-CC'nin daha fazla saflaştırılması için, otomatik protein saflaştırma sistemini kullanarak önceden paketlenmiş anyon değişim sütununu (1 mL) B1, B2 ve B1 tamponlarının her biri 5 CV ile dengeleyin (Tablo 1). Tüm adımlarda anyon değişim sütununu 1 mL/dak sabit akış hızında çalıştırın.
   8. TOM-CC tepe fraksiyonunu (adım 1.1.6) anyon değişim sütununa (1 mL/dak akış hızı) yükleyin.
   9. Kolonu 5 CV tampon B1 (Tablo 1) ve% 0-20 tampon B2 doğrusal tuz gradyanı ile yıkayarak bağlanmamış proteinleri çıkarın (Tablo 1).
   10. TOM-CC'yi -5 tampon B2 doğrusal tuz gradyanı ile değerlendirin ve 280 nm kromatogramda göründüğü gibi protein tepe fraksiyonunu toplayın (Şekil 1C).
   11. Numune saflığını SDS-PAGE ile değerlendirin (Şekil 1D) ve üreticinin protokolüne göre ticari olarak temin edilebilen bir protein testi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin (bkz.
   12. Protein numunelerini sıvı azotta dondurun ve bir sonraki kullanıma kadar -80 °C'de saklayın.
       DİKKAT: Sıvı azot iyi havalandırılan alanlarda kullanılmalıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
        
2. OmpF İzolasyonu
   1. LamB ve OmpC^32'den yoksun olan E. coli suşu BE BL21 (DE3) omp6'yı steril koşullar altında donmuş bir gliserol stoğundan geri kazanın ve bir Luria-Bertani (LB) agar plakasına çizin (Tablo 2). Bunu yapmak için, numuneyi yavaş yavaş tüm plakaya eşit olarak yayın.
   2. Plakayı kapak kapalıyken ters çevirmeden ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe etmeden önce numunenin 5 dakika boyunca agarın içine batırılmasına izin verin.
   3. Tek bir E. coli kolonisi seçin, steril bir kürdan kullanarak bu tek koloni ile 7.5 mL LB ortamını (Tablo 2) aşılayın ve 37 ° C'de ajitasyon (170 rpm) ile gece boyunca (14 saat) büyümeye bırakın.
   4. Steril pipetli 2 x 1 mL E. coli hücrelerini 2 x 500 mL LB ortamına aktarın (Tablo 2) ve bir çalkalayıcıda ajitasyonla (~170 rpm) 37 ° C'de gece boyunca (~14 saat) büyümeye bırakın.
   5. Hücreleri 4 ° C'de 20 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüjleme yoluyla toplayın, pelet sıvı azotta dondurun ve bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Hücre peletinin ıslak ağırlığı tipik olarak 1 L kültür başına 5 g'dır. Bu noktada, protokol duraklatılabilir.
   6. Hücreleri (2 g) 20 mL lizis tamponu C1'de (Tablo 2) çözün ve yeniden askıya alın ve süspansiyonu, üreticinin talimatlarına göre, maksimum numune hacmi 35 mL'lik olan önceden soğutulmuş (4 ° C) yüksek basınçlı hücre bozulma sisteminden 1.000 psi'de üç kez geçirin.
      DİKKAT: Fransız basınının kullanılması ciddi yaralanmalara yol açabilir. Kullanılan hücrenin basınç sınırını asla aşmayın. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
   7. Kırılmamış hücreleri 15 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüjleme ile lizattan çıkarın ve süpernatanı toplayın.
   8. Membranları 1 saat boyunca 100.000 x g'de ultrasantrifüjleme ile toplayın.
   9. Membran peletini 10 mL tampon C2'de (Tablo 2) tekrar askıya alın ve bilyalı yataklı cam homojenizatör kullanarak eşit hacimde SDS tampon C3 (Tablo 2) ile karıştırın.
      DİKKAT: C3 tamponundaki β-merkaptoetanol toksiktir. İlgili tüm güvenlik düzenlemelerine uyun.
   10. Süspansiyonu 50 ° C'de bir su banyosunda 30 dakika boyunca inkübe edin.
   11. Numuneyi 100.000 x g'de 20 °C'de 1 saat boyunca santrifüjleyin.
   12. Bilyalı yataklı cam homojenizatör kullanarak membran peletini 10 mL SDS tampon C4'te (Tablo 2) yeniden askıya alın ve süspansiyonu 30 dakika boyunca 37 °C'de bir su banyosunda inkübe edin.
       NOT: Pelet yeniden askıya alınamıyorsa, 20 mL'lik bir hacme kadar daha fazla SDS tampon C4 ekleyin.
   13. Numuneyi 20 °C'de 100.000 x g'de 30 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı toplayın.
   14. Süpernatantı oktil polioksietilen (oktil POE) ile %0,5'lik (w/v) nihai deterjan konsantrasyonuna kadar karıştırın ve numuneyi 24 saat boyunca 4 °C'de tampon C5'e (Tablo 2) karşı iki kez diyaliz edin. Bu amaçla, üreticinin talimatlarına göre 20 kDa'lık bir kesimle diyaliz tüpü kullanın ve numuneyi diyaliz tüpüne veya cihazına yerleştirin.
       NOT: Diğer moleküler kütlelere sahip proteinlerin diyalize edilmesi durumunda diyaliz tüpünün kesilmesinin ayarlanması gerekir.
   15. Numune saflığını SDS-PAGE ile değerlendirin ve üreticinin protokolüne göre ticari olarak temin edilebilen bir protein testi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin (Malzeme Tablosu).
       NOT: 95 °C'ye ısıtılan numuneler monomerik OmpF gösterir. Isıtılmamış numuneler OmpF'yi trimerik formunda gösterir (Şekil 1F).
   16. Şokla dondurulan OmpF, sıvı azot içindeki alikotlarda diyalizlenir ve daha sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de saklanır.
       DİKKAT: Sıvı azot iyi havalandırılan alanlarda kullanılmalıdır. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.

2. DIB membranlarında iyon kanallarının optik tek kanallı kaydı

NOT: Bu bölümde, tek iyon kanalları¹⁷ üzerinden yanal protein hareketini ve iyon akısını izlemek için mikrofabrikasyon polimetil metakrilat (PMMA) odaları^2'de DIB membranlarının hazırlanması prosedürü açıklanmaktadır. Odanın üretimi için boyutlar ve kesin çizimler Lepthin ve ^ark.2'de bulunabilir. Şekil 2, PMMA haznesi^2'nin montajına ve DIB membranlarının oluşumuna genel bir bakış sunmaktadır. Aksi belirtilmedikçe, tüm adımlar oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilir. Şekil 3, bir DIB membranının şematik bir temsilini ve tek kanallı bir proteinden geçen Ca^{2 +} akının, hem membrandaki hareketi hem de kanalın açık-kapalı durumunu izlemek için nasıl kullanıldığını göstermektedir.

1. Lipitlerin hazırlanması
   1. Kloroform içinde çözünmüş 1,2-difitanoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (25 mg/mL DPhPC) içeren lipit stok çözeltisini -20 °C'de dondurucudan çıkarın ve RT'ye ısındırın. Bu amaçla, numuneyi birkaç dakika boyunca elle yavaşça ısıtmak genellikle yeterlidir.
      DİKKAT: Kloroform toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve bir duman davlumbazının altında kloroform içeren tüm prosedürleri uygulayın.
   2. 380 μL DPhPC stok çözeltisini (25 mg/mL DPhPC) bir cam şişeye aktarın. Kauçuk sızdırmazlıklı pipetlerden kaçının. Bunun yerine, paslanmaz çelik pistonlu mikrolitre cam şırıngalar kullanın.
   3. Lipit stok çözeltisini işledikten sonra, lipit oksidasyonunu önlemek için lipit stok çözeltisini Ar veya_N2 gazı ile kaplayın. Lipitlerin çözündüğü organik çözücünün buharlaşmasını veya çözücü spreylerinin şişeden sıçramasını önlemek için mümkün olan en düşük gaz akışını kullanın. Organik çözücülü lipitler içeren cam şişelerin kapaklarının iç kısımda politetrafloroetilen (PTFE) ile kaplandığından emin olun.
   4. Lipit numunesini (adım 2.1.2) bir_N2 akışı altında kurutun ve kalan organik çözücüyü yağsız bir vakum pompası kullanarak gece boyunca vakum altında (2.0 mbar) lipit numunesinden çıkarın.
   5. 9.5 mg/mL'lik nihai lipit konsantrasyonuna mikrolitre cam şırınga kullanarak eşit miktarda hekzadekan ve silikon yağı (her biri 500 μL) ekleyerek lipit filmini hekzadekan/silikon yağı çözeltisi içinde çözün.
      NOT: Lipit çözeltisi RT'de birkaç hafta stabildir.
2. Agaroz hidrojelinin hazırlanması
   1. Çift deiyonize suda yaklaşık 1 mL düşük erime noktalı agaroz çözeltisi (% 0.75 [w / v]) hazırlayın ve spin kaplama cam örtülerinde kullanılmak üzere 20 dakika boyunca bir ısıtma bloğunda 85 ° C'ye ısıtın.
      NOT: Agaroz çözeltisi RT'de birkaç hafta tutulabilir ve birkaç kez yeniden ısıtılabilir.
   2. 0,66 M CaCl 2 ve 8,8 mM HEPES (pH 7,2) içinde düşük erime noktalı%_2,5 (w / v) agaroz çözeltisi hazırlayın ve 20 dakika boyunca bir ısıtma bloğunda 85 ° C'ye ısıtın. Agarozun iyi eridiğinden emin olun.
      NOT: Agaroz çözeltisi RT'de birkaç hafta tutulabilir ve tıpkı spin kaplama için kullanılan agaroz (adım 2.2.1) gibi birkaç kez yeniden ısıtılabilir.
3. Polimetil metakrilat (PMMA) haznesi tertibatı ve hidrojel hekzadekan/silikon yağ arayüzünde lipit tek katmanlı oluşumu
   1. Bazı cam kapak kapaklarını (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) paslanmaz çelik bir kapak tutucusuna yerleştirin ve ultrasonik bir temizleyicide asetonla 10 dakika boyunca bir cam beherde temizleyin. Kapakları suya batırmak için yeterli aseton kullanın ve temizleme işlemi sırasında buharların kaçışını en aza indiren basınçsız, kapalı bir sistem oluşturmak için beheri gevşek bir şekilde cam bir plaka ile örtün.
      DİKKAT: Aseton, düşük parlama noktasına sahip oldukça yanıcı bir çözücüdür. Buhar/hava karışımları patlayıcıdır. Ultrasonik temizleyiciyi iyi havalandırılan bir alanda çalıştırın. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve resmi güvenlik önlemlerine uyun (örneğin, açık alev ve kıvılcım yok).
   2. Cam kapakları çift deiyonize suyla durulayın ve bir_N2 akışı altında kurutun.
      NOT: Bu şekilde temizlenen kapak fişleri birkaç hafta boyunca saklanabilir.
   3. Bir plazma temizleyicideki bir kapak kaymasını 5 dakika boyunca oksijenle (0,5 mbar) daha da temizleyin ve hidrofilize edin.
      NOT: Bu adımı, plazma temizlemenin hidrofilik etkisi zamanla aşındığından, agaroz çözeltisi ile spin kaplamadan hemen önce gerçekleştirin.
   4. Plazma işlemli bir kapak kaymasını bir spin kaplayıcı üzerine monte edin (Şekil 2, adım 1).
   5. 200 μL'lik bir pipet kullanarak, 30 sn boyunca 3.000 rpm'de 140 μL ısıtılmış% 0.75 (w / v) düşük erime noktalı agaroz (adım 2.2.1) yavaşça ekleyerek kapak kaymasını mikrometre kalınlığında bir agaroz filmi ile kaplayın (Şekil 2, adım 1).
      NOT: Agaroz filminin kalınlığı,^17'de açıklandığı gibi atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile belirlenebilir.
   6. Spin kaplı kapak kaymasını, agaroz hidrojelinin ince tabakası ile derhal PMMA odası^2'nin alt tarafına takın. Agaroz hidrojelinin yukarı doğru işaret ettiğinden emin olun (Şekil 2, adım 2).
   7. Kapak kaymasının kenarlarını şeffaf yapışkan bant ile PMMA mikro işlenmiş cihaza sabitleyin.
   8. PMMA cihazını 35 °C'ye ısıtılmış bir sıcak plakaya yerleştirin (Şekil 2, adım 3).
   9. Hava kabarcıkları oluşturmadan, 200 μL% 2.5 agaroz çözeltisinin (adım 2.2.2) odanın girişine bir pipetle (Şekil 2, adım 3) dikkatlice dökün, böylece spin kaplama ile uygulanan ince hidrojel% 2.5 agaroz çözeltisinin tamponu ile dengelenebilir ve hidratlanmış kalabilir. % 2.5 agaroz çözeltisinin, spin kaplı agaroz hidrojelinin etrafına yayıldığından ancak üzerine yayılmadığından emin olun (Şekil 3A), PMMA odasını ısıtma plakasına hafifçe bastırarak önlenebilir.
   10. Agaroz-yağ arayüzünde lipit tek katmanlı oluşumunu başlatmak ve PMMA odasının kuyularında spin kaplı agarozun dehidrasyonunu önlemek için PMMA odasının kuyularını (Şekil 2, adım 4) toplam 60 μL lipit/yağ çözeltisi (adım 2.1.5) ile derhal örtün. Cihazı yaklaşık 2 saat boyunca 35 ° C'de bir sıcak plakada tutun.
       NOT: PMMA odasındaki dairesel kuyular, daha önce yayınlanan çalışma^2'ye göre 0,5 mm çapa ve 1,8 mm derinliğe sahiptir.
4. Lipid kaplı sulu damlacıkların hekzadekan/silikon yağ çözeltisinde hazırlanması
   1. Bir damlacık inkübasyon odasındaki birkaç mikrofabrikasyon kuyucuğun her birine 20 μL lipid hekzadekan/silikon yağı çözeltisi (adım 2.1.5) yerleştirin (Şekil 2, adım 4). Lipid hekzadekan/silikon yağı çözeltisi için uygun kaplar, ince bir PMMA plaka^2'de 40 mm x 30 mm x 3,5 mm'lik küçük girintilerdir.
   2. Dikey veya yatay bir mikropipet çektirme makinesi (ör. yama pipetleri veya keskin cam elektrotlar yapmak için kullanılır) kullanarak uç açma çapı 20 μm olan bir mikrokapiler cam iğne hazırlayın. Mikrokapiler cam iğnenin açılma çapını, 7,5x ile 35x arasında bir yakınlaştırma aralığında, düşük büyütmede bir dürbün stereomikroskop altında tahmin edin.
      NOT: Cam kılcal damar çekilmeden önce ön ısıtma modu, çekme için ısıtma modu ve çekiş kuvveti ayarları, üreticinin çekme cihazının özelliklerine ve kılcal damar tipine göre deneysel olarak önceden belirlenmelidir.
   3. Mikrokapiler cam iğneyi, 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl ve 30 nM TOM çekirdek kompleksi içeren 5 μL sulu enjeksiyon çözeltisi veya alternatif olarak bir mikrokapiler pipet ucu kullanarak 20 nM OmpF ile doldurun. Sulu enjeksiyon çözeltisini hazırlamak için sadece çok değerli metal iyonlarını (Ca²⁺) bağlayan bir şelatlama reçinesi ile daha önce işlenmiş çift damıtılmış su kullanın.
   4. Mikrokapiler cam iğneyi, piezo tahrikli bir nanoenjektör üzerine sulu enjeksiyon çözeltisi ile monte edin.
   5. Nanoenjektörü kullanarak lipid hekzadekan/silikon yağı çözeltisi (bkz. 2.1.5) ile doldurulmuş damlacık inkübasyon odasındaki kuyucuklara 8.8 mM HEPES (pH 7.2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1.32 M KCl ve 30 nM TOM çekirdek kompleksi (adım 1.1.12) veya alternatif olarak 20 nM OmpF (adım 1.2.16) içeren 100-200 nL sulu damlacıkları (Şekil 2, adım 4) enjekte edin. Damlacıkların birbirine temas etmediğinden emin olun, birkaç milimetre (>10 mm) aralıklarla kuyucuklara yerleştirin. Aksi takdirde, yağ / tampon arayüzünde lipit monokatmanları henüz oluşmamışsa, daha büyük damlacıklar halinde birleşirler.
      NOT: Sınıf kılcal damarlar ve nanoenjektörler mevcut değilse, damlacıklar alternatif olarak^2'de açıklandığı gibi 0,1 μL ile 0,5 μL arasındaki hacimler için tek kanallı mikrolitre pipetlerle manuel olarak hazırlanabilir. Ancak bu durumda, damlacık hacimleri o kadar doğru değildir.
   6. PMMA ve damlacık inkübasyon odalarını (Şekil 2, adım 4) 35 °C'ye ısıtılmış bir sıcak plaka üzerinde tutarak damlacık/yağ arayüzünde yaklaşık 2 saat boyunca bir lipit tek tabaka oluşumuna izin verin.
5. DİB membranlarında tek iyon kanallarının hazırlanması ve görüntülenmesi
   1. Tek kullanımlık polipropilen uçlu tek kanallı bir mikrolitre pipet kullanarak, stereomikroskop altında damlacık inkübasyon odasının kuyucuklarından PMMA odasının kuyucuklarına (Şekil 2, adım 5) tek tek sulu damlacıkları manuel olarak aktarın. Damlacıkların, damlacıklar ve agaroz hidrojel arasında bir lipit çift katmanı (Şekil 3) oluşturmak için yaklaşık 5 dakika boyunca hidrojel-yağ arayüzlerinde oluşan lipit monokatmanlarına batmasına izin verin (Şekil 3).
   2. PMMA haznesini ters çevrilmiş bir ışık mikroskobunun numune tutucusuna DIB membranlarla monte edin ve 10x Hoffman modülasyon kontrast hedefi kullanarak membran oluşumunu değerlendirin (Şekil 2, adım 6). DIB membran oluşumu, damlacık ve hidrojel arasındaki arayüzde berrak beyaz bir halka ile gösterilir (Şekil 4A). Kırılan DİB membranları bu halkayı göstermez (Şekil 4B).
      NOT: Alternatif olarak, DIB membranları faz kontrastı veya diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu ile 10x büyütmede görselleştirilebilir.
   3. DIB membranları oluşmuşsa, ~ 0,16 μm'lik bir piksel boyutu elde etmek için PMMA odasını epifloresan aydınlatması için geleneksel bir ışık kaynağı, 488 nm lazer (P_max = 100 mW) ve arkadan aydınlatmalı elektron çarpan CCD kamera (512 x 512 piksel; >% 95 QE) ile donatılmış bir TIRF mikroskobunun (Şekil 2, adım 7) numune tutucusuna monte edin.
   4. GFP filtre seti kullanarak yüksek yoğunluklu bir ışık kaynağı ile epifloresan aydınlatma altında 10x büyütme hedefine sahip bir DIB membranının kenarına odaklanın.
   5. DIB membranının aynı kenarını 100x/N.A. 1.49 apokromat yağ TIRF hedefi ile, yine epifloresan aydınlatma altında, damlacıktaki floresan boya Fluo-8'in zayıf arka plan floresansını görselleştirmeye izin veren bir GFP filtre seti kullanarak yüksek yoğunluklu ışık kaynağı ile yüksek büyütmede ince odaklayın (Şekil 4C).
   6. GFP'den dört bantlı TIRF filtre kümesine filtre ayarını değiştirin.
   7. 488 nm lazeri açın ve objektif lensteki lazerin yoğunluğunu 8 mW ile 10 mW arasında bir değere ayarlayın.
      NOT: Objektif lensteki lazer yoğunluğu hakkında genellikle nicel bir bilgi bulunmadığından, lazer yoğunluğu ayarları, üreticinin spesifikasyonlarına göre, fotodiyot sensörü ile donatılmış bir optik lazer güç ölçer ile lenste ayrı ölçümlerde önceden kalibre edilmelidir.
      DİKKAT: Lazerin güvenli çalışmasını sağlamak için, operatör lazer radyasyonunun olası tehlikelerinin ve kaza önleme yönetmeliklerinin farkında olmalıdır.
   8. Tek iyon kanallarını görselleştirmek için, TIRF açısını ve EMCCD kamera kazancını (örneğin, EM kazanç çarpanı ayarı: 285) DIB membranındaki açık iyon kanallarının koyu bir arka plan üzerinde yüksek kontrastlı floresan lekeler olarak görünmesi (Şekil 4D-G) ve görsel olarak incelendiğinde sinyal-arka plan oranı maksimuma ulaşacak şekilde ayarlayın. Tek iyon kanalları aracılığıyla Ca^{2 +} -akıyına karşılık gelen noktaların odakta kalmasını ve merkezde yüksek yoğunlukta ve çevreye doğru kademeli olarak azalan yuvarlak bir şekle sahip olmasını sağlayın. Kanalsız membranlar sadece arka plan floresansını gösterir (Şekil 4C).
   9. Tek tek kanalların zaman içindeki hareketini ve açık-kapalı aktivitesini kaydetmeden önce, iyon kanallarının DIB membranlarına yeniden oluştuğundan ve membran düzleminde yanal olarak hareket ettiğinden emin olmak için floresan noktaların odakta olup olmadığını kontrol edin. Durum böyle değilse, bir floresan molekülünün lazer tarafından zarın yakınında üretilen kaçan alana girip çıktığını gösterebilir.
   10. Konumun düzgün bir şekilde izlenmesini ve tek tek iyon kanallarının açık-kapalı durumunun izlenmesini sağlayan bir dizi membran görüntüsü kaydedin. Yanal hareketliliğin türünü (örneğin, serbest hareket vs geçici ankraj [referans için, bkz.¹⁶]) ve kanal aktivitesinin durumunu (örneğin, açık veya kapalı) belirlemek için, yeterince uzun (örneğin, 30 s ila 1 dakika) ve iyi örneklenmiş yörüngeler (örneğin, 48 ^s-1 kare hızı) elde edin.
       NOT: Kanallı, kısıtlı veya atlamalı difüzyon^16'nın gözlemlenmesi, örnekleme hızının sınırlayıcı sınırlar içinde sınırsız difüzyonu ölçmek için yeterince hızlı olmasını gerektirir. Ek olarak, veri örnekleme süresinin, kısıtlanmamış difüzyondan kısıtlı difüzyona geçişi ölçmek için yeterince uzun olduğundan emin olun (ayrıntılar için Jacobson ve ^ark.16'ya bakınız).
6. Görüntü ve veri işleme
   NOT: Açık kaynaklı görüntü işleme paketleri³³ veya ticari yazılım paketlerine dayalı kendi kendine yazılmış rutinler¹⁷ , DIB'lerdeki bireysel iyon kanallarının mekansal zamansal dinamiklerini analiz etmek için kullanılabilir. Yanal membran hareketliliğini tek tek kanallar üzerinden iyon akısı ile ilişkilendirebilmek için, filtre algoritmaları uygulanmamalıdır.
   1. Kendi kendine yazılan rutinleri kullanarak standart prosedürler³⁴ uygulayarak, tam görüntünün ortalama kare yoğunluğunu , t'nin kare indeksi (zaman) ve k'ninuygun parametreler olduğu yere sığdırarak ağartma için görüntü zaman serilerini düzeltin. Ardından, zaman serilerini , I(t)'nin yoğunluk olduğu yere göre düzeltin. Alternatif olarak, ilk veri analizleri için, kameranın spot noktasına ve piksel boyutuna (örneğin, 50 piksel) bağlı olarak, uygulanan yuvarlanma topu algoritmaları³³ ve bir yuvarlanan top yarıçapı ile açık kaynaklı yazılım kullanarak arka plan düzeltmeleri gerçekleştirin.
   2. Tanımlanmış bir ilgi alanı (ROI) (örneğin, 30 x 30 piksel) içindeki bir floresan noktasının uzamsal konumlarını ve genliklerini, belirli bir zamanda t'ye göre olası yerel aydınlatma gradyanlarını hesaba katan düzlemsel eğimli iki boyutlu bir Gauss fonksiyonuna yerleştirerek belirleyin. Burada, x = (x, y) floresan yoğunluğu bilgisine sahip ROI'dir, A ve σ Gaussian'ın genliği ve genişlikleridir, p_k ROI'nin arka plan yoğunluğunu karakterize eden parametrelerdir ve μ = (x 0, y ₀) Gaussian'ın konumunu tanımlar. Tek bir kanaldan geçen iyon akısı, A parametresi tarafından verilir. Kanalın yörüngesi x tarafından verilir ve kanalın yanal hareketliliğini belirlemeye izin verir. Alternatif olarak, 35,36'da açıklandığı gibi açık kaynaklı platformlar ³³ ve eklentileri kullanarak bireysel noktaların konumlarını ve yoğunluklarını belirlemek mümkündür. EMCCD kamera okumasının foton sayıları^38'e dönüştürülmesinden sonra konumsal doğruluğu³⁷ tahmin edin.
   3. Kanal difüzyonu ile kanaldaki iyon akısı arasındaki olası bir korelasyonu belirlemek için floresan genliği A'yı zamana ve karşılık gelen yörünge x'e karşı çizin. Bunu herhangi bir grafik yazılımıyla gerçekleştirin. Serbest yanal kanal hareketi durumunda, τ zaman gecikmesinin doğrusal regresyonu ile yanal difüzyon katsayısı D'yi belirleyin ve noktaların x'ten ortalama kare yer değiştirmesini .
      NOT: TOM-CC ve DIB membranlarında serbestçe hareket eden OmpF için tipik difüzyon katsayıları¹⁷ , 0,5 ila 1,5 μm^{2 s-1} arasında değişmektedir. Difüzyon sabiti 0,01 mm²·^s-1'den az olan moleküller hareketsiz¹⁷ olarak tanımlanır.

Gerçek zamanlı elektrotsuz optik tek kanallı kayıt, yanal protein hareketi ile DIB membranlarındaki bireysel iyon kanallarının işlevi arasındaki etkileşimi ortaya çıkarır. Mitokondriyal TOM çekirdek kompleksinin (Şekil 1A) bir DIB membranına (Şekil 4D) yeniden yapılandırılması, yanal hareketlilik ile iyon geçirgenliği arasında güçlü bir zamansal korelasyon olduğunu göstermektedir (Şekil 5A). TOM-CC geçidi, yanal hareket moduna duyarlı görünmektedir17. Hareketli kanallar, gözeneklerinden ve yüksek floresan noktası yoğunluklarından Ca2+ akı gösterir. Sıkışmış, hareket etmeyen moleküller düşük ve orta floresan yoğunlukları gösterir. Mitokondri TOM-CC'nin genel protein ithalat gözenekleri için, bu tek moleküllü yaklaşım, yanal hareketlilik ile iyon geçirgenliği arasında güçlü bir zamansal korelasyon ortaya koymuştur, bu da TOM-CC kanalının mekanosensitif özelliklere sahip olduğunu düşündürmektedir17. Serbestçe hareket eden TOM-CC moleküllerinin yanal olarak durmasına, TOM-CC kanalının kısmen veya tamamen kapanması eşlik eder. Membranın içine neredeyse tamamen gömülü olan OmpF (Şekil 1E ve Şekil 4F) ile DIB membranlarının görüntülenmesi dur-kalk etkisi göstermez (Şekil 5B). OmpF'nin rastgele duraklamaları, yoğunluktaki bir değişiklikle ve dolayısıyla gözeneklerinin kapanmasıyla ilişkili değildir. Floresan sinyalleri 38'e dayanarak, bireysel kanalların konumsal doğruluğu 5 ila 10 nm arasında tahmin edilebilir. Bununla birlikte, örneğin kök ortalama deplasmanı 120 nm olan bir ara durumdaki TOM-CC molekülleri için gösterildiği gibi, agaroz hidrojeli ile mobil ankraj nedeniyle kanallar hafifçe sallanırsa, bu doğruluğun elde edilemeyeceğine dikkat edilmelidir (Şekil 5A).

Resim 1: TOM-CC izolasyonu. (A) N. crassa TOM-CC30,39'un kriyo EM yapısı. 6xHis etiketli bir Tom22 içeren bir N. crassa suşundan mitokondri, DDM'de çözündü ve Ni-NTA afinite kromatografisine (B) ve anyon değişim kromatografisine (C) tabi tutuldu. (D) İzole edilmiş TOM-CC'nin SDS-PAGE'i. (E) Saflaştırılmış E. coli OmpF'nin kristal yapısı (PDB, 1OPF) ve (F) SDS-PAGE. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: PMMA oda tertibatının akış şeması. Adım 1: Bir cam kapak, bir agaroz hidrojeli ile spin kaplanır. Adım 2: Spin kaplı kapak kayması, özel yapım bir PMMA mikroskopi odasına monte edilir. Adım 3: PMMA odasının giriş portuna 35 ° C'lik bir sıcak plaka üzerinde ilave düşük erimeli agaroz eklenir. Adım 4: Lipid monokatmanları, bir tampon / yağ arayüzünde (solda) ve agaroz hidrojel / yağ arayüzünde (sağda) sulu damlacıkların etrafında oluşur. Adım 5: Tek tek sulu damlacıklar, iki lipit tek katmanının teması üzerine bir lipit çift katmanı oluşturmak için PMMA odasının kuyucuklarına pipetlenir. Adım 6: DIB membranlarının oluşumu Hofmann modülasyon kontrast mikroskobu ile doğrulanır. Adım 7: Yerleştirilen iyon kanalları ile DİB membranlarının seçilmiş bölgelerinin görüntüleri TIRF mikroskobu ile elde edilir. Yeşil:% 0.75 agaroz; sarı: Ca2+ iyonları içeren% 2.5 agaroz; macenta: lipit/yağ fazı; koyu mavi: Ca2 + duyarlı boya ve protein içeren sulu damlacık tamponu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Deney düzeneği. (A) Bir PMMA kuyusundaki bir DIB membranının şematik gösterimi. Çift katmanlı, transta Ca2 + duyarlı floresan boya (Fluo-8) kullanılarak zaman içinde bir iyon kanalından Ca2 + -akısının TIRF görüntülemesine izin vermek için% 0.75'lik ultra ince% 0.75'lik bir agaroz filmine dayanır. (B) Ca2 + -akısı, yalnızca cis'den trans'a ozmotik basınç ile kontrol edilir. Bu, hem membrandaki pozisyonun belirlenmesine hem de kanalın açık-kapalı durumuna izin verir. Burada gösterilen kanal, N. crassa mitokondri30'un protein ileten kanalı TOM-CC'dir. (C) Tek bir TOM-CC kanalının yörüngesi. Yeşil: hareketli kanal; sarı: hareket etmeyen kanal. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: DIB membranlarında TOM-CC ve OmpF'nin görüntülenmesi. (A) Hoffmann modülasyon kontrast mikroskobu ile hidrojel ve damlacık arasındaki çift katmanlı temas alanını gösteren DIB membranı. (B) (A)'daki gibi görüntülenen kırık DIB membranı. Ok, PMMA odasının kenarı. (C) Protein kanalları olmadan TIRF mikroskobu ile görüntülenen DIB membranı. (D) TIRF mikroskobu ile görüntülenen, yeniden yapılandırılmış TOM-CC'li DIB membranı. Beyaz kareler yüksek (SH), orta (SI) ve düşük (SL) yoğunluktaki noktaları işaretler. (E) (A) ile işaretlenmiş üç noktanın floresan yoğunluk profilinin iki boyutlu Gauss fonksiyonlarına takılması, tek tek TOM-CC'lerin ve kanal boyunca Ca2+ akısının konumunu ortaya çıkarır. (F) Yeniden yapılandırılmış OmpF'li DIB membranı. (G) (F) ile işaretlenmiş floresan noktanın Gauss uyumu. İki gözenekli β varilli protein kompleksi TOM-CC'nin aksine, üç gözenekli β namlulu OmpF sadece bir geçirgenlik durumu ortaya çıkarır. Piksel boyutu, 0,16 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kanal aktivitesi TOM-CC'nin yanal hareketliliği ile ilişkilidir. (A) TOM-CC'nin floresan genlik izi (üstte) ve buna karşılık gelen yörüngesi (alt), TOM-CC'nin açık-kapalı kanal aktivitesinin kompleksin yanal membran hareketliliği ile ilişkili olduğunu gösterir. Yörünge üç geçirgenlik durumu gösterir. Yeşil: tamamen açık durum; sarı: ara geçirgenlik durumu; kırmızı: kapalı kanal durumu; kırmızı yıldız: Orta seviyedeki TOM-CC, ortalama konumunun etrafında yaklaşık ±60 nm sallanır. Tamamen açık ve ara durumlardaki floresan sinyallerine dayanan konumsal doğruluklar37, 5 nm ile 10 nm arasında değişmektedir. (B) OmpF'nin floresan genlik izi (üstte) ve buna karşılık gelen yörüngesi (altta). OmpF, hareket halinde veya sıkışmış olmasına bakılmaksızın yalnızca bir yoğunluk seviyesini ortaya çıkarır. Sıkışmış moleküllerin zaman periyotlarına karşılık gelen yörünge segmentleri gri renkle işaretlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: TOM-CC yalıtımı için tampon çözeltileri.

Tablo 2: OmpF izolasyonu için tampon çözeltileri.

Çıkar çatışması olmadığını beyan ederiz.