Yöntem makalesi

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

DOI:

10.3791/64971

⸱

2 Haziran 2023

 ,  , 
1Department of Immunology, School of Medicine, UConn Health, 2Arthritis and Clinical Immunology Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Science Center

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nötrofiller ilk savunma hattıdır ve insanlarda en bol bulunan lökositlerdir. Bu efektör hücreler fagositoz ve oksidatif patlama gibi işlevleri yerine getirir ve mikrobiyal klirens için nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) oluşturur. Nötrofillerin metabolik aktivitelerine ilişkin yeni anlayışlar, öncelikle glikolize dayandıkları erken kavramına meydan okuyor. Metabolik aktivitelerin hassas ölçümü, fizyolojik koşullar altında ve hastalık durumlarında trikarboksilik asit (TCA) döngüsü (Krebs döngüsü olarak da bilinir), oksidatif fosforilasyon (OXPHOS), pentoz fosfat yolu (PPP) ve yağ asidi oksidasyonu (FAO) dahil olmak üzere nötrofillerin farklı metabolik gereksinimlerini ortaya çıkarabilir. Bu yazıda, fare kemik iliği kaynaklı nötrofiller, insan kanından türetilmiş nötrofiller ve nötrofil benzeri HL60 hücre hattı üzerindeki mitokondriyal solunumun bir göstergesi olarak oksijen tüketim hızını (OCR) ölçmek için adım adım bir protokol ve ön gereksinimler, metabolik bir hücre dışı akı analizörü üzerinde metabolik akı analizi kullanılarak açıklanmaktadır. Bu yöntem, normal ve hastalık koşulları altında nötrofillerin mitokondriyal fonksiyonlarını ölçmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondri, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ile adenozin trifosfat (ATP) üreten hücre biyoenerjetik maddelerinde önemli bir rol oynar. Buna ek olarak, mitokondrinin rolü, reaktif oksijen türlerinin üretilmesi ve detoksifikasyonuna, sitoplazmik ve mitokondriyal matriks kalsiyum regülasyonuna, hücresel senteze, katabolizmaya ve metabolitlerin hücre1 içinde taşınmasına kadar uzanır. Mitokondriyal solunum tüm hücrelerde esastır, çünkü işlev bozuklukları kardiyovasküler hastalıklar3 dahil olmak üzere metabolik sorunlara2 ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu4, Parkinson ve Alzheimer hastalıkları5 ve Charcot-Marie-Tooth hastalığı 2 A (CMT2A)6 gibi çok çeşitli nörodejeneratif hastalıklara neden olabilir.

Nötrofiller üzerinde yapılan elektron mikroskobik çalışmaları, nispeten az sayıda mitokondri7 olduğunu ve mitokondriyal solunum hızları çok düşük olduğu için enerji üretimi için glikolize büyük ölçüde güvendiklerini ortaya koymuştur8. Bununla birlikte, mitokondri, kemotaksis9 ve apoptoz10,11,12 gibi nötrofil fonksiyonları için çok önemlidir. Önceki bir çalışma, yüksek membran potansiyeline sahip insan nötrofillerinde karmaşık bir mitokondriyal ağ ortaya koymuştur. Mitokondriyal membran potansiyel kaybı, nötrofil apoptozunun erken bir göstergesidir10. Mitokondriyal uncoupler karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) ile tedavi, mitokondriyal morfolojide bir değişiklik ile birlikte kemotaksiste önemli inhibisyon göstermiştir 9,10.

Nötrofiller için birincil enerji kaynağı glikoliz olmasına rağmen, mitokondri, Ca2 + sinyallemesini artıran, mitokondriyal ATP üretimini artıran ve nötrofil fonksiyonel yanıtlarını başlatan pürinerjik sinyallemenin ilk aşamasını besleyerek nötrofil aktivasyonunu başlatan ATP'yi sağlar13. Mitokondriyal solunum zincirinin disfonksiyonu, toksik reaktif oksijen türlerinin (ROS) aşırı üretimine neden olur ve patojenik hasarlara yol açar14,15,16. Nötrofil hücre dışı tuzakları (NET'ler) oluşturma süreci olan NETosis, nötrofillerin patojenlere karşı savaşmalarına yardımcı olan kritik bir özelliktir17 ve kanser, tromboz ve otoimmün bozukluklar18 dahil olmak üzere birçok patolojik duruma katkıda bulunur. Mitokondriyal kaynaklı ROS, NETosis19'a katkıda bulunur, mitokondriyal DNA, NETs18'in bir bileşeni olabilir ve değiştirilmiş mitokondriyal homeostaz, NETosis 20,21,22,23,24'ü bozar. Ayrıca, normal farklılaşma veya olgunlaşma sırasında, nötrofil metabolik yeniden programlama, glikolitik aktiviteyi sınırlayarak tersine döner ve mitokondriyal solunuma katılır ve hücre içi lipitleri harekete geçirir25,26.

Metabolik hücre dışı akı analizörü, canlı hücre mitokondriyal solunumu ve glikolizi sürekli olarak izleyebilir ve ölçebilir. Analizör, oksijen (O2) konsantrasyonunu ve pH değişikliklerini ölçmek için 96 delikli plaka formatlı bir sensör kartuşu ve iki florofor kullanır. Sensör kartuşu, tahlil sırasında hücre tek katmanının üzerindedir ve ~ 200 nm yüksekliğinde bir mikro oda oluşturur. Analizördeki optik fiber demetleri, floroforları uyarmak ve floresan yoğunluğu değişikliklerini tespit etmek için kullanılır. O2 konsantrasyonu ve pH'daki gerçek zamanlı değişiklikler otomatik olarak hesaplanır ve oksijen tüketim oranı (OCR) ve hücre dışı asitleşme oranı (ECAR) olarak gösterilir. Sensör kartuşunda, tahlil ölçümleri sırasında her bir kuyucuğa dört adede kadar bileşiğin yüklenmesine izin veren dört bağlantı noktası vardır. Bu protokol, metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin mitokondriyal solunumunun yanı sıra nötrofil benzeri HL60 hücrelerinin ölçülmesine odaklanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Heparinize edilmiş tam kan örnekleri, Helsinki Deklarasyonu'na uygun olarak UConn Health Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandığı gibi, bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra sağlıklı insan bağışçılarından alınmıştır. Tüm hayvan deneyleri, UConn Sağlık Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerini izledi ve kemirgenlerin kullanımı için onay, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda belirtilen kriterlere göre UConn Health IACUC'den alındı. Bu çalışmada 6 haftalıkken erkek C57BL/6 fareler kullanıldı.

1. Metabolik hücre dışı akı testi için 96 delikli plakanın hazırlanması

  1. Metabolik hücre dışı akı testi için özel olarak tasarlanmış 96 delikli plakanın üzerine bir sensör kartuşu yerleştirilmiştir. Kartuşu dikkatlice kaldırarak nemlendirin ve alttaki plakanın her bir kuyucuğuna 200 μL/kuyu kalibrasyon ortamı yerleştirin. Kartuşu, nemlendirmek için gece boyunca CO2 olmayan, nemlendirilmiş, 37 ° C'lik bir inkübatörde kalibrantla plakanın üzerine yerleştirin.
  2. Hücre tipine bağlı olarak, hücre yapışmasını sağlamak için kültür plakası için özel bir kaplama kullanın. İnsan nötrofilleri için farklılaşmamış ve farklılaşmış HL60 hücreleri, 96 delikli plakayı, bir gecede 4 °C'de 50 μL 5 μg / mL saflaştırılmış fare anti-insan CD18 antikoru (Klon TS1/18) içeren steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile kaplar. Fare nötrofilleri için, 96 delikli plakayı 20 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) pH 8,0'da pH 8,0'da 0,1 M NaHCO3'te 25 μL 22,4 μg / mL Hücre Tak ile kaplayın.
  3. Plakaları 200 μL steril PBS ile iki kez yıkayın.
  4. Tohumlama sırasında hücre kültürü plakalarında arka plan düzeltmesi için hücre kültürü plakasının köşe kuyucuklarına (A1, A12, H1 ve H12) tam ortam ekleyin (hücreler olmadan).
    NOT: Kaplama ve kalibrasyon sırasında buharlaşma, kalibrasyon ortamının hacmini ve normalleşmeyi etkileyebilir. Steril suyla ıslatılmış dokuya sahip bir tepsi veya hazne kullanın ve buharlaşmayı önlemek için plakayı üzerinde kalibrant ile yerleştirin.

2. Hücrelerin hazırlanması ve tohumlanması

  1. Tahlil ortamının hazırlanması
    1. Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerine (DMEM) 1 mM piruvat, 10 mM glikoz ve 2 mM glutamin ekleyerek tahlil ortamı hazırlayın.
  2. Fare nötrofillerinin kemik iliğinden izolasyonu
    1. Üreticinin talimatlarına göre, Fare Nötrofil Zenginleştirme Kitini kullanarak fare nötrofillerini kemik iliğinden izole edin.
    2. Fareleri intraperitoneal (yani ketamin (125 mg / kg) ve ksilazin (12.5 mg / kg) enjeksiyonu ile anestezi altına alın ve daha sonra fareleri servikal çıkık ile ötenazi yapın.
    3. Daha önce tarif edildiği gibi femurları ve tibiaları hasatedin 27. Kısaca, bacağı kaslarla açığa çıkarmak için cildi kesin. Bacağı vücuttan çıkarmak için kalça eklemini kesin. Ardından, femur ve tibiayı toplamak için kasları çıkarın.
    4. Femurların ve tibiaların daha küçük uçlarını kesin. Kesik uçları aşağıda tutarak, altta iki adet 25 G şırınga iğnesi delikli delikli 0,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve 0,5 mL'lik tüpü 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin (Şekil 1A). Kemik iliği hücrelerinin kurumasını önlemek için 0,5 mL'lik tüpe 50 μL PBS ekleyin.
    5. 1,5 mL tüpün altındaki kemik iliğini toplamak için RT'de 15 saniye boyunca 5.900 × g'da santrifüj. Kemik iliği hücrelerini 1 mL DMEM ile yeniden askıya alın. Kitten 50 μL sıçan serumu ekleyin, pipetleme ile nazikçe karıştırın ve hücre süspansiyonunu 5 mL'lik bir polistiren kültür test tüpüne aktarın.
    6. Fare Nötrofil Zenginleştirme Kiti'nden 50 μL zenginleştirme kokteyli ekleyin ve RT'de ×15 dakika boyunca inkübe edin.
    7. Hücreleri 1 mL DMEM ile tekrar askıya alın, kitten 50 μL biyotin seçim kokteyli ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın ve RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    8. Kitten 150 μL vorteksli manyetik parçacık ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın ve RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
    9. ~ 1,3 mL DMEM ekleyin, pipetleme ile hafifçe karıştırın, tüpü mıknatısa 3 dakika boyunca yerleştirin ve orijinal tüpü mıknatısla birlikte ters çevirerek saflaştırılmış fare nötrofilleri içeren süpernatantı yeni bir 5 mL polistiren kültür test tüpüne aktarın.
    10. RT'de 300 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj. Süpernatantı vakum aspirasyonu ile çıkardıktan sonra, hücreleri 1 mL tahlil ortamı ile yeniden askıya alın.
    11. Bir hemositometre kullanarak hücreleri manuel olarak sayın.
    12. Tahlil ortamı, hazırlanan 96 delikli plakaya (1.2-1.4 adımları) kuyucuk başına 180 μL fare nötrofil süspansiyonunun (2 × 105 hücre) tohumunu ekleyerek hücre yoğunluğunu 1.1 × 106 hücre / mL'ye ayarlayın ve plakanın altındaki hücrelerin düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamak için plakayı RT'de 300 × g'da frensiz 3 dakika boyunca santrifüj edin.
    13. Hücreleri tahlil ortamı ile önceden dengelemek için plakayı CO2 olmayan, nemlendirilmiş, 37 ° C'lik bir inkübatörde 1 saat boyunca inkübe edin.




figure-protocol-1







figure-protocol-2


Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare nötrofillerinin oligomisin, FCCP ve rotenon / antimisin A karışımına (Şekil 3A), insan nötrofillerine (Şekil 3B) ve farklılaşmamış ve farklılaşmış HL60 hücrelerine (Şekil 3C) yanıt olarak mitokondriyal solunum değişikliklerini gösteren temsili OCR dinamikleri gösterilmiştir. Tüm hücrelerde, oligomisin tedavisi, ATP sentazın proton kanalını inhibe ederek OCR değerini düşürür; FCCP tedavisi, membran potansiyelini korumak ve maksi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak nötrofillerin mitokondriyal solunumunu ölçen standart prosedür, hücre sayısı, hücre büyümesi ve canlılık gibi birçok faktörle sınırlıdır. Her bileşik konsantrasyonu, bu tahlildeki hücrelerin tipi ve kaynağı arasında değişir. Oligomisin ve rotenon / antimisin A, çoğu hücre tipi arasında çoğunlukla benzer konsantrasyonda kullanılır. Bununla birlikte, FCCP kaynaklı maksimum solunum hızı farklı hücreler arasında değiştiğinden, konsantrasyon42'yi optimize...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UConn Health İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Anthony T. Vella ve Dr. Federica Aglianoin'e metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanma konusundaki eğitimleri için ve UConn Health İmmünoloji Bölümü'nden Dr. Lynn Puddington'a enstrümanlara verdiği destek için teşekkür ederiz. UConn Tıp Fakültesi'nden Dr. Geneva Hargis'e bu makalenin bilimsel yazımı ve düzenlenmesindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (R01HL145454), Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (R35GM147713 ve P20GM139763), UConn Health'ten bir başlangıç fonu ve Amerikan İmmünologlar Birliği'nden bir Kariyer yeniden giriş bursu ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
37 & derece; C olmayan CO2< / sub>  kuluçka makinesiHassasEkonomi Modeli 2EGEnstrüman
BiorenderYazılımı Uygulama
SantrifüjüEppendorfModel 5810REnstrüman
Corning  Cell-Tak Hücre ve Doku YapıştırıcısıCorning102416-100Reaktif
EasySep MıknatısSTEMCELL18000Mıknatıs
EasySepMouse Nötrofil Zenginleştirme kitiSTEMCELL19762AReaktifler
Graphpad Prism 9Yazılım Uygulaması
İnsan Serumu Albümin Çözeltisi (%25)GeminiBio800-120Reaktifler
Ketamin (VetaKet)DAILYMEDNDC 59399-114-10Anestezik
PBSCytivaSH30256.01Reaktifler
Plaka kovalarıEppendorfUL155Aksesuar
PolymorphPrepPROGEN1895 (önceki 1114683)polisakkarit çözeltisi
Saflaştırılmış fare anti-insan CD18 antikoruBiolegend302102Klonu TS1/18
RPMI 1640 OrtaGibco11-875-093Reaktifler
Denizatı metabolik hücre dışı akı analizörüAgilentXFe96Enstrüman Denizatı
XF Hücre Mito Stres Test KitiAgilent103015-100mitokondriyal stres testi Kiti
Salıncak kovalı rotorEppendorfA-4-62Rotor
Vakum Tuzağı 2 Vakum TuzağıTilki Yaşam Bilimleri3052101-FLSEnstrüman
DalgasıYazılım Uygulaması
XF 1.0 M Glikoz ÇözeltisiAgilent103577-100Reaktif
XF 100 mM Piruvat ÇözeltisiAgilent103578-100Reaktif
XF 200 mM Glutamin ÇözeltisiAgilent103579-100Reaktif
XF DMEM ortamıAgilent103575-100Reaktif
XFe96 FluxPakAgilent102601-100Malzeme
Ksilazin (AnaSed Enjeksiyonu)DAILYMEDNDC 59399-110-20Anestezik

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  2. Noguchi, M., Kasahara, A. Mitochondrial dynamics coordinate cell differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 59-64 (2018).
  3. Zhu, L., et al. Correlation between mitochondrial dysfunction, cardiovascular diseases, and traditional Chinese medicine. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2020, e2902136(2020).
  4. Kaarniranta, K., et al. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and their impact on age-related macular degeneration. Progress in Retinal and Eye Research. 79, 100858(2020).
  5. Onyango, I. G., Khan, S. M., Bennett, J. P. Mitochondria in the pathophysiology of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Frontiers in Bioscience. 22 (5), 854-872 (2017).
  6. Loiseau, D., et al. Mitochondrial coupling defect in Charcot-Marie-Tooth type 2A disease. Annals of Neurology. 61 (4), 315-323 (2007).
  7. Zucker-Franklin, D. Electron microscopic studies of human granulocytes: structural variations related to function. Seminars in Hematology. 5 (2), 109-133 (1968).
  8. Karnovsky, M. L. The metabolism of leukocytes. Seminars in Hematology. 5 (2), 156-165 (1968).
  9. Bao, Y., et al. mTOR and differential activation of mitochondria orchestrate neutrophil chemotaxis. The Journal of Cell Biology. 210 (7), 1153-1164 (2015).
  10. Fossati, G., et al. The mitochondrial network of human neutrophils: role in chemotaxis, phagocytosis, respiratory burst activation, and commitment to apoptosis. Journal of Immunology. 170 (4), 1964-1972 (2003).
  11. Pryde, J. G., Walker, A., Rossi, A. G., Hannah, S., Haslett, C. Temperature-dependent arrest of neutrophil apoptosis. Failure of Bax insertion into mitochondria at 15 degrees C prevents the release of cytochrome c. The Journal of Biological Chemistry. 275 (43), 33574-33584 (2000).
  12. Maianski, N. A., Mul, F. P. J., van Buul, J. D., Roos, D., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor inhibits the mitochondria-dependent activation of caspase-3 in neutrophils. Blood. 99 (2), 672-679 (2002).
  13. Bao, Y., et al. Mitochondria regulate neutrophil activation by generating ATP for autocrine purinergic signaling. The Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 26794-26803 (2014).
  14. Chouchani, E. T., et al. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431-435 (2014).
  15. Hayashi, G., Cortopassi, G. Oxidative stress in inherited mitochondrial diseases. Free Radical Biology and Medicine. 88, 10-17 (2015).
  16. Mailloux, R. J. An update on mitochondrial reactive oxygen species production. Antioxidants. 9 (6), 472(2020).
  17. Abuaita, B. H., et al. The IRE1α stress signaling axis is a key regulator of neutrophil antimicrobial effector function. Journal of Immunology. 207 (1), 210-220 (2021).
  18. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nature Medicine. 22 (2), 146-153 (2016).
  19. Douda, D. N., Khan, M. A., Grasemann, H., Palaniyar, N. SK3 channel and mitochondrial ROS mediate NADPH oxidase-independent NETosis induced by calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciencesa. 112 (9), 2817-2822 (2015).
  20. Monteith, A. J., et al. Altered mitochondrial homeostasis during systemic lupus erythematosus impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 208 (2), 454-463 (2022).
  21. Monteith, A. J., Miller, J. M., Beavers, W. N., Juttukonda, L. J., Skaar, E. P. Increased dietary manganese impairs neutrophil extracellular trap formation rendering neutrophils ineffective at combating Staphylococcus aureus. Infection and Immunity. 90 (3), 0068521(2022).
  22. Monteith, A. J., et al. Mitochondrial calcium uniporter affects neutrophil bactericidal activity during Staphylococcus aureus infection. Infection and Immunity. 90 (2), 0055121(2022).
  23. Cao, Z., et al. Roles of mitochondria in neutrophils. Frontiers in Immunology. 13, 934444(2022).
  24. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. The Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  25. Fan, Z., Ley, K. Developing neutrophils must eat…themselves. Immunity. 47 (3), 393-395 (2017).
  26. Riffelmacher, T., et al. Autophagy-dependent generation of free fatty acids is critical for normal neutrophil differentiation. Immunity. 47 (3), 466-480 (2017).
  27. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936(2016).
  28. Swamydas, M., Isolation Lionakis, M. S. purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586(2013).
  29. Gerner, M. C., et al. Packed red blood cells inhibit T-cell activation via ROS-dependent signaling pathways. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100487(2021).
  30. Zhang, Z. -W., et al. Red blood cell extrudes nucleus and mitochondria against oxidative stress. IUBMB Life. 63 (7), 560-565 (2011).
  31. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111, 1-16 (2015).
  32. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicology In Vitro. 67, 104907(2020).
  33. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio-Protocol. 8 (10), e2850(2018).
  34. Nath, S. The molecular mechanism of ATP synthesis by F1F0-ATP synthase: a scrutiny of the major possibilities. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 74, 65-98 (2002).
  35. Heinz, S., et al. Mechanistic investigations of the mitochondrial complex I inhibitor rotenone in the context of pharmacological and safety evaluation. Scientific Reports. 7 (1), 45465(2017).
  36. Hytti, M., et al. Antimycin A-induced mitochondrial damage causes human RPE cell death despite activation of autophagy. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 1583656(2019).
  37. Malecki, M., Kamrad, S., Ralser, M., Bähler, J. Mitochondrial respiration is required to provide amino acids during fermentative proliferation of fission yeast. EMBO Reports. 21 (11), e50845(2020).
  38. Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
  39. Marchetti, P., Fovez, Q., Germain, N., Khamari, R., Kluza, J. Mitochondrial spare respiratory capacity: Mechanisms, regulation, and significance in non-transformed and cancer cells. The FASEB Journal. 34 (10), 13106-13124 (2020).
  40. Nicholas, D., et al. Advances in the quantification of mitochondrial function in primary human immune cells through extracellular flux analysis. PLoS One. 12 (2), e0170975(2017).
  41. Tur, J., et al. Mitofusin 2 in macrophages links mitochondrial ROS production, cytokine release, phagocytosis, autophagy, and bactericidal activity. Cell Reports. 32 (8), 108079(2020).
  42. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  43. Wettmarshausen, J., Perocchi, F. Assessing calcium-stimulated mitochondrial bioenergetics using the seahorse XF96 analyzer. Methods in Molecular Biology. 1925, 197-222 (2019).
  44. Forkink, M., et al. Mitochondrial hyperpolarization during chronic complex I inhibition is sustained by low activity of complex II, III, IV and V. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (8), 1247-1256 (2014).
  45. Methods for Reducing Cell Growth Edge Effects in Agilent Seahorse XF Cell Culture Microplates. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/user-manual-methods-for-reducing-cell-growth-edge-effect-cell-analysis-5994-0240en-agilent.pdf (2019).
  46. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  47. Wu, D., Yotnda, P. Induction and testing of hypoxia in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (54), e2899(2011).
  48. Normalisation of Seahorse XFe96 metabolic assaysto cell number with Hoechst stain using well-scan mode on the CLARIOstar Plus. BMG Labtech. , Available from: https://www.bmglabtech.com/cn/normalisation-of-seahorse-xfe96-metabolic-assays-to-cell-number-with-hoechst-stain/ (2020).
  49. Yetkin-Arik, B., et al. The role of glycolysis and mitochondrial respiration in the formation and functioning of endothelial tip cells during angiogenesis. Scientific Reports. 9 (1), 12608(2019).
  50. Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. Mitochondrial proton and electron leaks. Essays in Biochemistry. 47, 53-67 (2010).
  51. Jandl, R. C., et al. Termination of the respiratory burst in human neutrophils. The Journal of Clinical Investigation. 61 (5), 1176-1185 (1978).
  52. Azevedo, E. P., et al. A metabolic shift toward pentose phosphate pathway is necessary for amyloid fibril- and phorbol 12-myristate 13-acetate-induced neutrophil extracellular trap (NET) formation. The Journal of Biological Chemistry. 290 (36), 22174-22183 (2015).
  53. Six, E., et al. AK2 deficiency compromises the mitochondrial energy metabolism required for differentiation of human neutrophil and lymphoid lineages. Cell Death & Disease. 6 (8), e1856(2015).
  54. Kumar, S., Dikshit, M. Metabolic insight of neutrophils in health and disease. Frontiers in Immunology. 10, 2099(2019).
  55. Rodríguez-Espinosa, O., Rojas-Espinosa, O., Moreno-Altamirano, M. M. B., López-Villegas, E. O., Sánchez-García, F. J. Metabolic requirements for neutrophil extracellular traps formation. Immunology. 145 (2), 213-224 (2015).
  56. Invernizzi, F., et al. Microscale oxygraphy reveals OXPHOS impairment in MRC mutant cells. Mitochondrion. 12 (2), 328-335 (2012).
  57. Zenaro, E., et al. Neutrophils promote Alzheimer's disease-like pathology and cognitive decline via LFA-1 integrin. Nature Medicine. 21 (8), 880-886 (2015).
  58. Maianski, N. A., et al. Functional characterization of mitochondria in neutrophils: a role restricted to apoptosis. Cell Death and Differentiation. 11 (2), 143-153 (2004).
  59. Bergman, O., Ben-Shachar, D. Mitochondrial oxidative phosphorylation system (OXPHOS) deficits in schizophrenia. Canadian Journal of Psychiatry. 61 (8), 457-469 (2016).
  60. Zhou, W., Qu, J., Xie, S., Sun, Y., Yao, H. Mitochondrial dysfunction in chronic respiratory diseases: implications for the pathogenesis and potential therapeutics. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 5188306(2021).
  61. Hirano, M., Emmanuele, V., Quinzii, C. M. Emerging therapies for mitochondrial diseases. Essays in Biochemistry. 62 (3), 467-481 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mitokondriyal SolunumN trofil Biyoenerjeti iOksijen T ketim H zMetabolik Ak AnaliziEkstrasel ler Ak Analiz rMitokondriyal Stres TestiHL60 H creleriOksidatif FosforilasyonElektron Ta ma ZinciriBazal Solunum

İlgili makaleler