Protein Yüksek Mertebeden Yapısının Analizi için Kütle Spektrometresi Tabanlı Yaklaşımlar

Xiaoran Roger Liu; Yining Huang

doi:10.3791/64979

Yöntem makalesi

Protein Yüksek Mertebeden Yapısının Analizi için Kütle Spektrometresi Tabanlı Yaklaşımlar

647 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64979

⸱

3 Mart 2023

Xiaoran Roger Liu¹ , Yining Huang²

¹Biologics Development, Bristol Myers Squibb, ²Eli Lilly and Company

Bu makalede

Özet

TARTIŞILAN MAKALELER:

Espino, J. A., Jones, L. M. Caenorhabditis elegans'ta protein etkileşimlerinin incelenmesi için in vivo hidroksil radikal protein ayak izi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (158), E60910 (2020).

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Proteinlerin hücre içi hızlı fotokimyasal oksidasyonu ile hücresel proteinleri karakterize etme. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (157), E60911 (2020).

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Liyofilize tozlarda protein yapısını ve etkileşimlerini incelemek için kütle spektrometrik yaklaşımları. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (98), E52503 (2015).

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. Peptit biyosentetik enzimleri araştırmak için bir hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS) platformu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (159), E61053 (2020).

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Kütle spektrometresi ile protein yüksek dereceli yapısını incelemek için dietilpirokarbonat ile kovalent etiketleme. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (172), E61983 (2021).

Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Hareketli XY aşamasına sahip platform inkübatör: Proteinlerin hücre içi hızlı fotokimyasal oksidasyonunu uygulamak için yeni bir platform. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (171), E62153 (2021).

Haupt, C. et al. Çok alt birimli protein düzeneklerinin mimarisini incelemek için bozulmamış protein komplekslerinin kimyasal çapraz bağlama ve kütle spektrometresini birleştirmek. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (129), E56747 (2017).

Lento, C. et al. Protein yapısı ve dinamiklerini incelemek için zamana bağlı elektrosprey iyonizasyon hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (122), E55464 (2017).

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Proteinlerin daha yüksek dereceli yapısal analizini gerçekleştirmek için lazersiz hidroksil radikal protein ayak izi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (172), E61861 (2021).

Misra, S. K., Sharp, J. S. Protein topografyası değişikliklerinin belirlenmesi için proteinlerin hızlı fotokimyasal oksidasyonlarında gerçek zamanlı kompanzasyonun etkinleştirilmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (163), E61580 (2020).

Chaihu, L. et al. Yukarıdan aşağıya kütle spektrometresi ile proteinlerin konformasyonel karakterizasyonu için kılcal elektroforez tabanlı hidrojen/döteryum değişimi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (172), E62672 (2021).

Editöryal

Yüksek dereceli yapı (HOS), protein fonksiyonu ile yakından ilişkili olduğu için protein karakterizasyonunun önemli bir yönüdür. Kütle spektrometrisi (MS), protein HOS^1'i değerlendirmek için anahtar yöntemlerden biridir. MS tabanlı yaklaşımlar, protein yapısını atomik çözünürlükle çözemese de, orta-yüksek uzamsal çözünürlük, yüksek özgüllük, düşük numune miktarı gereksinimleri, yüksek verim ve proteomik yetenekler gibi avantajlara sahiptirler.

MS tabanlı protein ayak izi yaklaşımları, proteinin solventle erişilebilen yüzeyini analiz ederek protein HOS'unu değerlendirir ve genellikle farklı kimyasal etiketleme yaklaşımlarıyla birleştirilir. Hidrojen-döteryum değişimi (HDX) gibi tersinir etiketleme, protein ^1,2'deki omurga amid hidrojenlerini hedefler. Geri dönüşümsüz etiketleme, ya spesifik amino asit kalıntılarını³ hedef alan kimyasalları ya da daha yüksek reaksiyon hızına sahip çeşitli farklı kalıntıları^etiketleyen radikalleri 1 kullanır. Kimyasal çapraz bağlanma da geri dönüşü olmayan etiketleme kategorisinin bir parçasıdır, ancak iki değerlikli özelliği, benzersiz topolojik bilgiler sunan iki çapraz bağlı bölge arasındaki uzamsal kısıtlamaların belirlenmesine izin verir ^4,5. Tüm bu yaklaşımlar, MS'i protein HOS'u aydınlatmak için değerli bir araç haline getiren bir "araç kutusu" oluşturmak için birleştirilebilir.

Bu yöntem koleksiyonunu MS bazlı protein HOS analizi alanındaki son gelişmeleri sunmak için düzenledik. İlk makale grubu HDX tabanlı yaklaşımlara sahiptir. Habibi ve Thibodeaux⁶ , nispeten klasik bir sürekli, aşağıdan yukarıya HDX-MS yaklaşımını tanımlar. Çoklu değişim sürelerinde çözelti içi hidrojen-döteryum (H/D) değişimi ve ardından kolon üzerinde pepsin sindirimi ile, döteryum alım seviyesi peptit seviyesinde belirlenebilir. Diferansiyel deneyler (yani, bağlı ve bağlanmamış durumlar) gerçekleştirirken, artan veya azalan döteryum alım seviyeleri gösteren peptitler, HOS'ta değişiklik yaşayan alanları temsil eder. Yazarlar, HDX-MS iş akışını güzel bir şekilde göstermek için lantipeptid sentetazları kullanırlar.

Aşağıdan yukarıya yaklaşımın yanı sıra, HDX-MS yukarıdan aşağıya bir şekilde de gerçekleştirilebilir ve analistlerin bozulmamış protein seviyesinde farklı ayırma stratejileri uygulamasına olanak tanır. Chaihu ve ^ark.7 , çözeltide bir arada bulunan farklı protein durumlarını veya proteoformları ayırmak için kapiller elektroforez kullanır. Proteinler, döteryumlu arka plan elektrolit çözeltisinde kılcal damarda göç ederken elektroforez sırasında H/D değişimine uğrar ve bunu, hem global hem de fragman seviyelerinde döteryum alım seviyelerini değerlendirmek için yukarıdan aşağıya MS analizi ve gaz fazı parçalanmaları izler. Son olarak, bu koleksiyonda farklı H/D değişim yöntemlerini vurgulayan iki yöntem daha vardır, yani liyofilize güç^{değişimi 8} ve elektrosprey iyonizasyonundan sonra değişim⁹.

İkinci grup makaleler, geri dönüşü olmayan etiketleme yöntemini kapsar. Bunlar arasında, proteinlerin hızlı fotokimyasal oksidasyonu (FPOP), proteinin^10,11 yüzeyini işaretlemek için türleri etiketlemek için radikalleri kullanır. Uygulamada, hidrojen peroksit, aktif etiketleme türleri olarak hizmet eden hidroksil radikalleri üretmek için bir lazer aracılığıyla fotoaktive edilir. Misra ve Sharp¹², radikal konsantrasyon için raportör olarak adenin kullanıldığı ve adenin yanıtını izlemek için bir hat içi radikal dozimetri sisteminin kullanıldığı radikal dozimetri için bir strateji sunar. Bu, hidroksil radikal konsantrasyonlarının gerçek zamanlı olarak dengelenmesine ve böylece doğru bir okuma sağlamak için reaksiyon koşullarının normalleştirilmesine olanak tanır. Daha sonra Weinberger ve Chea, lazersiz bir FPOP platformu¹³ geliştirmek için Sharp grubuyla işbirliği yaptı. Tehlikeli lazeri bir plazma ışık kaynağıyla değiştirerek ve bunu hat içi radikal dozimetri ve otomatik numune toplama sistemi ile birleştirerek, protein HOS'u karakterize etmesi gereken araştırmacılar için entegre bir çözüm geliştirir ve sağlarlar.

Jones'un grubu ^{14,15,16'nın} üç makalesi^, FPOP ve protein ayak izini in vivo çalışmalara getirme olasılığını araştırıyor. Bu yaklaşımın avantajı, HOS proteininin doğal ortamda analiz edilmesine izin verdiği için emsalsizdir. Hücrelerde¹⁴ ve Caenorhabditis elegans^15'te ayak izinin başarılı bir şekilde uygulanması, tüm proteomun HOS'sini doğal durumunda izlemek için yeni olanaklar açar, böylece diğer araçlarla elde edilemeyen HOS proteininin derinlemesine anlaşılmasına izin verir.

Geri dönüşü olmayan etiketlemenin bir diğer önemli yöntemi, spesifik amino asit kalıntılarını hedef alan kimyasal reaktifleri kullanır³. Kirsch ve ^ark.17 , kovalent etiketleme yoluyla protein ayak izinin iyi kullanılan bir iş akışını bildirmektedir. Etiketleme reaktifi olarak dietilpirokarbonat kullanan yazarlar, proteinin yüzeyindeki birkaç çeşit amino asit kalıntısını etiketleyerek protein HOS'undaki değişiklikleri araştırırlar. Diferansiyel deneyler ve ardından proteolitik sindirim ve aşağıdan yukarıya MS analizi yoluyla, iş akışı birlikte, HOS'taki değişikliklerle doğrudan ilgili olan solvent erişilebilirliklerindeki değişikliklerin tanımlanmasına olanak tanır.

Son olarak, kimyasal çapraz bağlama, proteinleri ^4,5 etiketlemek için iki değerlikli kimyasal reaktifleri kullanan bir başka önemli yaklaşımdır. Kimyasal çapraz bağlayıcılar, uzamsal olarak birbirine yakın olan ve genellikle yapısal bir kompleks oluşturan iki proteini çapraz bağlamak için kullanılır. Haupt ve ^ark.18 protein komplekslerinin mimarisini anlamak için kimyasal çapraz bağlayıcıların kullanımını gösterdikleri bir protokol bildirmişlerdir. Çapraz bağlı protein kompleksi iki farklı seviyede analiz edilebilir. Proteolitik sindirim ve ardından MS tanımlaması yoluyla, çapraz bağlı dipeptitler, protein kompleksinin etkileşimli bölgelerini ortaya çıkarır. Çapraz bağlı numuneyi bozulmamış kütle boyunca analiz ederken, kompleks içindeki protein alt birimleri hakkında stokiyometrik bilgi kolayca elde edilebilir.

Özetlemek gerekirse, son otuz yılda protein HOS analizi için MS tabanlı araçlarda önemli gelişmelere tanık olduk. MS analizi ile birlikte geri döndürülemez ve tersine çevrilebilir ayak izi birbirini tamamlar ve birlikte protein HOS karakterizasyonuna önemli ölçüde katkıda bulunurlar. Bu yöntem koleksiyonunda yer alan çalışmalar, MS bazlı protein HOS analizi alanında en son teknolojiye sahip yöntemleri temsil etmektedir; bu çalışmalar, kritik soruları yanıtlamak için MS temelli yaklaşımları kullanmaya çalışan araştırmacılar için değerli bir kaynaktır. Daha geniş bir perspektiften bakıldığında, ayak izi verilerinin yapısal tahminlere dahil edilmesi, MS tabanlı yöntemlerde mekansal çözünürlük sınırının aşılması açısından kritik öneme sahiptir. Böyle bir yaklaşımın uygulanabilirliğini gösteren öncü çalışmalar mevcuttur^19,20. Ek olarak, bu yaklaşımlar birbirini tamamlayıcı olduğu ve farklı bakış açılarından içgörüler sağladığı için platform entegrasyonu da çok önemlidir^21,22. Bu koleksiyonda bildirilen yöntemler, bu tür bir entegrasyonun gücünü göstermektedir ve bu yönde sürekli gelişme olacaktır. Tüm bu gelişmelerle birlikte, MS tabanlı yaklaşım moleküler ağırlık belirlemenin ötesine geçti ve önümüzdeki yıllarda bu alanda sürekli büyüme görülecek.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarların herhangi bir onayı yok.

Kaynaklar

Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: Fundamentals and applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2020).
Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224-1234 (2011).
Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing protein structure by amino acid-specific covalent labeling and mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (5), 785-815 (2009).
Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein–protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
Leitner, A. Cross-linking and other structural proteomics techniques: How chemistry is enabling mass spectrometry applications in structural biology. Chemical Science. 7 (8), 4792-4803 (2016).
Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes. Journal of Visualized Experiments. (159), e61053(2020).
Chaihu, L., et al. Capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e62672(2021).
Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders. Journal of Visualized Experiments. (98), e52503(2015).
Lento, C., et al. Time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61580(2020).
Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins. Journal of Visualized Experiments. (172), e61861(2021).
Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (157), e60911(2020).
Espino, J. A., Jones, L. M. In vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e60910(2020).
Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform incubator with movable XY stage: A new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (171), e62153(2021).
Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e61983(2021).
Haupt, C., et al. Combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies. Journal of Visualized Experiments. (129), e56747(2017).
Biehn, S. E., Lindert, S. Accurate protein structure prediction with hydroxyl radical protein footprinting data. Nature Communications. 12 (1), 341(2021).
Biehn, S. E., Lindert, S. Protein structure prediction with mass spectrometry data. Annual Review of Physical Chemistry. 73, 1-19 (2022).
Zhang, M. M., et al. Epitope and paratope mapping of PD-1/nivolumab by mass spectrometry-based hydrogen-deuterium exchange, cross-linking, and molecular docking. Analytical Chemistry. 92 (13), 9086-9094 (2020).
Zhang, M. M., et al. An integrated approach for determining a protein–protein binding interface in solution and an evaluation of hydrogen–deuterium exchange kinetics for adjudicating candidate docking models. Analytical Chemistry. 91 (24), 15709-15717 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Protein Interactions Hydroxyl Radical Footprinting Photochemical Oxidation Hydrogen-deuterium Exchange Covalent Labeling Protein Analysis Electrospray Ionization Chemical Cross-linking Multi-subunit Assemblies Conformational Characterization