$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Biyomoleküler etkileşimler biyolojik süreçlerde kilit oyunculardır ve bu nedenle yaşam bilimlerinin temelde önemli bir yönüdür. Floresan teknikleri, bu süreçleri araştırmak ve anlamak için en güçlü ve yaygın olarak uygulanan yöntemlerden biri haline gelmiştir. İn vitro floresan yaklaşımları, diğer yaklaşımlara göre büyük bir avantaj oluşturan hücre dışı ve hücre içi moleküler etkileşimlerin gerçek zamanlı tespiti için potansiyel sunar. Bu, hücresel süreçlerin düzenlenmesinde önemli rol oynayan çeşitli protein-protein, protein-nükleik asit ve protein-membran etkileşimleri için kullanılmıştır.
Bu koleksiyon, biyomoleküler etkileşimlerin incelenmesi için çeşitli floresan bazlı tekniklere ve uygulamalara genel bir bakış sunar ve hücresel süreçler hakkındaki anlayışımızı genişletir.
Reiser ve ark.1 , otomatik görüntü elde etme ve işleme yoluyla tek tek hücrelerden hücresel kinetiği analiz etmek için yüksek verimli bir yöntem tanımlamaktadır (Tek Hücre Dizilerinde Canlı Hücre Görüntüleme [LISCA]). Bu tekniği kullanarak, floresan raportörler, transfeksiyondan sonra tek hücreli gen ekspresyonu, sinyal kaskadlarında hücresel yanıt, apoptotik olaylar veya kök hücre farklılaşması gibi çeşitli bağımsız biyolojik süreçlerin zaman çözümlü bir okumasını sağlar. Yazarlar, taramalı hızlandırılmış mikroskopi kullanarak izole hücre dizilerinde görüntüleme gerçekleştirerek yüzlerce tek hücre yörüngesine ve istatistiksel analiz için yeterli veriye yol açar. Tek hücreli floresan zaman izleri, araştırmacıların gen dağıtım mekanizmalarını daha iyi anlamalarına ve normalde içsel dalgalanmalar tarafından dikte edilen karmaşık biyolojik sistemlerin ayırt edici özelliği olan hücresel heterojenliği çözmelerine yardımcı olacaktır.
Konate ve ark.2 membran etkileşimli peptitlerin etkileşimini, pertürbasyonunu ve/veya geçirgenliğini karakterize etmek için biyofiziksel bir yöntem bildirmiştir. Protokollerinde, lipozomları formüle etmek ve saflaştırmak ve floresan sızıntısını karakterize etmek için farklı adımları tam olarak tanımlarlar. Yöntem, küçük bir enterferans yapan RNA (siRNA) ile birlikte WRAP adı verilen hücreye nüfuz eden bir peptit (CPP) ile uygulanır veya güçlü bir terapötik peptit (iCAL36) ile birleştirilir ve iyi bilinen CPP, penetratin ile karşılaştırılır. Bu teknik birçok avantaj sunar. Uygulaması hızlı ve basittir. Farklı hücre zarı türlerini taklit etmek için lipid zar bileşiminin sıkı kontrolüne izin verir. Floroforlar, ilgilenilen peptide ve membran sızıntı özelliklerine bağlı olarak uyarlanabilir. Son olarak, numune hazırlandıktan sonra son derece stabildir. Tekniğin çok yönlülüğü, hücre hasarı veya ilaç dağıtımı ile ilgili çeşitli biyolojik soruları araştırmak için yararlı bir yaklaşım haline getirir.
Memeli hücre zarlarında fosfatidilserin (PS) varlığı, hücre apoptozu gibi farklı sinyalleşme süreçlerinde veya zar onarımı için proteinlerin toplanmasında önemlidir. Plazma membranlarının yüzeyindeki PS dağılımındaki transfer ve değişiklikler, Ikhlef ve ark.'nın3 makalelerinde ele aldıkları önemli bir sorudur. Rekombinant maya proteini Osh6p tarafından gerçek zamanlı PS ve PI-4-P lipid taşınmasını ve değişimini ölçmek için bir protokol tanımlarlar. Yöntem, bir lipit transfer proteininin (LTP), lipit vezikülleri arasındaki bir gradyan boyunca yapay zarlardaki lipitleri özütüp çıkarmadığını veya aktarıp aktarmadığını tespit etmek için floresan sensörler kullanır. Bu protokol, lipitlerin LTP'ye doğru bağlanmasına izin vermek için etiketlenmemiş lipitlerle çalışmayı sağlar. Ek olarak, radyoaktivite bazlı analizler veya kütle spektrometrisi gibi geleneksel yöntemlere kıyasla daha iyi bir zaman çözünürlüğü elde edilir. Bu yöntem, araştırmacıların farklı organeller ve zarlar arasındaki lipitlerin ekstraksiyonunu ve değişimini daha iyi anlamalarına yardımcı olacaktır.
Förster rezonans enerji transferi (FRET), biyomoleküler sistemleri incelemek için güçlü bir yöntemdir. Bu teknik, tek moleküllere (örneğin, smFRET) uygulanabilir ve biyomoleküller içindeki mutlak mesafelerin ölçülmesine izin verir. Abdelhamid ve ark.4 , serbestçe yayılan tek moleküller üzerinde iki boya arasındaki FRET etkinliğini ölçebilen, yakın zamanda geliştirilmiş bir konfokal kurulum olan smfBox'ın nasıl gerçekleştirileceğine dair adım adım bir protokol sunmaktadır. Numune hazırlamadan cihaz kurulumuna, hizalamaya, veri toplamaya ve analize kadar smFRET tekniğinin nasıl uygulanacağını ve kullanılacağını gösterirler. Ayrıca, FRET'ten türetilen doğru mesafe ölçümleri için gereken düzeltme faktörlerinin nasıl belirleneceğini açıklarlar. Burada yöntem, serbestçe yayılan DNA duplekslerine uygulanır ve protein konformasyonel değişikliklerinin veya protein-DNA etkileşimlerinin incelenmesi gibi geniş bir uygulama yelpazesine genişletilebilir.
Biyolojik süreçler, yeni floresan bazlı tahlillerin veya sensörlerin geliştirilmesi için geniş alan bırakan çok çeşitli ve çok sayıda biyomoleküler etkileşimi içerir. Bu koleksiyon, araştırmacılara floresan bazlı yöntemlerdeki yenilikler ve gelişmeler hakkında genel bir bakış sunar. Her makale, floresan bazlı farklı bir yönteme ışık tutarak, floresan analizlerinin ne kadar önemli ve çok yönlü hale geldiğini vurgulamaktadır. Koleksiyon bu yöntemleri tanımlamakta ve böylece bunların farklı gruplar ve araştırma alanları arasında yaygın kullanımını teşvik etmektedir.