$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tarihsel olarak, bilim adamları, bir tıbbi ürünün (yani ilaç veya tıbbi cihazın) insanlar üzerinde test etmeden önce güvenli olup olmadığını belirlemek için büyük ölçüde hayvan çalışmalarına güvendiler. Hayvanlar üzerinde yapılan testler birçok durumda hala haklı olsa da, alternatifler bulmak oldukça arzu edilir. Bilim ve mühendislikteki son gelişmelerle birlikte, hayvanlar üzerinde yapılan testlere alternatiflerin geliştirilmesi her zamankinden daha mümkün. Kardiyak güvenlik değerlendirmesi için insan in vitro alternatif yöntemlerinin geliştirilmesine yeniden odaklanılması, en azından kısmen indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisindeki ilerlemelere atfedilebilir. İnsan kalp hücreleri, bir hastadan alınan basit bir kan veya deri örneği kullanılarak laboratuvarda üretilebilir ve sağlam, yüksek verimli testlere uygun, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler (iPSC-CM'ler) elde edilebilir. 3D doku biyomühendisliği, mikroelektrot dizisi teknolojileri, canlı hücre görüntüleme ve diğer teknolojilerdeki ilerlemeler de bu koleksiyonda yer alan protokollerin geliştirilmesinde etkili olmuştur.
Gerges ve ark.'nın1 protokolü, yetişkin insan primer ventriküler kardiyomiyositlerinde kontraktilitedeki değişiklikleri değerlendirmek için non-invaziv bir optik yöntem (MyoBLAZER) uygulamaktadır. Hücreler elektriksel olarak hızlanır ve görüntü analizi, paralel olarak birden fazla hücrede sarkomer kısalmasını ölçer. Bu yöntem, cihaz başına bileşik başına her 30 dakikada bir konsantrasyon-tepki eğrileri toplayabilir ve yapı-aktivite ilişkisi verileri sağlar. Bu non-invaziv optik yöntem, yüksek verimli tarama sırasında yetişkin insan kardiyomiyositlerinin fizyolojisini ve farmakolojisini korumaya yardımcı olur. Ek olarak, insan yetişkin kardiyomiyositlerinin kullanımı, kontraktiliteyi tahmin etmek için kritik bir translasyonel parça sağlayabilir.
Lickiss ve ark.2'nin metodolojisi, yumuşak, esnek, silikon bazlı bir hücre kültürü substratı kullanarak endüstri standardı 96 oyuklu bir platforma önemli olgunlaşma özellikleri ekleyen bir hibrit kontraktilite ve empedans/hücre dışı alan potansiyeli (EFP) teknolojisi sunar. Yaklaşım, bir 3D sisteme ihtiyaç duymadan standart (sert substrat) kültürde bilerek bulunmayan, ticari olarak temin edilebilen sağlıklı hiPSC-CM'lerde izoproterenole fizyolojik pozitif inotropik yanıtı yeniden oluşturarak başarılı olduğunu kanıtladı. Hibrit sistem, büzülme kuvvetinin (mN/mm2), vuruş hızının ve ayrıca hücre tek katmanlı yoğunluğunun ve bütünlüğünün doğrudan ölçülmesine olanak tanır. Ayrıca, geleneksel bir 3D sistemin zorluklarını (yani, düşük verim, önemli eğitim ihtiyaçları) ele alarak, testi tamamlamak için gereken zaman ve maliyetleri azaltır.
Koleksiyon ayrıca, probsuz video tabanlı mikroskopi kullanarak esnek bir Matrigel şilte üzerine kaplanmış 2D insan kök hücre kardiyomiyositlerinde kardiyak kontraktilite modülasyonu (CCM) tedavisini değerlendirmek için in vitro, yüksek verimli, invazif olmayan bir yöntem gösteren Feaster ve ark.3'ün çalışmalarını da içermektedir. Yazarlar, CCM'nin sağlıklı ve hastalıklı hiPSC-CM'lerin kasılma özellikleri üzerindeki akut etkilerini vurgulamaktadır. Bu araç, CCM'lerin güvenliğini veya etkinliğini anlamak için düşük maliyetli bir yöntem sunar ve hayvan çalışmalarına olan bağımlılığı azaltabilir ve kardiyak elektrofizyoloji tıbbi cihazlarının düzenleyici karar vermesine yardımcı olabilir.
Schaefer ve ark.4 tarafından geliştirilen protokol, normalde hiPSC-CM'lerde hücre dışı alan potansiyelini kaydeden ve hücre zarlarını nanosaniye lazer ışını darbeleriyle açarak hücre içi benzeri aksiyon potansiyeli kayıtlarına izin veren standart mikroelektrot dizisi (MEA) sistemine yeni bir uzantıyı tanımlamaktadır. Bu cihaz yalnızca standart MEA avantajlarını (yani sinyal yayılımı izleme, akut ve kronik deneyler) içermekle kalmaz, aynı zamanda hücre elektroporasyonu için güçlü elektrik alan darbeleri kullanılmadan hücre içi benzeri aksiyon potansiyeli şeklinin anlaşılmasına da olanak tanır.
Berry ve ark.5 tarafından hazırlanan protokol, doğrudan kasılma kuvveti ölçümleri için 3D tasarlanmış kas dokularının (EMT'ler) tekrarlanabilir üretimini sağlayan yeni bir platformu tanımlamaktadır. Cihaz, kasılma kuvvetindeki mikronewton değişikliklerini tespit edebilir, böylece doza bağlı bileşik taraması için güçlü bir araç haline gelir. HiPSC bazlı kalp dokusundaki ve iskelet kası dokularındaki kontraktilite, aynı anda 24'e kadar dokuda kaydedilebilir ve veriler haftalar veya aylar boyunca uzunlamasına analiz edilebilir. Bu nedenle, araştırmacılar için minimum düzeyde ek beceri veya eğitim gereklidir.
Son olarak, Zhao ve ark.6 tarafından yapılan yayın, kullanıcı laboratuvarları tarafından kurum içinde üretilebilen kardiyomiyositlerle kullanım için optimize edilmiş bir dizi fonksiyonel tahlili (hücre dışı alan potansiyeli, aksiyon potansiyeli, kasılma ve kalsiyum) açıklamaktadır. Bu, daha önce yayınlanmış farklılaşma protokolleri ve Stanford Üniversitesi Kardiyovasküler Enstitüsü Biyobankası'ndan (https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html) temin edilebilen ve çok çeşitli "hastalıklı" ve kontrol hücreleri sağlayan iPSC'ler kullanılarak yapılabilir. Bu, standart yaklaşımlar (yama kelepçesi, mikroelektrot dizileri, kalsiyuma duyarlı floresan probları ve video tabanlı kasılma ölçümleri) dahil olmak üzere ana kardiyak kontraktilite ve elektrofizyoloji kayıtları için eksiksiz bir yöntem setidir.
Sonuç olarak, mevcut yöntem koleksiyonu eksiksiz olduğunu iddia etmese de (ve büyümeye devam etse de), insan kardiyomiyositlerinde kasılma ve elektrofizyolojik kayıtlardaki birçok güncel zorluğu gösteren nispeten kapsamlı bir yöntem setidir. Birincil insan kardiyomiyositleri1 için protokoller, sağlıklı donörlerden 2,3,4 türetilen ticari olarak temin edilebilen hiPSC-CM'lerin yanı sıra konjenital kalp hastalığı 3,6 imzası taşıyan hücreler için optimize edilmiş protokolleri içerir. Bu yöntemler, yama kelepçesi deneyleri6 için tek hücrelerden, sert substratlar 1,4 üzerindeki geleneksel hiPSC-CM 2D tek katmanlara, yumuşak, esnek substratlar 2,3 üzerindeki 2D kardiyomiyosit tek katmanlarına ve son olarak 3D tasarlanmış kalp dokularına5 kadar çeşitli hücre kültürü koşullarını kapsar. Dahil edilen yöntemler, kontraktilite (dolaylı olarak video tabanlı tahliller 1,3,6 ile veya doğrudan kasılma kuvveti 2,5 ile ölçülür), aksiyon potansiyeli (yama kelepçesi 6 kullanılarak tek bir hücrede, MEA 4,6 ile vekil hücre dışı alan potansiyelleriveya standart MEA sistemi4 ile aksiyon potansiyeli benzeri kayıtları kaydetmek için hücreleri porate etmek için yeni bir yaklaşım kullanarak) ve kalsiyum geçişlerini (kalsiyuma duyarlı problar6 kullanarak). Birlikte ele alındığında, bu yöntemler yalnızca diğer laboratuvarlarda çoğaltılabilen ayrıntılı protokoller sağlamakla kalmaz, aynı zamanda insan kardiyak in vitro yöntemleriyle ilgili bazı zorlukları da gösterir, örneğin: özellikle sert substrat üzerinde standart bir 2D kültür kullanıldığında hiPSC-CM olgunlaşmamışlığı; floresan voltajına veya kalsiyuma duyarlı probların istenmeyen etkileri; geleneksel aksiyon potansiyeli kayıtlarının düşük verimi; standart alan potansiyeli süre kayıtlarının yorumlanmasındaki zorluklar; ve tıbbi cihazların değerlendirilmesi için tahlillerin eksikliği (örneğin, ilaçlara karşı). Gelecekte kaçınılmaz olarak bu yöntemlerin geniş çapta uyarlanmasına yol açacak olan bu yöntemleri geliştirmek için kaç laboratuvarın çalıştığını görmek ilham verici.