Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tüm hücre yama-kelepçe kayıtları için bir hedef olarak hipotalamik kisspeptin nöronları

3.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64989

⸱

17 Mart 2023

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo

Bu makalede

Özet

Burada, gonadotropin salgılayan hormon (GnRH) hücrelerinin birincil modülatörü olan kisspeptin nöronlarını içeren beyin dilimleri üzerinde tüm hücre yama kelepçesini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Kisspeptin nöron aktivitesi hakkında bilgi ekleyerek, bu elektrofizyolojik araç son 20 yılda nöroendokrinoloji alanındaki önemli gelişmelerin temelini oluşturmuştur.

Özet

Kisspeptinler, hipotalamik-hipofiz-gonadal (HPG) ekseninin olgunlaşması ve doğurganlık için gereklidir. Anteroventral periventriküler çekirdekte ve rostral periventriküler çekirdekte bulunan hipotalamik kisspeptin nöronlarının yanı sıra hipotalamusun kavisli çekirdeği, diğer hücrelerin yanı sıra gonadotrofin salgılayan hormon (GnRH) nöronlarına yansır. Önceki çalışmalar, kisspeptin sinyallemesinin Kiss1 reseptörü (Kiss1r) aracılığıyla gerçekleştiğini ve sonuçta heyecan verici GnRH nöron aktivitesini ortaya çıkardığını göstermiştir. İnsanlarda ve deneysel hayvan modellerinde, kisspeptinler GnRH sekresyonunu ve sonuç olarak luteinize edici hormon (LH) ve folikül uyarıcı hormon (FSH) salınımını indüklemek için yeterlidir. Kisspeptinler üreme fonksiyonlarında önemli bir rol oynadığından, araştırmacılar hipotalamik kisspeptin nöronlarının içsel aktivitesinin üreme ile ilgili eylemlere nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek ve bu özellikleri değiştirebilen birincil nörotransmiterleri / nöromodülatörleri tanımlamak için çalışıyorlar. Tüm hücre yama-kelepçe tekniği, kemirgen hücrelerinde kisspeptin nöron aktivitesini araştırmak için değerli bir araç haline gelmiştir. Bu deneysel teknik, araştırmacıların spontan uyarıcı ve inhibitör iyonik akımları, dinlenme zarı potansiyelini, aksiyon potansiyeli ateşlemesini ve hücre zarlarının diğer elektrofizyolojik özelliklerini kaydetmelerini ve ölçmelerini sağlar. Bu çalışmada, hipotalamik kisspeptin nöronlarını tanımlayan elektrofizyolojik ölçümler olarak bilinen tüm hücre yama-kelepçe tekniğinin önemli yönleri ve teknikle ilgili konuların tartışılması gözden geçirilmiştir.

Giriş

Hodgkin ve Huxley, çeşitli bilimsel çalışmalarda tanımlanan bir aksiyon potansiyelinin ilk hücre içi kaydını yaptılar. Bu kayıt, aksonun içine bir mikroelektrodun yerleştirilmesine izin veren büyük bir çapa (~ 500 μm) sahip kalamar aksonu üzerinde gerçekleştirildi. Bu çalışma, bilimsel araştırmalar için büyük olanaklar sağladı ve daha sonra aksiyon potansiyeli üretimi 1,2,3,4,5,6,7,8'in iyonik temelini incelemek için kullanılan voltaj-kelepçe modunun oluşturulmasıyla sonuçlandı. Yıllar geçtikçe, teknik geliştirildi ve bilimsel araştırmalarda yaygın olarak uygulandı 6,9. 1970'lerin sonlarında Erwin Neher ve Bert Sakmann tarafından başlatılan çalışmalarla gerçekleşen yama-kelepçe tekniğinin icadı, araştırmacıların sadece tek bir elektrot kullanarak hemen hemen her hücre tipinde tek iyon kanallarını ve hücre içi zar potansiyellerini veya akımlarını kaydetmelerine izin verdi 9,10,11,12. Yama-kelepçe kayıtları, kültürlü hücreler veya doku dilimleri gibi çeşitli doku preparatları üzerinde, voltaj-kelepçe modunda (hücre zarını belirli bir voltajda tutarak, örneğin voltaja bağlı akımların ve sinaptik akımların kaydedilmesine izin veren) veya akım-kelepçe modunda (örneğin, iyon akımlarının neden olduğu dinlenme zarı potansiyelindeki değişikliklerin kaydedilmesine izin veren) yapılabilir. aksiyon potansiyelleri ve postsinaptik potansiyel frekans).

Yama-kelepçe tekniğinin kullanılması, birkaç önemli keşfi mümkün kıldı. Gerçekten de, üçüncü ventrikülün (RP3V) rostral periventriküler alanı olarak da bilinen anteroventral periventriküler ve rostral periventriküler çekirdeklerde (AVPV / PeN Kisspeptin) bulunan hipotalamik kisspeptin nöronlarının elektrofizyolojik özellikleri ve hipotalamusun (ARHkisspeptin) kavisli çekirdeği üzerine seminal bulgular13,14,15 özellikle ilgi çekicidir. 2010 yılında Ducret ve ark., başka bir elektrofizyolojik araç olan gevşek hücreli yama-kelepçe tekniğini kullanarak farelerde AVPV / PeNKisspeptinnöronlarının ilk kayıtlarını gerçekleştirdi. Bu çalışmalar, AVPV / PeNKisspeptin nöronlarının elektriksel bir tanımını sağladı ve ateşleme modellerinin östrus döngüsüne bağlı olduğunu gösterdi16. 2011 yılında, Qiu ve ark., ARHkisspeptin nöronlarının endojen kalp pili akımlarını eksprese ettiğini göstermek için tüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullandılar17. Daha sonra, Gottsch ve ark., kisspeptin nöronlarının spontan aktivite sergilediğini ve hem h-tipi (kalp pili) hem de T-tipi kalsiyum akımlarını eksprese ettiğini gösterdi, bu da ARHkisspeptin nöronlarının elektrofizyolojik özellikleri diğer merkezi sinir sistemi kalp pili nöronlarıyla paylaştığını düşündürmektedir18. Ek olarak, ARH kisspeptin nöronlarının cinsel olarak dimorfik ateşleme hızları sergilediği ve AVPV / PeNKisspeptin nöronlarının ATP'ye duyarlı potasyum kanallarından (K ATP) etkilenen bimodal dinlenme zarı potansiyeli (RMP) sergilediği gösterilmiştir19,20. Ayrıca, gonadal steroidlerin farelerde kisspeptin nöronlarının spontan elektriksel aktivitesini olumlu yönde etkilediği tespit edilmiştir 19,20,21. Kisspeptin nöronlarının elektrofizyolojik özelliklerini inceleyen ilk çalışmalardan 16,17,18,19,20 bahsedilmektedir. O zamandan beri, birçok çalışma, kisspeptin nöronlarının elektriksel aktivitesini modüle etmek için hangi faktörlerin / nöromodülatörlerin yeterli olduğunu göstermek için tüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullanmıştır (Şekil 1)17,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32.

Bu tekniğin, burada ele alınmayan diğer hücre tiplerinin yanı sıra, üreme için gerekli olan nöronların incelenmesi için önemi göz önüne alındığında, bu makalede, çözeltilerin hazırlanması, beynin diseksiyonu ve dilimlenmesi ve kayıtlar için hücre zarının mühürlenmesi gibi tüm hücre yama-kelepçe tekniğinin geliştirilmesi için temel adımlar açıklanmaktadır. Ayrıca, teknikle ilgili avantajları, teknik sınırlamaları ve optimum deneysel performans için kontrol edilmesi gereken önemli değişkenler gibi ilgili konular tartışılmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, São Paulo Üniversitesi Biyomedikal Bilimler Enstitüsü Hayvanlar Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Brezilya Hayvan Deneyleri Koleji tarafından kabul edilen etik kurallara göre gerçekleştirildi.

1. Çözümlerin hazırlanması

  1. İç çözümün hazırlanması
    NOT: Dahili çözelti yama kelepçeli mikropipeti doldurur ve hücrenin iç kısmına temas eder ( Şekil 2'deki bir örneğe bakın). Dahili çözümler, ölçülecek faaliyet türüne bağlı olarak değişebilir33.
    1. Deneysel amacını ve uygun kayıt türünü göz önünde bulundurarak dahili çözümü seçin. Akım kelepçesi modunda membran potansiyelini kaydetmek için, 120 mM K-glukonat, 1 mM NaCl, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1 mM MgCl 2, 1 mM CaCl2, 3 mM KOH, 10 mM KCl ve 4 mM (Mg)-ATP'den oluşan dahili çözeltiyi kullanın. Tüm tuzları Tablo 1'de verildiği gibi istenen son hacme göre tartın.
    2. Çözeltinin nihai hacminin% 90'ına ulaşmak için yeterli miktarda deiyonize su kullanın. Bu hacim, pH ve ozmolariteyi ayarlamak için yeterli alan sağlayacaktır.
    3. Tüm malzemeleri iyice ekleyip karıştırdıktan sonra, bir pH metre kullanarak pH'ı 5 M KOH ile 7.2-7.3'e ayarlayın. 275-280 mOsm civarında olması gereken ozmolariteyi kontrol etmek için bir ozmometre kullanın (gerekirse sadece aşağı doğru ayarlayın).
    4. Dahili çözeltiyi önceden hazırlayın ve 8 ° C'de saklayın. ATP'yi deneme gününe ekleyin. ATP içeren dahili çözeltiyi -20 ° C'de (1 mL aliquots) 3-4 ay boyunca saklayın.
  2. Dilimleme çözeltisinin hazırlanması
    1. 238 mM sakaroz, 2.5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.0 mM NaH 2 PO4, 10 mM glikoz, 1.0 mM CaCl 2 ve 5.0 mM MgCl2 içeren dilimleme çözeltisi hazırlayın. Tüm tuzları Tablo 2'de gösterildiği gibi istenen son hacme göre tartın. Hazırlanacak bu çözeltinin tam hacmi, kesme odasının boyutuna bağlı olacaktır.
    2. Tüm tuzları deiyonize suda karıştırırken, sürekli olarak karbogen ile doyurun (% 95 O2 ve% 5CO2). Dilimleme çözeltisine karbojen sağlamak için polietilen boruyu (1,57 mm dış çap [OD] x 1,14 mm iç çap [ID]) bir karbogen silindirine takın. Tüpün açık ucunu dilimleme çözeltisini içeren kabın içinde tutun.
    3. Tüm malzemeleri iyice karıştırdıktan sonra, bir pH metre kullanarak pH'ı% 10 nitrik asit ile 7.3'e ayarlayın. 290-295 mOsm olması gereken ozmolariteyi kontrol etmek için bir ozmometre kullanın (gerekirse yalnızca aşağı doğru ayarlayın). Daha sonra, çözeltiyi 0-2 ° C'ye soğutun.
  3. Kayıtlar için aCSF çözümü hazırlama
    1. 124 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgSO4, 5 mM glikoz ve 2,5 mM CaCl2 içerenkayıtlar için yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) çözeltisi hazırlayın. Tüm tuzları Tablo 3'te verilen istenen son hacme göre tartın.
    2. Tüm tuzları deiyonize suda karıştırırken, adım 1.2.2'de açıklandığı gibi sürekli olarak karbogen (% 95O2 ve% 5 CO2) ile doyurun.
    3. Tüm bileşenleri ekleyip karıştırdıktan sonra, bir pH metre kullanarak pH'ı 7.3'e (% 10 nitrik asit kullanılabilir) ayarlayın. 290-300 mOsm olması gereken ozmolariteyi kontrol etmek için bir ozmometre kullanın. Daha sonra, aCSF'yi bir beher içine dökün ve 30 ° C'de bir su banyosunda tutun.

2. Beyin diseksiyonu ve dilimleme

NOT: Farklı beyin yapıları farklı düzlemlerde (koronal, sagital veya yatay dilimler) kesmeyi gerektirebileceğinden, dilimleri elde etmek için kesin yaklaşım ilgilenilen beyin bölgesine bağlıdır. Tipik olarak, AVPV / PeN ve ARH'deki Kiss1 eksprese eden hücreleri incelemek için (burada AVPV / PeN Kisspeptin nöronları ve ARHkisspeptin nöronları olarak adlandırılır; Şekil 2A,B), koronal beyin dilimleri (200-300 μm) genellikle 17,19,20,21,34 yapılır. AVPV / PeN Kisspeptin nöronları bregmadan yaklaşık 0.5 ila -0.22 mm uzaklıkta bulunurken, ARHkisspeptin nöronları -1.22 ila -2.70 mm'dir. Çekirdeklerin konumu, stereotaksik fare beyni atlası35 veya Allen Fare Beyni Referans Atlası (http://mouse.brain-map.org/) kullanılarak belirlenebilir. Bu çalışmada yetişkin Kiss1-Cre/GFP dişi (diestrus-evre) ve erkek fareler36 kullanılmıştır.

  1. Beyin çıkarılması
    1. Diseksiyon bölgesini ve beyni çıkarmak için gereken araçları hazırlayın: kafa kesme makası, iris makası, Castroviejo kavisli makas, osteotom, cımbız, spatula, filtre kağıdı, Petri kabı, tıraş bıçağı ve siyanoakrilat yapıştırıcı.
    2. Dilimleri yapmadan önce, sonraki tüm prosedürlerin hızlı bir şekilde yapılması gerektiğinden, diseksiyonun yapılacağı tezgahı hazırlayın. Vibratom gibi bir dilimleme cihazına erişebildiğinizden emin olun.
    3. Dokuyu dilimlemeden önce beyin dilimlerini korumak için bir kayıt odası hazırlayın. Ticari bir markadan (Malzeme Tablosu) 24 mm x 15 mm x 2 mm (U x G x Y) banyo boyutlarında bir kayıt odası edinin veya şirket içinde bir tane yapın.
      NOT: Şirket içi bir geri kazanım odası aşağıdaki gibi imal edilebilir: 24 delikli bir plakayı dokuz kuyu mevcut olacak şekilde kesin. Dokuz kuyucuğun tabanına naylon bir elek yapıştırın. Kuyu plakasının geri kalanıyla, naylonun alt kısmı serbest kalacak şekilde bir taban yapın. Bu uyarlanmış taban, aCSF içeren 500 mL'lik bir beherin içine yerleştirilebilir (Ek Şekil 1).
    4. Her şeyi hazırladıktan sonra,% 4 -% 5 izofluran kullanarak hayvanı inhale anestezi ile uyuşturun. Anestezi, etik kurul tarafından onaylanmış bir protokole uygun olmalıdır. Hayvan hareketsiz kaldıktan kısa bir süre sonra, hayvanın derinlemesine uyuşturulmasını sağlamak için kuyruk ve pençe çimdik testleri yapın.
    5. Hücre canlılığını arttırmak için kalp hala aktifken farelerin kafasını hızla kesin. Beyni dekapitasyondan sonra hızlı bir şekilde toplayın.
    6. Cerrahi makasla hayvanın kafatasının tepesindeki deride, kaudalden rostral'e kadar bir kesi yapın ve kafa derisini hayvanın kafasından çıkarın. Daha sonra, interparietal plakayı iris makası ile sagital sütür boyunca kesin ve oksipital kemiği çıkarın. Osteotomu parietal kemiğin altına kaydırın ve beyin açığa çıkana kadar yavaşça dışarı çekin.
    7. Beyni açığa çıkardıktan sonra, başını baş aşağı çevirin, her iki taraftaki trigeminal siniri görselleştirmek için beyni yavaşça indirin, ardından Castroviejo kavisli makas kullanarak trigeminal siniri kesin. Hipotalamusu görselleştirdikten sonra, optik siniri tanımlayın ve yavaşça kesin.
      NOT: Optik siniri keserken dikkatli olun, çünkü onu çekmek AVPV / PeN çekirdeğini içeren bitişik hipotalamik alanı yırtacaktır.
    8. Frontal lobun en ön kısmını kesin ve beyni tamamen çıkarın. Dilimleri elde edene kadar beyni hemen dilimleme çözeltisine daldırın.
  2. Beyin örneklerinin dilimlenmesi
    1. Fazla çözeltiyi kurutmak için beyni filtre kağıdına (Petri kabında desteklenen) yerleştirin. Daha sonra, keskin bir kesme tıraş bıçağı ile, beyin sapını beyincik ile dokunun geri kalanından ayıran bir koronal kesim gerçekleştirin.
    2. Daha sonra, beynin kaudal kısmını vibratomun tabanına yapıştırın ve dilimleme cihazının odasını 0-2 ° C'ye soğutulmuş dilimleme / aCSF çözeltisi ile doldurun. İşlem sırasında, dilimleme çözeltisini soğuk tutmak için vibratom odasının etrafına kuru buz paketleyin.
    3. Tıraş bıçağını vibratoma yerleştirin ve cihazın uygun kesme parametrelerini ayarlayın: hız = 3, frekans = 9 ve besleme = 250 μm. Doku dilimleme prosedürü sırasında dilimleri geri kazanım odasına (adım 2.1.3'te açıklanmıştır) aktarmak için bir akrilik transfer pipeti (silikon meme ucuna tutturulmuş ters Pasteur cam pipet) kullanın. Dilim alımından sonra doku iyileşmesi için 60 dakika bekleyin.

3. Kayıt için hücre sızdırmazlığı

  1. Kayda başlamadan önce tüm ekipman parçalarının (mikroskop, amplifikatör, sayısallaştırıcı, mikromanipülatör ve diğerleri) açık olduğundan emin olun.
  2. Mikroskopa bağlı ticari bir markadan (Malzeme Tablosu) kayıt odasını, kayıtlar için aCSF çözümü ile doldurun. aCSF'yi sürekli olarak 2 mL/dak hızında perfüze etmek için bir perfüzyon pompası kullanın.
  3. İlgilendiğiniz bir beyin dilimini (birer birer birer) kayıt odasına aktarın. Hipotalamik dilimleri odaya aktarmak için bir akrilik transfer pipeti (silikon meme ucuna tutturulmuş ters Pasteur cam pipet) kullanın. Dilimi aCSF perfüzyonu sırasında hareket etmeyecek şekilde tutmak için bir dilim ankrajı (Malzeme Tablosu) kullanın.
  4. Mikroskopa bağlı kayıt odasının ortasına bir dilim yerleştirin. Dilim konumu, mikroskop altında istenen bölgenin iyi bir şekilde görülebilmesi ve kayıt mikropipetine mükemmel bir şekilde ulaşılabilmesi için kritik öneme sahiptir.
  5. Dilimi konumlandırmaya ve ilgi alanını bulmaya yardımcı olmak için daldırma mikroskobunun düşük güçlü objektif lensini (10x veya 20x) kullanın.
  6. İlgilenilen bölgeyi bulduktan sonra, objektif lensi yüksek güçlü lense (63x) geçirin ve doku seviyesine odaklanın, endojen floresan proteinini ve hedef bölgedeki hücrelerin şekillerini gözlemleyerek kisspeptin hücrelerini beyin dilimi20'nin yüzeyinde konumlandırın.
  7. Olası bir hedef hücre bulunduğunda, bilgisayar ekranında fare imleciyle veya ilgi alanının üzerine kare gibi bir biçim çizerek işaretleyin. Bilgisayar ekran işareti, kayıt mikropipetinin konumunu hücreye yönlendirmeye yardımcı olur.
  8. Hedef hücrenin tam yerini belirledikten sonra, hedefi kaldırın ve dahili çözelti ile doldurulmuş kayıt mikropipetini tanıtın. Mikropipeti elektrot tutucuya yerleştirirken, dahili çözeltinin gümüş elektrot ile temas halinde olduğundan emin olun.
    NOT: Mikropipet hazırlama, elektrot tutucu üzerine yerleştirme ve konumlandırma için lütfen33'e bakın.
  9. Mikropipet tutucusuna bir polietilen boru (≈130 cm daha uzun) ile bağlanan 1-3 mL hava dolu bir şırınga kullanarak, döküntülerin mikropipete girmesini önlemek için mikropipeti aCSF çözeltisine batırmadan önce pozitif basınç uygulayın; yaklaşık 100-200 μL hava uygulayın.
  10. Mikromanipülatörü kullanarak, mikropipeti hedefin merkezinin altına yönlendirin. X-Y-Z eksenindeki mikropipeti ilgilenilen hücreye doğru yönlendirmek için mikromanipülatör üzerindeki düğmeleri hareket ettirin.
  11. Mikropipetin ucunu görmek için odağı ayarlayın ve odağı dilime yaklaştırın, ancak çok yakın değil. Mikromanipülatörün hızını azaltın ve mikropipeti yavaşça odak düzlemine indirin. Mikropipet ucunun dilime aniden nüfuz etmediğinden, hücrenin/hedef bölgenin yüzeyine dokunana kadar yavaşça alçaldığından emin olun.
  12. Yaklaşma yolundaki kalıntıları temizlemek için mikropipet tutucuya bağlı 1-3 mL hava dolu şırınga ile hafif pozitif basınç (≈100 μL) uygulayın.
  13. Hedef hücreye odaklanın ve mikropipeti hedef hücreye yaklaştırmak için mikromanipülatörü X-Y-Z ekseninde yavaşça hareket ettirin. Mikropipet hücreye dokunulduğunda, mikropipet ucundan uygulanan basıncın neden olduğu bir çukur gözlenecektir (Şekil 2C).
  14. Çukuru oluşturduktan sonra, mikropipetin hücreye yakınlığı nedeniyle, mikropipet ile hücre arasındaki sızdırmazlığı oluşturmak için mikropipet tutucuya bağlı tüpten ağızdan (1-2 s) zayıf, kısa süreli emme uygulayın (gigaohm conta veya gigaseal >1 GΩ; Şekil 2D). Contayı oluşturmak için, yazılım üzerindeki voltaj kelepçesi modunu kullanın. Mühür oluşumu detayları için lütfen33'e bakınız.
  15. Conta sabit kalırsa (gigaohm conta mekanik olarak kararlı olmalı ve yaklaşık 1 dakika boyunca gözlemle belirlenen gürültü paraziti olmamalıdır), tutma voltajını ilgili hücrenin en yakın fizyolojik dinlenme potansiyeline ayarlayın. Kisspeptin hipotalamik nöronlar için -50 mV önerilir.
  16. Plazma zarını kırmak için hücreye kapatılmış mikropipet ile ağızdan kısa süreli emme (negatif basınç) uygulayın (Şekil 2E). Emiş yeterli kuvvetle gerçekleştirildiğinde, yırtılmış membranın mikropipeti tıkamaması ve membranın büyük bir bölümünü veya hatta hücreyi çekmemesi için yeterli tam hücre konfigürasyonu elde edilir.
  17. Kullanılan sistem ayarları kılavuzunu kontrol edin. Seri direncini (SR) ve tüm hücre kapasitansını (wcc) dijital olarak kontrol etmek ve hesaplamak için yazılımı kullanın (bkz.
  18. Voltaj kelepçesi modunda, hücre zarını kırdıktan sonra, tüm hücre seçeneğini etkinleştirin ve tüm hücre sekmesine atıfta bulunan Otomatik komutuna tıklayın. Hücrenin SR ve wcc'si otomatik olarak hesaplanacak ve yazılım tarafından anında görüntülenecektir. Bu parametreler, Malzeme Tablosu33'te belirtilen yükselteç ile membran testi yapılarak da kontrol edilebilir.
  19. Hücre canlılığı parametrelerini kontrol ettiğinizden emin olun. Kisspeptin nöronları için, elektrofizyolojik ölçümlerin şunlar olduğunu kontrol edin: SR < 25 mΩ, giriş direnci 0.3 GΩ > ve mevcut mutlak değeri 30 pA< tutmak (kişisel gözlemler ve referans21). AVPV / PeN Kisspeptin veya ARHkisspeptin nöronlarının wcc'sinin ortalama değeri, gonad bozulmamış farelerde ≈ 10-12 pF'dir20.
  20. Deneyler sırasında SR ve hücre kararlı durum kapasitansını izleyin. Kayıt sırasında SR'nin %20'den fazla değişmediğinden ve membran kapasitansının sabit olduğundan emin olun.
  21. Yazılım ayarlarını kontrol edin. Deneme türüne göre kayıtlar için özel protokoller oluşturun. Akım kelepçesi modunda membran potansiyelini kaydetmek için, Malzeme Tablosunda belirtilen ekipmanla, alçak geçirgen elektrofizyolojik sinyalleri 2-4 kHz'de filtreler ve sonuçları bir yazılımda çevrimdışı olarak analiz eder (yazılım bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın).
  22. Tüm hücre konfigürasyonu düzgün bir şekilde sağlandıktan sonra, voltaj-kelepçe modunda sinaptik akımları ölçün (Şekil 2G). Dinlenme membranı potansiyelindeki (RMP) değişiklikleri ve akım kelepçesi modunda indüklenen RMP varyasyonlarını kaydedin (Şekil 2H). Hücre zarının depolarizasyonu gibi RMP'deki değişiklikler, Şekil 1'de gösterildiği gibi, banyoya bilinen bir ilaç / nörotransmitter uygulanarak (adım 3.2'de açıklanmıştır) indüklenebilir.
    NOT: Akım-kelepçe modunda, membran voltajını istenen voltajda tutmak için pozitif veya negatif akım enjekte edilebilir. Kisspeptin nöronları için, membran potansiyelinin kendiliğinden varyasyonunu kaydetmek için genellikle sıfır akım enjeksiyonu (I = 0) ayarlarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İnsan rekombinant büyüme hormonunun (hGH) hipotalamik kisspeptin nöronlarının aktivitesi üzerindeki olası etkilerini incelemek için, beyin dilimlerinde tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gerçekleştirdik ve bu hormonun AVPV / PeN Kisspeptin ve ARHkisspeptin nöronlarının aktivitesinde akut değişikliklere neden olup olmadığını değerlendirdik. Bu çalışmada yetişkin Kiss1-Cre/GFP dişi (diestrus-evre) ve erkek fareler36 kullanılmıştır. Deneyler için gonad-bozulmamış hayvanlar seçildi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tüm hücre yama-kelepçe tekniğinin geliştirilmesi, bilimsel araştırma geliştirmek ve çeşitli keşiflere olanak sağlamak için büyük önem taşıyan bilimsel topluluk üzerinde önemli bir etkiye sahipti. Bilim üzerindeki etkisi, 1991'de Nobel Tıp Ödülü ile sonuçlanmak için yeterliydi, çünkü bu keşif, iyon kanallarının fizyolojik ve patolojik koşullar altında nasıl işlediğinin daha iyi anlaşılmasına ve terapötik ajanlar için potansiyel hedeflerin belirlenmesine kapı açtı 11,39,40,41

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan edilmemelidir.

Teşekkürler

Bu çalışma São Paulo Araştırma Vakfı [FAPESP hibe numaraları: 2021/11551-4 (JNS), 2015/20198-5 (TTZ), 2019/21707/1 (RF); ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Finans Kodu 001" (HRV) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
aCSF, iç ve dilimleme çözeltileri için bileşikler< / güçlü >
ATPSigma Aldrich / çeşitliA9187
CaCl < alt > 2< / alt >Sigma Aldrich / çeşitliC7902
D - (+) - GlikozSigma Aldrich / çeşitliG7021
EGTASigma Aldrich / çeşitliO3777
HEPESSigma Aldrich / çeşitliH3375
KCLSigma Aldrich / çeşitliP5405
K-glukonatSigma Aldrich / çeşitliG4500
KOHSigma Aldrich / çeşitliP5958
MgCl < alt > 2< / alt >Sigma Aldrich / çeşitliM9272
MgSO< alt > 4< / alt> Sigma Aldrich / çeşitli230391
NaClSigma Aldrich / çeşitliS5886
NaH2< / sub>PO4< / sub> Sigma Aldrich / çeşitliS5011
NaHCO3< / sub>Sigma Aldrich / çeşitliS5761
nitrik asitSigma Aldrich / çeşitli225711DİKKAT
SükrozSigma Aldrich / çeşitliS1888
< güçlü > Ekipmanlar< / güçlü >
Hava masasıTMC63-534
AmplifikatörMoleküler CihazlarMulticlamp 700B
Bilgisayarçeşitli-DIGIDATA
1440 DÜŞÜK GÜRÜLTÜLÜ VERİ TOPLAMA SİSTEMİMoleküler CihazlarDD1440
Dijital peristaltik pompaIsmatecISM833C 
Faraday kafesiTMC81-333-03
Görüntüleme KamerasıLeicaDFC 365 FX
MikromanipülatörSutter AletleriRoe-200
Mikropipet ÇektirmeNarishigePC-10
MikroskopLeicaDM6000 FS
OsteotomBonther ekipmanları & Tecnologia/çeşitli128
Kurtarma odasıWarner Instruments/Harvardaparatı-şirketiçinde yapılabilir
Kayıt odasıWarner Instruments640277
SpatulaFisher Scientific /çeşitliFISH-14-375-10; BALIK-21-401-20
Vibratom LeicaVT1000 S
Su Banyosu Fisher Scientific / çeşitliIsotemp
Yazılım ve sistemler< / strong>
AxoScope 10 yazılımıMolekülerCihazlar-CommanderYazılımı
LAS X geniş alan sistemiLeica-Görüntüelde etme ve analizi
MultiClamp 700BMoleküler CihazlarMULTICLAMP 700BCommander Yazılımı
PCLAMP 10 WINDOWS İÇİN YAZILIMMoleküler CihazlarPclamp 10 Standart
Aletler
Ag/AgCl elektrot, pelet, 1.0 mmWarner Instruments64-1309
Kavisli hemostatik forsep
yapıştırıcıLOCTITE/çeşitli-
Dekapitasyon makasıçeşitli-Filtreçeşitli-Cam
kılcal damarlar (mikropipet)World Precision Instruments, IncTW150F-4
İris makasıBonther equipamentos & Tecnologia/çeşitli65-66
Pasteur cam pipet Sigma Aldrich / çeşitliCLS7095B9-1000EA
Petri kabıçeşitli-Polietilen
boru & nbsp;Warner Instruments64-0756
Beyin diseksiyonu için tıraş bıçağıTED PELLATEDP-121-1
Vibratom için tıraş bıçağıTED PELLATEDP-121-9
MakasBonther ekipmanları & Tecnologia/çeşitli71-72, 48,49;  
silikon emzikçeşitli-Dilimli
Ankraj Warner Instruments64-0246
Şırınga filtreleriMerck Millipore LtdaSLGVR13SLMillex-GV 0.22 & mu; m
CımbızBonther equipamentos & Tecnologia/çeşitli131, 1518
çeşitli-siyanoakrilat kağıdı

Kaynaklar

  1. Bezanilla, F. Single sodium channels from the squid giant axon. Biophysical Journal. 52 (6), 1087-1090 (1987).
  2. Clay, J. R. Potassium current in the squid giant axon. International Review of Neurobiology. 27, 363-384 (1985).
  3. Gandini, M. A., Sandoval, A., Felix, R. Patch-clamp recording of voltage-sensitive Ca2+ channels. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 329-325 (2014).
  4. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
  5. Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
  6. Suk, H. J., Boyden, E. S., van Welie, I. Advances in the automation of whole-cell patch clamp technology. Journal of Neuroscience Methods. 326, 108357(2019).
  7. Cole, K. S., Curtis, H. J. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
  8. Bernstein, J. Ueber den zeitlichen Verlauf der negativen Schwankung des Nervenstroms. Pflüger, Archiv für die Gesammte Physiologie des Menschen und der Thiere. 1 (1), 173-207 (1868).
  9. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Archiv. 391 (2), 85-100 (1981).
  10. Hill, C. L., Stephens, G. J. An introduction to patch clamp recording. Methods in Molecular Biology. 2188, 1-19 (2021).
  11. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  12. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  13. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  14. Smith, J. T., Cunningham, M. J., Rissman, E. F., Clifton, D. K., Steiner, R. A. Regulation of Kiss1 gene expression in the brain of the female mouse. Endocrinology. 146 (9), 3686-3692 (2005).
  15. Smith, J. T., et al. Differential regulation of KiSS-1 mRNA expression by sex steroids in the brain of the male mouse. Endocrinology. 146 (7), 2976-2984 (2005).
  16. Ducret, E., Gaidamaka, G., Herbison, A. E. Electrical and morphological characteristics of anteroventral periventricular nucleus kisspeptin and other neurons in the female mouse. Endocrinology. 151 (5), 2223-2232 (2010).
  17. Qiu, J., Fang, Y., Bosch, M. A., Rønnekleiv, O. K., Kelly, M. J. Guinea pig kisspeptin neurons are depolarized by leptin via activation of TRPC channels. Endocrinology. 152 (4), 1503-1514 (2011).
  18. Gottsch, M. L., et al. Molecular properties of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the mouse. Endocrinology. 152 (11), 4298-4309 (2011).
  19. de Croft, S., et al. Spontaneous kisspeptin neuron firing in the adult mouse reveals marked sex and brain region differences but no support for a direct role in negative feedback. Endocrinology. 153 (11), 5384-5393 (2012).
  20. Frazão, R., et al. Shift in Kiss1 cell activity requires estrogen receptor alpha. The Journal of Neuroscience. 33 (7), 2807-2820 (2013).
  21. DeFazio, R. A., Elias, C. F., Moenter, S. M. GABAergic transmission to kisspeptin neurons is differentially regulated by time of day and estradiol in female mice. The Journal of Neuroscience. 34 (49), 16296-16308 (2014).
  22. Mansano, N. D. S., et al. Vasoactive intestinal peptide exerts an excitatory effect on hypothalamic kisspeptin neurons during estrogen negative feedback. Molecular and Cellular Endocrinology. 542, 111532(2022).
  23. Jamieson, B. B., Piet, R. Kisspeptin neuron electrophysiology: Intrinsic properties, hormonal modulation, and regulation of homeostatic circuits. Frontiers in Neuroendocrinology. 66, 101006(2022).
  24. Silveira, M. A., et al. STAT5 signaling in kisspeptin cells regulates the timing of puberty. Molecular and Cellular Endocrinology. 448, 55-65 (2017).
  25. Silveira, M. A., et al. Acute effects of somatomammotropin hormones on neuronal components of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. Brain Research. 1714, 210-217 (2019).
  26. Cravo, R. M., et al. Leptin signaling in Kiss1 neurons arises after pubertal development. PLoS One. 8 (3), e58698(2013).
  27. Manfredi-Lozano, M., et al. Defining a novel leptin-melanocortin-kisspeptin pathway involved in the metabolic control of puberty. Molecular Metabolism. 5 (10), 844-857 (2016).
  28. Qiu, J., et al. Insulin excites anorexigenic proopiomelanocortin neurons via activation of canonical transient receptor potential channels. Cell Metabolism. 19 (4), 682-693 (2014).
  29. de Croft, S., Boehm, U., Herbison, A. E. Neurokinin B activates arcuate kisspeptin neurons through multiple tachykinin receptors in the male mouse. Endocrinology. 154 (8), 2750-2760 (2013).
  30. Frazao, R., et al. Estradiol modulates Kiss1 neuronal response to ghrelin. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 306 (6), E606-E614 (2014).
  31. True, C., Verma, S., Grove, K. L., Smith, M. S. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript is a potent stimulator of GnRH and kisspeptin cells and may contribute to negative energy balance-induced reproductive inhibition in females. Endocrinology. 154 (8), 2821-2832 (2013).
  32. Navarro, V. M., et al. Regulation of NKB pathways and their roles in the control of Kiss1 neurons in the arcuate nucleus of the male mouse. Endocrinology. 152 (11), 4265-4275 (2011).
  33. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments. (112), e54024(2016).
  34. Gibson, A. G., Jaime, J., Burger, L. L., Moenter, S. M. Prenatal androgen treatment does not alter the firing activity of hypothalamic arcuate kisspeptin neurons in female mice. eNeuro. 8 (5), (2021).
  35. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain. Stereotaxic Coordinates. 2nd edition. , Academic Press. (2001).
  36. Cravo, R. M., et al. Characterization of Kiss1 neurons using transgenic mouse models. Neuroscience. 173, 37-56 (2011).
  37. Emane, M. N., Delouis, C., Kelly, P. A., Djiane, J. Evolution of prolactin and placental lactogen receptors in ewes during pregnancy and lactation. Endocrinology. 118 (2), 695-700 (1986).
  38. Fuh, G., Colosi, P., Wood, W. I., Wells, J. A. Mechanism-based design of prolactin receptor antagonists. The Journal of Biological Chemistry. 268 (8), 5376-5381 (1993).
  39. Barinaga, M. Ion channel research wins physiology Nobel. Science. 254 (5030), 380(1991).
  40. Colquhoun, D. Neher and Sakmann win Nobel Prize for patch-clamp work. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (12), 449(1991).
  41. Greger, R. Nobel Prize for Medicine and Physiology 1991. Analysis of the function of single ion channel. Deutsche Medizinische Wochenschrift. 116 (48), 1849-1851 (1991).
  42. Brau, M. E., Vogel, W., Hempelmann, G. Possible applications of the "patch-clamp" method in anesthesiologic research; comment. Anasthesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin, Schmerztherapie. 31 (9), 537-542 (1996).
  43. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods in Enzymology. 207, 3-14 (1992).
  44. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. Journal of Veterinary Cardiology. 9 (1), 25-37 (2007).
  45. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Scientific American. 266 (3), 44-51 (1992).
  46. Sachs, F., Auerbach, A. Single-channel electrophysiology: use of the patch clamp. Methods in Enzymology. 103, 147-176 (1983).
  47. Dallas, M., Bell, D. Patch Clamp Electrophysiology: Methods and Protocols. 1st edition. , (2021).
  48. Robinson, R. A., Stokes, R. H. Electrolyte Solutions. 2nd edition. , Butterworths Scientific. (1959).
  49. de Souza, G. O., et al. Gap junctions regulate the activity of AgRP neurons and diet-induced obesity in male mice. The Journal of Endocrinology. 255 (2), 75-90 (2022).
  50. Houades, V., Koulakoff, A., Ezan, P., Seif, I., Giaume, C. Gap junction-mediated astrocytic networks in the mouse barrel cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (20), 5207-5217 (2008).
  51. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131 (1), 133-143 (1995).
  52. Pan, J. T., Li, C. S., Tang, K. C., Lin, J. Y. Low calcium/high magnesium medium increases activities of hypothalamic arcuate and suprachiasmatic neurons in brain tissue slices. Neuroscience Letters. 144 (1-2), 157-160 (1992).
  53. Hamill, O. P., McBride, D. W. Induced membrane hypo/hyper-mechanosensitivity: a limitation of patch-clamp recording. Annual Review of Physiology. 59, 621-631 (1997).
  54. Herbison, A. E., Moenter, S. M. Depolarising and hyperpolarising actions of GABA(A) receptor activation on gonadotrophin-releasing hormone neurones: towards an emerging consensus. Journal of Neuroendocrinology. 23 (7), 557-569 (2011).
  55. Qiu, J., et al. High-frequency stimulation-induced peptide release synchronizes arcuate kisspeptin neurons and excites GnRH neurons. eLife. 5, e16246(2016).
  56. Chaves, F. M., Mansano, N. S., Frazão, R., Donato, J. Tumor necrosis factor α and interleukin-1β acutely inhibit AgRP neurons in the arcuate nucleus of the hypothalamus. International Journal of Molecular Sciences. 21 (23), 8928(2020).
  57. Chaves, F. M., et al. Effects of the isolated and combined ablation of growth hormone and IGF-1 receptors in somatostatin neurons. Endocrinology. 163 (5), 045(2022).
  58. Wasinski, F., et al. Growth hormone receptor in dopaminergic neurones regulates stress-induced prolactin release in male mice. Journal of Neuroendocrinology. 33 (3), e12957(2021).
  59. Furigo, I. C., Ramos-Lobo, A. M., Frazao, R., Donato, J. Brain STAT5 signaling and behavioral control. Molecular and Cellular Endocrinology. 438, 70-76 (2016).
  60. Zampieri, T. T., et al. Postnatal overnutrition induces changes in synaptic transmission to leptin receptor-expressing neurons in the arcuate nucleus of female mice. Nutrients. 12 (8), 2425(2020).
  61. Furigo, I. C., et al. Growth hormone regulates neuroendocrine responses to weight loss via AgRP neurons. Nature Communication. 10 (1), 662(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Hipotalamik N ronlarElektrofizyolojik zelliklerBeyin Kesiti Haz rlamaDinlenme Membran PotansiyeliSinaptik Ak mlarVoltaj KenetlemeAk m KenetlemeTek H cre RTPCR
Tüm hücre yama-kelepçe kayıtları için bir hedef olarak hipotalamik kisspeptin nöronları
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.