Method Article

Minipiglerde Subdural Yumuşak Elektrokortikografi (ECoG) Dizisi İmplantasyonu ve Uzun Süreli Kortikal Kayıt

DOI:

10.3791/64997

⸱

March 31st, 2023

 ,  , 
1Laboratory for Soft Bioelectronic Interfaces, Neuro-X Institute, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir minipig modelinde yumuşak subdural elektrot dizilerinin uzun süreli performans ve güvenlik değerlendirmesi için cerrahi yöntem ve araçları, postoperatif manyetik rezonans görüntülemeyi, işitsel korteksin elektrofizyolojisini, implantın elektrokimyasal özelliklerini ve postmortem immünokimyayı açıklayan bir yöntem sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörolojik bozukluklar ve hastalıklar elektrokortikografi (ECoG) dizileri kullanılarak teşhis edilebilir veya tedavi edilebilir. İlaca dirençli epilepside, bunlar epileptik bölgenin rezeke edilmesini tanımlamaya yardımcı olur. Beyin-bilgisayar arayüzleri gibi uzun süreli uygulamalarda, bu epikortikal elektrotlar beynin hareket niyetini kaydetmek, felçli hastaların robotik uzuvlarını kontrol etmek için kullanılır. Bununla birlikte, mevcut sert elektrot ızgaraları, yüksek çözünürlüklü beyin kayıtları ve uzun vadeli biyoentegrasyon ihtiyacına cevap vermemektedir. Son zamanlarda, yüksek performansla uzun süreli implant stabilitesi elde etmek için uyumlu elektrot dizileri önerilmiştir. Bununla birlikte, bu yeni implant teknolojileri için klinik öncesi çalışmalara, insan hastalara tercüme edilmeleri için uzun vadeli işlevselliklerini ve güvenlik profillerini doğrulamak için ihtiyaç vardır. Bu bağlamda, domuz modelleri, büyük organ boyutları ve kolay hayvan kullanımı nedeniyle tıbbi cihazların geliştirilmesinde rutin olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, literatürde, çoğunlukla cerrahi sınırlamalar ve implant sisteminin canlı bir hayvan üzerindeki entegrasyonu nedeniyle sadece birkaç beyin uygulaması tanımlanmıştır.

Burada, uzun süreli implantasyon (6 ay) için yöntemi ve minipig modelinde yumuşak ECoG dizilerinin değerlendirilmesini sunuyoruz. Çalışma ilk olarak, elektrofizyoloji kayıtları için enstrümantasyon konektörlerini barındıran manyetik rezonans görüntüleme (MRI) uyumlu polimerik transdermal port ile entegre edilmiş yumuşak bir mikrofabrikasyon elektrot dizisinden oluşan implant sistemini sunmaktadır. Daha sonra çalışma, subdural implantasyondan hayvan iyileşmesine kadar cerrahi prosedürü açıklar. Uyarılmış potansiyellerin akustik stimülasyonla indüklendiği örnek bir hedef alan olarak işitsel kortekse odaklanıyoruz. Son olarak, tüm beynin MRG'sini, implant elektrokimyasal karakterizasyonunu, intraoperatif ve serbestçe hareket eden elektrofizyolojiyi ve çıkarılan beyinlerin immünohistokimya boyamasını içeren bir veri toplama dizisini tanımladık.

Bu model, kortikal protezlerin yeni tasarımının güvenliğini ve işlevini araştırmak için kullanılabilir; insan hastalara çeviriyi öngörmek için zorunlu klinik öncesi çalışma.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nörolojik bozukluklar ve hastalıklar elektrokortikografi (ECoG) dizileri kullanılarak teşhis edilebilir veya tedavi edilebilir. Bu elektrot ızgaraları beynin yüzeyine implante edilir ve insan korteksinin kaydedilmesine veya uyarılmasınaizin verir 1. Örneğin ilaca dirençli epilepsi durumunda, epileptik bölgenin rezeke edilmesine yardımcı olurlar2. Beyin-bilgisayar arayüzleri gibi uzun süreli uygulamalarda, bu epikortikal elektrotlar beynin hareket niyetini kaydetmek, felçli hastaların robotik uzuvlarını kontrol etmek için kullanılır3. Bununla birlikte, mevcut elektrot ızgaraları, sert polimerik substratlara gömülü sert metalik bloklardan yapılır ve yüksek çözünürlüklü beyin kayıtları ve uzun süreli subdural biyoentegrasyon (>30 gün) ihtiyacına cevap vermez. Aksine, implante edilen cihazın fibrotik kapsüllenmesine yol açan ve zamanla daha kötü performansa yol açan lokal doku reaksiyonları oluştururlar. Son zamanlarda, doku reaksiyonunu sınırlayarak uzun süreli implantasyonlarda yüksek performans elde etmek için mikrofabrikasyon teknikleriyle üretilen ince polimerik substratlar kullanan esnek veya gerilebilir elektrot dizileri önerilmiştir 4,5. Bununla birlikte, bu yeni implant teknolojileri için uzun vadeli işlevselliklerini ve güvenlik profillerini doğrulamak için klinik öncesi çalışmalara ihtiyaç vardır, böylece insan hastalara çeviri öngörülebilir. Bu bağlamda, minipig ve domuz modelleri, büyük organ boyutları ve kolay hayvan kullanımı nedeniyle diğer tıbbi bağlamlarda (örneğin kardiyovasküler, iskelet veya mide sistemleri) cihazların geliştirilmesinde rutin olarak kullanılmaktadır 6,7,8. Bununla birlikte, literatürde nörofizyoloji için beyni hedef alan sadece birkaç uygulama tanımlanmıştır, çoğunlukla cerrahi yaklaşım sınırlamaları ve implant sisteminin canlı bir hayvan üzerindeki entegrasyonu nedeniyle 9,10,11,12. Bunlar genellikle canlı hayvanlarda kronik implantasyonla uyumlu değildir, çünkü örneğin implante edilebilir gömülü elektronikler gibi karmaşık donanımların geliştirilmesini gerektirirler. Ek olarak, translasyonel çalışmalarda biyogüvenlik yönü için çok önemli olan implant sisteminin hedef doku üzerindeki etkisini araştırmazlar. Domuz modeli, kortikal yapı, kafatası kemiği ve deri kalınlığı açısından insan anatomisine yakındır13. Ayrıca, davranışsal görevleri öğrenme yetenekleri, onları fonksiyonel rehabilitasyon stratejilerini veya duyusal algıları araştırmak için güçlü bir model haline getirir14.

Yeni teknolojilerin ve tedavilerin insanlara tercüme edilmesi, yetkili tıbbi otoritelerin gerektirdiği şekilde güvenlik ve etkinliğin değerlendirilmesini gerektirir. Bunlar genellikle teknik belgelerde ve norm15'te açıklanmıştır, ancak yalnızca bu testlerin geçilmesini gerektirirler ve güvenlik çalışmasına paralel olarak cihaz implantasyonunun veya diğer yararlı verilerin toplanmasının gerçek etkisini araştırmazlar. Beyin tam bir biyogüvenlik ve performans çalışması için, burada beyin görüntüleme verilerinin uzunlamasına ve sistematik bir koleksiyonunu, elektrofizyolojik ölçümleri, implante edilen elektrotların elektrokimyasal özelliklerinin değerlendirilmesini ve bir domuz modelinde ölüm sonrası histolojiyi sunuyoruz. Bunu başarmak için, eksiksiz bir deneysel model oluşturmak için birkaç hususun dikkate alınması gerekir: (i) elektrotlara bağlanmak için mekanik olarak stabil bir transdermal port ile birlikte cihaz implantasyonu için minimal invaziv cerrahi erişim, (ii) hem anestezi altında hem de serbestçe hareket eden koşullarda implante edilen elektrotlar için performans çıktısı olarak hizmet eden sağlam bir elektrofizyolojik kayıt paradigması, (iii) beynin ve implantın evrimini ve implante edilen sistemin görüntüleme ekipmanı ile uyumluluğunu takip etmek için farklı zaman noktalarında in vivo görüntüleme (bilgisayarlı tomografi [BT] ve/veya manyetik rezonans görüntüleme [MRI]) ve (iv) histolojik analiz için beyni çıkarmak için bir doku hazırlama boru hattı.

Burada, uzun süreli implantasyon yöntemi (6 ay) ve minipig modelinde yumuşak ECoG dizilerinin değerlendirilmesi (Şekil 1'de şematik olarak gösterilmiştir) hakkında rapor veriyoruz. Yumuşak elektrot dizileri önceki raporlarımızda sunulmuştur ve elektrik parçaları olarak kullanılan elastik altın ince filmleri gömen ince silikon membranlardan yapılmıştır16,17. Doku ile temas, beyin dokusuna yumuşak ve verimli bir elektrokimyasal arayüz için bir silikon matrise gömülü platin nanopartiküllerin bir karışımı ile yapılır18. İmplantlar, kafatası ve deri boyunca subdural olarak tünellenmiş esnek bir kablo aracılığıyla, hayvanın kafasındaki konektörleri barındıran transdermal bir porta bağlanır. İmplantın boyutu ve şekli, hedefe ve çalışmanın ihtiyaçlarına göre özelleştirilebilir. Bu çalışmadaki mevcut elektrot şeritleri, klinik şeritlerin gerçek boyutunu yansıtmaktadır. Klinik olarak mevcut subdural şeritler ve ızgaralar aynı yaklaşım kullanılarak karşılaştırıcı olarak kullanıldı. Polimerik MRG uyumlu transdermal port, kafatasına sıkıca sabitleyen bir ayak plakası sistemi kullanılarak kafatasına yerleştirilir. Burada, her iki hemisferin subdural implantasyonundan hayvanın iyileşmesine kadar cerrahi prosedürü ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Uyarılmış potansiyellerin hem anestezili hem de serbest hareket eden koşullarda akustik stimülasyonla indüklendiği örnek bir hedef alan olarak işitsel kortekse odaklanıyoruz. Farklı zaman noktalarında, hayvanın beyni anestezi altında MRG'de (veya klinik elektrotlar için BT'de) görüntülenir ve elektrotların elektrokimyasal özellikleri ölçülür. Elektrot karakterizasyon yöntemleri, implantın ve elektrot-doku arayüzünün gelişimini takip etmek için kullanılır (daha fazla ayrıntı için bakınız Schiavone ve ark.19). Bunlar, elektrot temasının stimülasyon yeteneklerini araştırmak için kronoamperometriyi, elektrotun dirençli ve kapasitif bileşenlerinin evrimini gösterebilen elektrokimyasal empedans spektroskopisini (EIS) ve hermetik kapsülleme arızalarını araştırmak için kanallar arası direnç ölçümlerini içerir. Son olarak, ötenazi sonrası beyni perfüze etmek, yerinde elektrotlarla eksplant etmek, kesitlere ayırmak ve farklı inflamasyon belirteçleri kullanarak histolojik analiz yapmak için bir doku ekstraksiyon boru hattı geliştirdik. Genel olarak, bu yöntem, beyindeki yeni teknolojilerin ve tedavilerin gelecekteki klinik çevirisi için sağlam multimodal veri toplama ile klinik öncesi çalışmalara izin verecektir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cerrahi ve davranışsal prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı yönergelerine uygun olarak yerel etik komite tarafından onaylandı ve GE11120A numaralı yetki ile yerel (Cenevre Kantonu) ve federal (İsviçre) veterinerlik yetkilileri tarafından onaylandı. Bu çalışmada 2-6 aylıkken (5-8 kg) dişi Göttingen minipigleri (n=7) kullanıldı.

1. Ameliyat öncesi planlama

  1. Yumuşak implant sisteminin in vitro karakterizasyonu
    1. Kronoamperometri: Bir darbe üretecine paralel bağlanmış bir osiloskop kullanarak iki fazlı bir akım darbe evriminin (yani, voltaj geçici [VT]) enjeksiyonu üzerine voltaj düşüşünü kaydedin. Puls üretecini sırayla her bir elektroda ve salin çözeltisinde (fosfat tamponlu salin [PBS] 1x) bir platin sayacına bağlayın. Ayarlar için adım 3.1'e bakın.
    2. Elektrokimyasal empedans spektrogramı: Bir potansiyometre kullanarak farklı frekanslarda elektrokimyasal empedansı ölçün. Platin sayacı ve tuzlu su çözeltisinde (PBS 1x) bir Ag/AgCl referans elektrodu kullanarak potansiyometreyi her bir elektrota sırayla bağlayın. Ayarlar için adım 3.2'ye bakın.
    3. Kanallar arası direnç: Kuru durumda, el tipi bir multimetre kullanarak bitişik kanallar arasındaki doğru akım (DC) direncini ölçün.
    4. İmplant seçimi: Yukarıda belirtilen üç ölçümden sonra, aşağıdaki kriterlerle birlikte implantı seçin: 100 kΩ'un altında 1 kHz'de empedans ve 1 MΩ'un altında kanallar arası direnç yok.
  2. Sterilizasyon
    1. İmplant sterilizasyonu: Seçilen implantları bir sterilizasyon işaretleyicisi ile birlikte tek tek sterilizasyon torbalarına yerleştirin ve kapatın. Ameliyat sırasında steriliteyi sağlamak için çift ambalaj kullanın.
      NOT: Bu durumda, kısa zaman döngüsü ve düşük sıcaklık (55 °C) nedeniyle hidrojen peroksit (H 2 O2) gaz sterilizasyonu kullanılır. Alternatifler etilen oksit (ETO) gazı veya otoklav sterilizasyonudur ancak implant sistemi ile uyumluluk sağlanmalıdır.
    2. Alet sterilizasyonu: Temizlenen aletleri sterilizasyon işaretleyicileri ile birlikte çift sterilizasyon torbalarına veya steril alet kutularına yerleştirin. Otoklav sterilizasyonu aletler için en yaygın olanıdır, ancakH 2 O2 veya ETO olası alternatiflerdir.

2. Yumuşak ECoG dizilerinin cerrahi implantasyonu

  1. Anestezi
    1. Premedikasyon: Hayvanı izole edin ve gece boyunca aç bırakın. İntradermal olarak 0.75 mg / kg'da midazolam, 0.25 μg / kg'da atropin ve 0.1 mg / kg'da haldol karışımı enjekte edin ve hayvan sakinleşene kadar bekleyin. Devam etmeden önce hayvanı tartın.
    2. İntravenöz (IV) kurşunun montajı:
      1. Hayvanı ameliyat masasına bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirin. % 3 -% 3.5 oranında sevofluran kullanarak hayvana bir yüz maskesi yerleştirerek anesteziyi indükleyin.
      2. Elektrokardiyogram uçlarını karnına, kuyruğa bir kan doygunluk sensörüne ve burun deliğine bir sıcaklık sensörüne yerleştirin.
      3. Kulak damarına bir IV ucu yerleştirin ve tuzlu suyla dolu bir şırınga kullanarak kan erişimini onaylayın. Merhem kullanarak gözlerin nemli kalmasını sağlayın.
    3. Entübasyon: 0.5 mg / kg'da bir atrakuryum bolusu, 1 mg / kg'da ketamin ve 1-2 μg / kg'da fentanil enjekte edin. Entübasyon için hayvanı sırtına yerleştirin. 4,5 mm'lik bir tüp yerleştirin.
    4. İlaç tedavisi: Entübasyondan sonra sevofluran anestezisini durdurun ve 10 mg/kg/saat'te propofol infüzyonu, 2 μg/kg/saat'te fentanil, 0.2-0.5 mg/kg/saat'te atrakuryum ve 4-7 mg/kg/saat'te salin infüzyonu uygulayın. Ameliyat sırasında beyin şişmesini azaltmak için 1 g / kg / s'de bir mannitol infüzyonu başlatın.
      NOT: Yerel hayvan etik kurulu tarafından önerildiği takdirde multimodal analjezi rejimi kullanılabilir.
  2. Ameliyat öncesi röntgen
    1. Hayvanı sfenks pozisyonunda karnına yerleştirin. Hayvanın beyninin ve kafatasının yakınındaki herhangi bir metal nesneyi geçici olarak çıkarın (örneğin, burun deliğindeki sıcaklık kurşunu).
    2. Kemiğin kontrastı ile eksenel ve sagital düzlem röntgeni elde edin. Beynin önündeki ve arkasındaki kafatası kalınlığını ölçmek için bir ölçek görevi görmesi için sagital edinim alanına bilinen boyutlara sahip metalik bir nesne yerleştirin.
    3. Frontal sinüslerin yerini belirleyin (kafatasının altındaki boşluklarla görülebilir) ve kalıcı bir işaretleyici kullanarak hayvanın kafasındaki en arka yeri işaretleyin. Bu, aşağıda açıklanan cerrahi yaklaşımda herhangi bir kraniyotomi veya vida yerleştirmenin yapılabileceği en uzak noktayı gösterecektir.
  3. Aseptik alan ve cilt hazırlığı: Başın tüm yüzeyini cerrahi alanın ötesinde tıraş edin. Steril bir ped kullanarak, kafayı betadin ile iyice ovalayın. Ardından, sadece cerrahi pencereyi ortaya çıkarmak için steril örtüleri enstrümantasyon masasına ve hayvanın üzerine yerleştirin. Son olarak, betadin kullanarak kafayı tekrar steril bir ped ile ovalayın.
  4. Kraniyotomi ve durotomi
    1. Cilt kesimi: Cildi orta hat boyunca bir neşter bıçağıyla kesin. Kas ve periosteuumu (her iki tarafta bregmadan yanal olarak 25 mm ve bregmanın 40 mm ön ve arkasında) bir raspatory kullanarak kemikten ayırın ve daha sonra delme için optimum erişim elde etmek için yayıcıları yerleştirin.
    2. Ölçümler ve işaretleme: Bregma ve lambda'yı tanımlayın ve steril bir cerrahi kalemle işaretleyin (Şekil 2A, B). Steril bir cetvel kullanarak, her iki hemisferde implantasyon hedefi etrafında ortalanmış kemik flebi taslağını tanımlayın. Bu özel durumda, işitsel korteks, bregmadan -5 mm ila -15 mm ve lateral olarak -4 mm ila -20 mm koordinatları ile seçildi. Ardından, kraniyotomiyi implantın boyutuna ve anatomik işaretlere göre ayarlayın ve açıklık boyutunu sınırlayın.
    3. Kraniyotomi:
      1. Yuvarlak bir kesme ucuna sahip bir kemik matkabı kullanarak, adım 2.2'de ölçülen kafatasının kalınlığını dikkate alarak kraniotominin ana hatlarını delin. Kemiğin aşırı ısınmasını önlemek için delme yerini tuzlu su çözeltisiyle sulayın.
      2. Anahattı dura mater'e ulaşana kadar homojen bir şekilde dikkatlice delin. İlk atılımda, neredeyse kırılacak kadar inceltilene kadar anahattı delmeyi bitirin. Ardından, kraniyotomi kenarını kaldıraç olarak kullanarak kemik flebini tek parça halinde kırmak için düz bir spatula (orta hat tarafında veya yan tarafta) kullanın. Çok fazla dirençle karşılaşılırsa, kemiği inceltmeye devam edin.
      3. Kemik parçasını steril tuzlu suya yerleştirin.
      4. Kemik flebi çıkarıldıktan sonra, keskin kemik kenarının dura mater'i kesmesini önlemek için bir Kerison kullanarak kraniotominin kenarını dikkatlice kırın.
      5. Dura mater veya kemikte aşırı kanama ile karşılaşılırsa, sırasıyla Jel Köpük veya kemik mumu kullanın. Kraniotomiye ıslak bir kompres (steril salin solüsyonunda standart ped) yerleştirin ve bu adımı diğer hemisferde tekrarlayın (Şekil 2B).
    4. Durotomi:
      1. 6-0 dikiş kitindeki iğneyi kullanarak, kraniyotominin ön veya arka ucundaki dura mater'i medial ve lateral taraf arasında dikkatlice delin ve kaldırın ve bıçak bıçağıyla bir kesi başlangıcı oluşturun.
      2. Daha sonra, korteksi korumak için bir kesme tabanı görevi gören subdural boşluğa yerleştirilen küçük düz bir spatula kullanarak, her iki aletle aynı anda ilerleyerek dura materde bir ön-arka yarık oluşturun. Yarığın implantın genişliğinden biraz daha büyük olduğundan emin olun (Şekil 2C). Bu adımda herhangi bir kanama veya hasar meydana gelirse, jel köpük ile örtün ve durana kadar bekleyin.
        NOT: Kanamayı önlemek için dura materde büyük kan damarları mevcutsa, yarık yörüngesi uyarlanmalıdır.
  5. Implantasyonu
    1. Cihaz yerleştirme:
      1. İmplantı (Ek Şekil 1A) her iki taraftan salinle sulayın, böylece subdural boşluğa daha kolay kayar. İmplantı dura mater yarığın üzerine yerleştirin ve küçük forsepslerle cihazı her bir kenarda sırayla kaydırarak subdural olarak yerleştirin.
      2. Cihazın kaide ucunu dikkatlice tutun ve yerleştirmeyi engelleyen gerginlik oluşturmamak için implantla ilerleyin. Konektör kenarı yarığın üstüne yerleştirildiğinde, yerleştirmeyi durdurun.
    2. İmplantı sabitleyin: İmplantı yerine sabitlemek için, kraniyotominin kenarından sonra veya ankraj kanatlarına kablonun üzerine titanyum bir köprü yerleştirin ve uygun tornavidayı kullanarak bir veya iki titanyum vidayla sabitleyin (Şekil 2D).
    3. Zemin yerleşimi: Topraklama kablolarının yalıtımının 1 cm'sini dikkatlice çıkarın ve kraniotominin arka ucuna (veya ilgilenilen korteksten veya büyük kan damarlarından uzaktaki herhangi bir epidural konuma) epidural olarak yerleştirin ( Şekil 2E'deki tel)
    4. 2.4.4 adımlarını tekrarlayın. ve kontra-lateral yarımkürede 2.5.1.-2.5.3.
    5. Yerleşimi doğrulamak için intraoperatif röntgen:
      1. Dokuyu nemli tutmak için ameliyat yerinin üzerine ıslak bir ped (steril salin solüsyonunda standart ped) yerleştirin. Ardından, hayvanın başını örtmek için steril bir ameliyat örtüsü yerleştirin.
      2. X-ışını işaretleyicilerini gösterge olarak kullanarak implantların iyi yerleştirildiğinden ve katlanmadığından emin olmak için düzlem röntgen görüntüleri (eksenel ve sagital) alın. Değilse, örtüyü çıkarın ve tekrar takmak için cihazı çıkarın (2.4.4. ve 2.5.1.-2.5.3 adımlarını tekrar izleyin).
    6. Dura mater kapatma: 3-0 emilebilir bir sütür ve küçük bir iğne tutucu kullanarak dura mater'i implant kablosunun etrafına dikkatlice dikin. Dikiş teli ile ince zarı yırtmadan iki dura mater kenarını mümkün olduğunca bir araya getirin (Şekil 2D, E).
    7. Kemik flebi yerleştirme: Bir titanyum vida kullanarak her kemik flebinin ön ve arka kısmına bir titanyum köprü sabitleyin. Sonraki adımlarda ayak plakası ayaklarının yerleşimine göre Ti-köprülerinin konumunu planlamaya dikkat edin. Titanyum köprülerin ucunu kafatasına vidalayın (Şekil 2F, G).
  6. Kaide ve ayak plakası yerleşimi
    1. Konumlandırma: Bu konfigürasyonda, ayak plakasının her biri iki vida deliği olan altı ayağı vardır (Ek Şekil 1B). Vidaların yerini optimize etmek için ayak plakasının kafatası üzerindeki yerleşimini planlayın (bunları kraniotominin kenarına veya temporal kasın içine yerleştirmekten kaçının). Vidalanamıyorlarsa bacaklardaki delikleri atlayın.
    2. Ayak plakası sabitleme: Ayak plakasının titanyum vidalarını sıkıca yerine oturana kadar vidalayın (bkz. Şekil 2H).
    3. Kaide yerleşimi: Bağlantı kablolarının üzerindeki titanyum köprüleri çıkarın ve ayak plakasına inmek için kaidenin üzerinden çevirin. Kaideyi ayak plakasına vidalayın. Kaidenin sıkıca yerine oturduğunu kontrol edin (Şekil 2I).
  7. Dikiş ve kapatma
    1. Yaranın temizlenmesi: Herhangi bir kemiğin veya diğer kalıntıların deri altı boşluğunu tuzlu su ile yıkayarak temizleyin. Silindiri takip eden yuvarlak bir kenar oluşturmak için kaide kenarlarının etrafındaki bir miktar deriyi kesin.
    2. Deri altı dikişler: Yayıcıları çıkarın ve cilt fleplerini birlikte katlayın. Basit kesintili dikişler veya basit sürekli dikişler kullanarak 3 mm aralıklarla 4-0 emilemeyen sütür teli ile cilt altı sütürler oluşturun. Kesiden uzaklaşın, insizyonun her iki tarafında ona doğru hareket edin.
    3. Dermal sütürler: 6-0 emilemeyen sütür teli kullanarak, dikişler 5 mm aralıklarla cildi dikin. Kesiden uzaklaşın, insizyonun her iki tarafında ona doğru hareket edin. Bir boşluğu önlemek için iki cilt flebi arasında ve kaide kenarına yakın iyi bir doku yerleşimi elde etmeye özen gösterin (Şekil 2J).
    4. Yara pansumanı: Yara bölgesini steril bir ped ve betadin ile tekrar temizleyin. Yaranın üzerine kendinden yapışkanlı steril bir bandaj uygulayın.
  8. İn vivo ölçümler: İn vivo ölçümler için bölüm 3, 4 ve 5'i izleyin.
  9. Uyanış: Tüm ölçümler yapıldıktan sonra, hayvanı tüm anesteziklerden çıkarın, ancak havalandırma altında tutun. Analjezi için, 24 saat boyunca bir buprenorfin bandı (25 mg / saat) uygulayın. Uyanma süresini hızlandırmak için hayvanı perdelerle kaplı bir ısıtma yastığına yerleştirin. Spontan solunum geri kazanıldığında, hayvanı ekstübe edin ve bilinç geri gelene kadar (1 ila 4 saat sürebilir) bir oksijen yüz maskesi altına koyun.
  10. Ameliyat sonrası hayvan bakımı: 5 gün boyunca hayvanı yakın gözetim altında tutun. Diğer hayvanlardan ayrılmış, günde iki kez 75 mg'da bir doz sefaleksin verin. Islatılmış steril pedlerle bol miktarda betadin uygulayarak (en iyi beslenme sırasında yapılır) yaranın dezenfeksiyonunu günlük olarak gerçekleştirin.
    NOT: Uzun süreli bakım ve barınma: Ameliyat edilen hayvan 24 saat izole tutulur. Hayvan, akranlarıyla sosyal olarak etkileşime girecek kadar iyiyse, orijinal sosyal grubuna geri konur. Cihazın kafaya entegrasyonunu takip etmek için kaide ve cilt açıklığının günlük gözlemi yapılmalıdır. Uygun olduğunda, kaidenin etrafındaki yeri bol miktarda betadin ile temizleyin.

3. Yumuşak implantın in vivo karakterizasyonu

  1. Kronoamperometri: Bir darbe üretecine paralel bağlanmış bir osiloskop kullanarak bifazik bir akım darbe evriminin (yani VT) enjeksiyonu üzerine voltaj düşüşünü kaydedin. Darbe üretecini sırayla her elektroda ve topraklama kablosuna bağlayın. Stimülasyon darbesini 100 Hz'de 300 μs darbe genişliği ile 100 μA'da gerçekleştirin.
  2. Elektrokimyasal empedans spektroskopisi: Bir potansiyometre kullanarak elektrokimyasal empedansı farklı frekanslarda ölçün. Topraklama kablosunu hem karşı elektrot hem de toprak olarak kullanarak darbe üretecini her elektroda sırayla bağlayın. Uyarma voltajını 200 mV'a ve frekans aralığını 1 Hz ila 1 MHz arasında, on yılda üç nokta olacak şekilde ayarlayın.
  3. Kanallar arası kısa ölçümler: El tipi bir multimetre kullanarak bitişik kanallar arasındaki DC direncini ölçün. İn vivo, kanallar arası DC direnci yalnızca 1 kΩ'un altında herhangi bir eksiklik görünmediğini doğrulamak için ölçülür, bu da toplam kapsülleme hatasını gösterir.

4. Elektrofizyolojik kayıt

  1. Spontan aktivite: Kablosuz kayıt sistemini kaideden geçirin ve temel aktiviteyi 2-3 dakika boyunca kaydedin. Bu kayıtlar, işitsel uyarılmış potansiyelleri analiz etmek için bir kontrol görevi görecektir.
  2. İşitsel uyarılmış potansiyeller: Kablosuz sisteme ek olarak, hoparlörleri hayvan kulaklarında kapalı bir alana yerleştirin. 200 tekrardan fazla yaklaşık 20,000 dB ses basıncı seviyesinde (SPL) farklı frekanslarda (70-120 Hz arasında değişen) ses patlaması akustik stimülasyonu çalın. Ardından, kayıtların ortalamasını alın ve analiz için uyaran süresi boyunca hizalayın.
  3. Duyusal uyarılmış potansiyeller: İğneleri buruna üç farklı pozisyonda yerleştirin. İşe alım eğrilerini elde etmek için farklı genliklerde nabız üreteci ile burnu ~30 saniye uyararak duyusal potansiyelleri uyandırın.

5. İn vivo görüntüleme

  1. Hayvan taşıma: Hayvanı adım 2.1'de açıklandığı gibi propofol anestezisi altında tutun. Hayvanı ameliyathaneden görüntüleme tesislerine ve geri taşımak için ventilatör, şırınga pompası ve yaşamsal belirti monitörü barındıran bir taşıma arabası kullanın.
  2. Bilgisayarlı tomografi röntgen taraması: Hayvanı tarayıcı masasına yerleştirin ve başın etrafındaki metal nesneleri (örn. sıcaklık sensörü) çıkarın. Kemik kontrastı için otomatik akım ve voltaj seçimi ile izometrik toplama kullanarak en küçük çözünürlükte (0,4 mm dilim kalınlığı) bir BT taraması elde edin.
  3. Manyetik rezonans görüntüleme: Metal içeren tüm ekipmanı hayvandan çıkarın (MRI uyumlu IV uçları ve entübasyon tüpü kullanın). MRI odasının dışında bulunan ve uzun bir tüp aracılığıyla hayvana bağlanan bir ventilatör kullanarak hayvanı havalandırın ve sevofluran altında% 3 -% 3.5'te uyuşturun. İlk sekanstan önce, 1-2 μg/kg'da bir bolus fentanil enjekte edin. En küçük çözünürlükte üç izometrik dizi kullanın: T1-, T2- ve turbo spin eko (TSE) ağırlıklı diziler ( Ek Dosya 1'de gösterilen parametreler).

6. Serbestçe hareket eden kayıt

  1. Beyinden gelen uyanık sinyalleri kaydetmek için bölüm 4'te açıklanan prosedürün aynısını izleyin. Hayvanı deneycinin kollarında tutarak veya dikkatini dağıtmak için hayvanı ikramlarla besleyerek kablosuz başlığı takın. Hayvanın yakınına yerleştirilmiş harici hoparlörleri kullanarak akustik stimülasyon sağlayın.

7. Perfüzyon ve doku hazırlama

  1. İSTEĞE BAĞLI: Hayvan zaten anestezi altında değilse, anestezi protokolü için adım 2.1'i izleyin.
  2. Perfüzyon için karotis artere kateter yerleştirilmesi (Ek Şekil 2)
    1. Karotis arter ve juguler ven diseksiyonu: Bir koterizatör / kesici kullanarak boğazı orta hatta kesin. Önce deriyi, sonra orta beyaz çizgiyi takip eden kası kesin (altında damar yok) (Ek Şekil 2A).
    2. Trakea çevresinde ve kasın altında boşluk açmak için parmaklarınızı kullanarak daha fazla açın. Karotis arteri arayın (dayak ve pembemsi); Vagal sinir bazen de etrafındadır (beyaz) ve juguler ven altında veya yanda (kırmızı) olabilir. Yayıcıları yerleştirin (bkz. Ek Şekil 2B).
    3. İnce forseps ve yuvarlak makas kullanarak karotis arterin diseksiyonunu başlatın. Konjonktif, dokuyu açmak için makas kullanın. Kan damarı yoksa kesin; kan damarları varsa, koterize edin ve ilerleyin (Ek Şekil 2C, D). Yeterince diseke edildiğinde, karotis arterin altına girmek için bir kelepçe kullanın, böylece tamamen izole edilir (Ek Şekil 2E).
    4. Aynı işlemi juguler ven için tekrarlayın (Ek Şekil 2F).
    5. Her iki damar da tamamen diseke edildiğinde ve izole edildiğinde, etraflarına dikiş teli yerleştirin. Henüz kapatmayın. Karotis çevresinde, biri en tabanda (beyin perfüzyonu için dikiş 1-kalp tarafı) ve diğeri diğer tarafta (sütür 2) olmak üzere iki sütür Ek Şekil 2G'de gösterilmiştir.
    6. Juguler venin etrafına bir dikiş yerleştirin (sütür 3), kapalı değil; Damarın daha sonra kesilmesi için telleri bantla işaretleyin.
    7. Dikiş 1'i çok sıkı bir şekilde kapatın, aksi takdirde kanar (Ek Şekil 2H). Üç düğüm bağlayın. Ağırlık koymak ve karotis arterde gerginlik oluşturmak için telin üzerine bir kelepçe yerleştirin.
    8. Karotis arter diseksiyonunun karşı tarafında bir damar kelepçesi kullanarak karotis arteri klempleyin (beyin perfüzyonu için beyin tarafı; Ek Şekil 2I). Dikiş 2 ortada, henüz kapanmadı.
    9. Karotis arteri yakalamak ve çekmek için siyah forseps kullanın. İnce makas kullanarak, karotis arterin yarısını diseksiyonun tabanına yakın bir yerde (sütür 1'in yakınında, kalp tarafı; bkz. Ek Şekil 2J). Bölümün mümkün olduğunca temiz olduğundan ve sadece "kılıfa" değil, geminin kendisine ulaştığından emin olun; Aksi takdirde, kateter geçmeyecektir. Kateteri Ek Şekil 2K'da gösterildiği gibi yerleştirin.
    10. Kateteri yıkayın ve önce PBS ile doldurun, böylece kateterde hava kalmaz (Ek Şekil 2K ek).
    11. Sütür 2'yi yeterince sıkı bir şekilde kapatın, böylece kaybolmaz, ancak kateterin hala biraz hareket edebilmesi için çok fazla değil (Ek Şekil 2L). Ardından, damar kelepçesini çıkarın, kateteri mümkün olduğunca yerleştirmeyi bitirin ve dikiş 2'nin kapanmasını tamamlayın (sıkıca kapatın).
    12. İstenirse, ekstra bir güvenlik adımı olarak yaranın çıkışında kateterin tabanını cilde tutturmak için dikiş 1'de dikiş telleri kullanın. Ardından, hayvanı perfüzyon bölgesine aktarın ve PBS / heparine takın. Perfüzyon başladığında sütür 3'ü çekin ve şah damarını kesin
  3. Ötenazi: Pentobarbital (90 mg / kg) intravenöz olarak verin ve tam dozun başarılı bir şekilde uygulandığından emin olmak için hattı salinle yıkayın.
  4. Perfüzyon: Bir perfüzyon pompası (200 mL/dak) kullanarak karotis kateteri PBS/heparine (15 kg'lık bir domuz için 1 L) ve ardından %4 paraformaldehit (PFA) içeren PBS'ye (15 kg'lık bir domuz için 5 L) takın. Perfüzyon başladığında sütür 3'ü çekin ve şah damarını kesin.
  5. Doku toplama
    1. Kafa kesme: Perfüzyon bittiğinde, bir neşter kullanarak, deriyi ve kası keserek ve bıçağı birinci ve ikinci omurlar arasına sokarak hayvanın kafasını vücuttan ayırın.
    2. Postfiksasyon: Kafayı 4 ° C'de 48 saat daha PBS'de% 4 PFA'ya daldırın ve ardından beyin ekstraksiyonundan önce PBS'ye aktarın.
    3. Beyin ve implant ekstraksiyonu:
      1. Bir neşter kullanarak cildi çıkarın ve omuriliği takip ederek beyinciğe kadar ilk omurlardan başlayarak bir rongeur kullanarak kemiği dikkatlice kesmeye başlayın. Beyincik açığa çıktığında, temporal kemikleri dikkatlice çıkarın ve parietal ve frontal lobları ortaya çıkarın.
      2. Bu noktada, kaideyi ayak plakasından vidalayın ve ayak plakasının ayaklarını pense ile kesin. İmplantları dura mater çıkışından dışarı çekmeden, implant sistemini kemikten kurtarmak için kafatasına kablo girişinin yakınındaki kemiği çıkarın.
      3. İmplant kabloları kemiğe gömülüyse, kabloyu çıkışa mümkün olduğunca yakın kesin. Yeterli beyin yüzeyi açığa çıktığında, küçük bir makas kullanarak orta hattı takip eden durayı dikkatlice kesin.
      4. İmplant kablolarını dura mater çıkışından kurtarın. Beyindeki implant yerleşiminden fotoğraflar çekin. Ardından, beyni aşağıdaki kraniyal sinirlerden ayırmak için küçük bir kaşık kullanın. Beyni dikkatlice çıkarın. İmplantları beyinden çıkarın.
    4. Beynin postfiksasyonu: Perfüzyon kalitesine bağlı olarak, ekstrakte edilen beyni 4 ° C'de PBS'de% 4 PFA'da 24 saat boyunca tekrar ekleyin. Beyin kesilene kadar 4 ° C'de 0.1 M PBS'de tutun.
    5. Beyin kesimi: Bir tıraş bıçağı kullanarak iki yarım küreyi ayırın. Ardından, beyni ortogonal olarak dört farklı parçaya kesin. İmplante edilen bölgeyi ve bir kontrol alanını içeren iki blok elde etmek için implante edilen bölgeyi ikiye bölün. Daha fazla kontrol slaytına ihtiyaç duyulursa diğer iki bloğu saklayın.
    6. Beyin kriyoproteksiyonu ve dondurma: Beyin bloklarını, beyin dalıp dengeye ulaşana kadar 4 ° C'de önce %15 sakaroz ve ardından %30 sükroz çözeltisine aktarın. Daha sonra izopentan içinde dokuyu -55 °C'de doku dondurma sisteminde dondurun.

8. Histoloji

  1. Doku kesiti
    1. Kriyostat: Donmuş beyni bir kriyostata yerleştirin ve tam kesitler elde edilene kadar düzeltin. Daha sonra, beyni 40 μm'lik bölümlere ayırın ve 0.1 M PBS'de üçlü gruplar halinde kuyucuk plakalarına daldırın. Plakaların sırasını dikkatlice not edin.
    2. Kesit seçimi: Analiz edilecek bölgeye (implante edilen bölge veya kontrol bölgesi) bağlı olarak kesitleri seçin. Hasar olup olmadığını kontrol etmek için ince bir fırça kullanarak bölümleri kuyu plakalarından sırayla çıkarın. Daha fazla boyama için bunları 0,1 M PBS ile doldurulmuş yeni kuyu plakalarına yerleştirin.
  2. İmmünohistokimya
    1. Hazırlık: Kesitleri 15 dakika boyunca% 0.3 Triton X / PBS'de, ardından oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca% 3 sığır serum albümini (BSA) / PBS ile inkübe edin.
    2. Birincil antikorlar: Dokuları RT'de 48 saat boyunca birincil antikorlarla inkübe edin (anti-GFAP, sıçan, 1/300'de seyreltilmiş; anti Iba1, tavşan, 1/400'de seyreltilmiş; anti-NeuN, gineapig, 1/1.000'de seyreltilmiş; tümü% 1 BSA / PBS'de). Kuyu plakalarını alüminyum folyo ile örtün.
    3. Yıkama: Kuyuları 0,1 M PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
    4. İkincil antikorlar: Dokuları RT'de 2 saat boyunca ikincil antikorlarla inkübe edin (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 555; tümü% 1 BSA / PBS'de 1/400'de seyreltilir).
    5. DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol): Dokuları DAPI ile 15 dakika inkübe edin (% 1 BSA / PBS'de 1 / 1.000).
    6. Yıkama: Kuyucukları 0.1 M PBS ile 15 dakika boyunca beş kez yıkayın.
    7. Montaj: Kızakları montaj ortamı ve lamel kullanarak monte edin. Slaytları karanlıkta buzdolabında 4 °C'de saklayın.
  3. Görüntüleme
    1. Tüm slayt görüntüleme: Üç farklı dalga boyunda (640 nm, 560 nm, 485 nm) bir slayt tarayıcı mikroskobu kullanarak slaytları 10x büyütmede (objektif çalışma mesafesi değeri = 3.100 μm) görüntüleyin. Tüm güç ve kazanç bilgileri Ek Dosya 2'de bulunabilir.
    2. Mikroskobik görüntüleme: Dört dalga boyunda (Alexa Fluor 647, DAPI, Cy3, EGFP) konfokal bir mikroskop kullanarak ilgilenilen bölgeyi 20x büyütmede (apokromat 20x/0.8 M27) görüntüleyin. Tüm güç ve kazanç bilgileri Ek Dosya 3'te bulunabilir.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cihazların yerleşimini (Şekil 3A) ve işlevselliğini doğrulamak için, kaide yerleştirildikten sonra intraoperatif olarak elektrofizyolojik kayıtlar yapılır. Başlangıç sinyali ilk olarak bazal aktivitenin kontrolü olarak hiçbir uyaran olmadan 2 dakika boyunca elde edilir. İkinci olarak, hayvan farklı frekanslarda (500-20.000 Hz) bir ton patlaması ile akustik olarak uyarılır ve dizi boyunca işitsel uyarılmış potansiyelleri haritalamak için uyaran periyodu boyunca ham verilerin ortalaması alınır (örneğin, taban çizgisine kıyasla 800 Hz'de; Şekil 3B). Burada gösterilen veriler işlenmemiştir, ancak çok fazla gürültü varsa, çentik ve bant geçiren filtreler uygulanabilir. Ameliyathanedeki tipik gürültü kaynakları arasında, edinimden önce çıkarılması gereken ısıtma yastıkları, tıkalı matkaplar ve emme veya koterizatörler (diğerlerinin yanı sıra) bulunur. Uyanık kayıtlarda, daha temiz veri setleri için çiğneme gibi başın etrafındaki büyük kas hareketlerinden kaçınılmalıdır.

Bu protokol her kayıt zaman noktasında uygulandı ve tek bir kanal için sinyaller zaman içinde karşılaştırılabildi. Yanıtın sağlamlığını ve gelişimini gösteren bir örnek Şekil 3C'de gösterilmiştir. Deneyin zaman seyri boyunca her bir kontağın kayıt kapasitesi, her zaman noktasında temel sinyalin standart sapması hesaplanarak değerlendirilebilir (Şekil 3D). Bu çalışmada, sinyal-gürültü oranı, kayıt süresinin sınırlı süresi (yani 2 dakika) nedeniyle bazı değişkenliklere rağmen, 0. gün ile 6. ay arasında azalmış ve yerleşmiştir. Bu, elektrot empedansları ile daha fazla ilişkilendirilebilir.

İn vivo görüntüleme, beyin durumunu ve implant pozisyonunu değerlendirmek için ameliyat sonrası gerçekleştirilir. Protokolün ilk yinelemesinde, intraoperatif röntgen yapılmadı, bu da Şekil 4A'da T1 ağırlıklı bir MRI dizisinde görüldüğü gibi katlanmış bir cihazla sonuçlandı (ek olarak bkz. Şekil 4B). Hayvanda herhangi bir davranış değişikliği gözlenmedi, ancak zamanla bu, beynin implant yeri etrafında makroskopik olarak sıkıştırılması nedeniyle cihazın etrafında fibrotik bir kapsülleme ile sonuçlandı (Şekil 4C). Bu deneyimden sonra, Şekil 4D'de gösterildiği gibi, radyoopak belirteçlerin (Şekil 4D'de implant üzerinde görünen siyah çubuklar) iyi konumlandırıldığı gösterildiği intraoperatif röntgen tanıtıldı. Beynin yüzeyi, Şekil 4E'deki postoperatif MRG'de görülebileceği gibi sağlamdır. Genel olarak, bu implant ve kaide sistemi ile tüm beyin görüntüleme mümkündür. Koronal planlardaki farklı sekanslar anatomik yapıların görülmesini sağlar (Şekil 4F,G; T1 ve T2 MRG sekansları) veya implant çevresinde sıvı ve kan varlığı (Şekil 4H; TSE ağırlıklı MRG dizisi). Kaide sistemi, titanyum vidaların etrafındaki bazı küçük siyah kontrastlı boşluklar dışında neredeyse hiçbir artefakt oluşturmaz (bkz. Şekil 4G). Ek olarak, klinik elektrotlar bu çalışmada karşılaştırıcı olarak kullanılmıştır, ancak ısıtma ve güvenlik endişeleri nedeniyle MRG'de görüntülenememektedir. Bu nedenle, Şekil 4I'de gösterildiği gibi bu hayvanlarda BT taramaları elde edilir. Elektrotlar açıkça görülebilir ve kaide sistemi görüntü kalitesini etkilemez.

İmplantasyon döneminden sonra hayvan perfüze edilir ve beyin çıkarılır. Bu çalışmada, inflamatuar yanıtın analizi her hemisferde bağımsız olarak yapılmıştır. Beyni ikiye bölmek, kesit almadan önce doku hazırlığı için daha kolaydır ve bölümlerin standart mikroskopi slaytlarına monte edilebilmesi avantajına sahiptir. Bir beyin örneği örneği, bloklar halinde kesilmeden önce (Şekil 5A) ve sonra (Şekil 5B) gösterilmiştir. İmplantın ana hatları açıkça görülebilir ve beyinde küçük bir göçük oluşturmuştur. Paralel düzlemlerde kesilerek, doku daha sonra kriyostat ile hizalanır ve kesitler, düzeltme için doku kaybı olmadan kolayca kesilebilir (Şekil 5C). Boyamadan sonra, tüm doku kesiti görüntülenir (Şekil 5D), burada örneğin nöron tabakası ayrıntılı olarak açıkça görülebilir (bkz. Tüm kesitler kırılgandır ve bazen bir miktar doku kaybına yol açabilir (Şekil 5D'nin altına bakın), ancak ilgilenilen alan sağlamdır. Daha yakından bakıldığında, 40x'te konfokal mikroskopi görüntüleme ile sağlanan hücreler açıkça tanımlanır ve örneğin inflamatuar belirteçlerin hassas bir şekilde araştırılmasını sağlar (Şekil 5E). Kontrol ve implante edilmiş hemisferler arasındaki inflamasyonu karşılaştırmak için daha fazla nicelik analizi yapılabilir. Şekil 6, implante edilen elektrotların elektrokimyasal karakterizasyonunu göstermektedir. Empedans modülü ve fazı olan yumuşak elektrot dizisinin in vitro elektrokimyasal empedans spektroskopisi Şekil 6A'da gösterilmiştir ve 6 aylık implantasyon boyunca 1 kHz'de empedans modülü Şekil 6B'de gösterilmiştir.

figure-results-1
Şekil 1: Deneyin şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Yumuşak ECoG'nin beyne minimal invaziv implantasyonu . (A) Bregma endikasyonu ile kafatasına cerrahi erişim. (B) Görünür dura mater ile bilateral kraniotomi. (C) İlk yarımkürede yarık durotomi. (D) Yumuşak ECoG'nin subdural implantasyonu ve dura mater kapanması. (E) İkinci yarımkürede yarık durotomi. Titanyum köprüler kullanılarak ilk hemisferde kemik flebi fiksasyonu. (F) İkinci hemisferde yumuşak ECoG implantasyonu ve dura mater kapanması. (G) İkinci hemisferde kemik flebi fiksasyonu. (H) Ayak plakasının kafatası üzerinde konumlandırılması. (I) Ayak plakasına kaide sabitleme. (J) Kaide tabanının etrafındaki cilt kapanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İşitsel uyarılmış potansiyellerin kaydı . (A) Temporal lobun yüzeyindeki elektrot yerleşiminin şeması. (B) 800 Hz'lik bir ton patlaması stimülasyonuna (mor iz) yanıt olarak temel aktivitenin (gri izler) ve işitsel uyarılmış potansiyellerin temsili haritalanması. Her ortalama, yumuşak ECoG dizisindeki bir kanala karşılık gelir. Ortalama, ses stimülasyonundan gelen analog giriş sinyalinde tetiklenir. "AÇIK" ve "KAPALI" akustik stimülasyon periyotları sol alttaki bir kanalda belirtilmiştir. (C) Akustik uyarandan sonra tek bir kanal yanıtının zaman içindeki evrimi (0. gün, 2. ay ve 5. ay), hiçbir uyaran sunulmadığında (gri) temel sinyale kıyasla. Ortalama, ses stimülasyonundan gelen analog giriş sinyalinde tetiklenir. "AÇIK" ve "KAPALI" stimülasyon periyotları altta belirtilmiştir. "AÇIK" stimülasyonun uyarılmış potansiyeli oklarla işaretlenmiştir. (D) Temel kaydın zaman noktası başına kanal başına standart sapma (renkli noktalar). Ortanca değerler koyu mavi renkle gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Beynin ve implante elektrotların in vivo görüntülemesi . (A) Koronal planda postoperatif T1 ağırlıklı MRG. Bir ok, katlanmış bir implantı gösterir. (B) İmplantın katlanmasının beyinde bir göçük oluşturduğu A'nın büyütülmüş kısmı. (C) 1 aylık implantasyonda T1 ağırlıklı MRG, beynin C ile aynı yerde fibrotik kapsüllenmesi nedeniyle beynin sıkıştığını gösterir. (D) Radyoopak işaretleyici yerleşiminde gözlemlendiği gibi, implant yerleşimini ve katlanma olmadığını doğrulayan intraoperatif düzlem röntgeni. Ek: Radyoopak işaretleyici görünür implantın fotoğrafı. (E) Optimal implant yerleşimi ile koronal düzlemde postoperatif T1 ağırlıklı MRG. (F) 1 aylık implantasyonda T1 ağırlıklı MRG. (G) 1 aylık implantasyonda T2 ağırlıklı MRG. Bir ok, ayak plakasını kafatası üzerinde yerinde tutan titanyum vidalardan gelen görüntüleme artefaktını gösterir. (H) 1 aylık implantasyonda TSE ağırlıklı MRG. (I) Klinik elektrotlarla implante edilen hayvanın BT taraması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Uzun süreli implantasyon sonrası beynin histolojik analizi. (A) Eksplante edilmiş ve perfüze edilmiş bir beyin sol yarımküresinin fotoğrafı. (B) Perfüze beyin, dondurma adımından önce bloklar halinde kesildi. (C) Kriyostat üzerindeki tüm blok kesit kurulumunun resmi; "Önceden kesilmiş blokların" tamamı bölümlere ayrılabilir. (D) Tüm hemisferin immün boyama görüntülemesi (slayt tarayıcı, 20x objektif) ve (E) glial hücreleri, astrositleri ve nöronları gösteren korteksin ilk katmanlarını yakınlaştırma (konfokal görüntüleme, 40x objektif). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: İmplante elektrotların elektrokimyasal karakterizasyonu. (A) Empedans modülü (üstte) ve faz (altta) ile yumuşak elektrot dizisinin in vitro elektrokimyasal empedans spektroskopisi (her kanal için küçük gri çizgiler, kırmızı ortalama). (B) İmplantasyondan sonraki 6 ay boyunca 1 kHz'de empedans modülünün evrimi (ortalama mavi; gri çizgiler ayrı kanallardır; in vitro ölçüm kırmızı ile referans olarak verilmiştir). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: MRG uyumlu kaide. (A) Yumuşak elektrot dizisine erişmek için kronik MRI uyumlu transdermal bağlantı sistemi (kaide). (B) Kafatası ankrajı için ayak plakasına monte edilmiş elektrotlu kaide. Ek: Ayak plakasının detayları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Beynin optimal perfüzyonu için cerrahi erişim. (A) Deri kesimi ve karotis arter ve juguler venin konumuna erişim. (B) Kan damarlarının etrafındaki dokunun diseksiyonu. (C,D) Karotis arter ve juguler ven çevresindeki dokunun tanımlanması ve diseksiyonu. (E) Karotis arterin altındaki dokudan izolasyonu. (F) Şah damarının altındaki dokudan izolasyonu. (G) Karotis arter (sütür 1 ve sütür 2) ve juguler ven (sütür 3) etrafına dikiş teli yerleştirilmesi. (H) Damarın açılması sırasında kanamayı önlemek için karotis arterin (kalp tarafı) tabanındaki dikiş 3'ün kapatılması. (I) Karotis arterin H'den karşı tarafa klemplemesi (J) Karotis arterin kesiti. (K) J'den açıklığa takılan kateter. İçindekiler: Bir şırıngadan kateter ucuna kadar akıtılmış salinli astarlanmış kateter. (L) Kateteri yerinde ve arter boyunca tutmak için dikiş 2'nin kapatılması. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Sırasıyla T1- (sayfa 1-2), T2- (sayfa (3-4) ve TSE ağırlıklı (sayfa 5-6) MRG dizileri için parametreler. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Lekeli beyin dilimlerinin tüm slayt görüntülemesi için slayt tarayıcı meta verileri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Boyanmış beyin dilimlerinin büyütülmüş kesitinin konfokal görüntülenmesi için meta veriler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada yumuşak ECoG dizilerinin uzun süreli implantasyonu ve değerlendirilmesi için bir yöntem sunuyoruz. Bu çalışmada, temporal loblar üzerine fonksiyonel elektrot ızgaralarının bilateral implantasyonu için tutarlı, minimal invaziv bir cerrahi yaklaşım tasarladık (burada, işitsel korteksi hedef alıyor). İlk olarak, çalışmanın süresi boyunca (6 ay) uyarılmış potansiyelleri başarılı bir şekilde kaydederek ve elektrotların elektrokimyasal özelliklerini izleyerek ızgaranın işlevselliğini değerlendirdik (bkz. Şekil 6). İkinci olarak, MRG kullanarak ve tamamen MRG uyumlu bir sistem kurarak in vivo ve doku toplama ve immün boyama için bir protokol tasarlayarak postmortem olarak ızgaraların biyogüvenliğini değerlendirdik.

İnvazivliği en aza indirmek için kraniyotomi penceresinin boyutunu optimize ettik. Temporal lobda yer alan işitsel kortekse ulaşmak ve temporal kasın rezeke edilmesini önlemek için implantı dura altına kaydırma tekniği geliştirdik. Bu teknik, maruz kalan beynin yüzeyini büyük ölçüde azaltmaya ve yine de uzak hedeflere ulaşmaya izin verir. Bu tip implantasyon kör gibi görünse de, intraoperatif düzlem röntgeninde görselleştirilen cihazlara radyoopak belirteçlerin uygulanması, konumlandırmanın doğrulanmasına izin verir ve dizinin dura mater altında katlanmamasını sağlar. Subdural kaymanın, yaptığımız tekrarların çoğunda güvenli olduğu kanıtlanmıştır. Ek olarak, yarık yaklaşımındaki durotomi, kraniyotominin açık olduğu süre boyunca beyin şişkinliğini en aza indirir ve inflamatuar yanıtı saptırabilecek yapay dura mater gibi ek malzeme gerektirmeden implantın etrafındaki kapanmayı kolaylaştırır. Son olarak, bu cerrahi yaklaşımın gücü, farklı kortikal bölgelere aktarılabilmesidir. Koordinatlar, kraniyotomi pozisyonu ve tümü ayarlanabilen cihaz boyutu ile oynamak, bu yöntemin korteks alanının çoğunu hedeflemesini sağlar.

Burada sunulan cerrahi yöntem, fonksiyonel değerlendirme ve zaman içindeki biyointegrasyonun incelenmesi ile birlikte, bu raporda kullanılan yumuşak elektrot teknolojisi ile sınırlı değildir. İnsan çevirisi için geliştirilmekte olan diğer subdural elektrotlar da aynı protokol ile değerlendirilebilir. Bu yöntemin gücü, kablo ve kaide gibi parçaların çoğunun modüler, kişiselleştirilebilir ve test edilen belirli cihaza uyarlanabilmesine dayanır. Ek olarak, subdural elektrotlar yerine veya bunlarla kombinasyon halinde intrakortikal veya derin penetran problar da kullanılabilir, çünkü bu sadece kraniyotomi ve durotomi geometrisinin ayarlanmasını gerektirir. Uzun vadeli sonuçlar daha sonra burada yaptığımız gibi klinik muadilleriyle karşılaştırılabilir.

Sunulan yöntemin en büyük sınırlamalarından biri, ilk yıl boyunca gelişen minipiglerde kafatası sinüslerinin varlığıdır12. Bu bağlamda, dikkate alınması gereken önemli hususlar arasında implantasyon yaşı ve ayrıca hayvanın büyüklüğü yer alır. Yetişkin kafatasında kraniyotomi yapmak sinüslerin bütünlüğünü bozar ve kronik ortamlarda yüksek majör enfeksiyon riskine yol açar. Bu tür sinüsler ameliyat öncesi düzlem röntgen ve BT taramasında görülebilir. Öte yandan, çok küçük bir hayvanda çok erken kronik implantasyon yapmak, kafatası büyük bir büyüme ve yeniden şekillenme geçirdiğinde de optimal değildir. Ameliyat sonrası bu "kafatası hareketlerinin" implantın hareket etmesine ve katlanmasına neden olabileceğini ve bunun da deneye zarar verebileceğini varsaydık. Burada, implantasyon sırasında yaklaşık 5-6 aylık (ve 8 kg) olan Göttingen minipiglerinin en iyi sonuçları vermesi gerektiğini bulduk.

Elektrofizyolojik kayıtlar için implante edilen ECoG'nin performansını değerlendirmek için, serbestçe hareket eden hayvanlarda ve sedasyon altında kullanılabilecek işitsel uyarılmış potansiyel (AEP) kaydı için hızlı bir protokol oluşturduk. Birkaç dakika boyunca belirli frekanslarda bir dizi akustik ton patlaması sunmaktan oluşur. Böyle bir protokolün avantajı, araştırılan frekans sayısını azaltarak mevcut kayıt uzunluğuna ayarlanabilmesidir. Anestezi altında kortikal sinyalleri kaydederken karşılaşılan zorluklardan biri, verileri analiz ederken ve karşılaştırırken hayvanın bilinç düzeyinin dikkate alınması gerektiğidir.

Perfüzyon protokolü, çıkarılan beynin kalitesinin gözlemlenmesiyle zaman içinde ayarlandı. Gerçekten de, şah damarını değil, sadece karotis arteri kateterize etmeyi daha kolay bulduk. Başlangıçta, literatürde juguler venin atıkları boşaltmak için kateterize edildiği yöntemler sunulmaktadır20. Pratik olarak, bu beyinden dışarı akışı sınırlar ve kanın daha zayıf ekstraksiyonuna ve genel perfüzyon kalitesine yol açar. Şah damarını keserek ve sıvıyı hayvanın yattığı büyük bir kapta bırakmakla, perfüzyonun etkinliği artar.

Enflamasyon takibi için rutin olarak kullanılan antikorlarla çalışan sağlam bir doku hazırlama yöntemi geliştirdik. Domuzun beyninin yarısı standart mikroskop slaytlarına sığdığından ve bu nedenle histoloji laboratuvarlarında bulunan çoğu görüntüleme ekipmanıyla uyumlu olduğundan, iki yarım küreyi pratik nedenlerle ayırdık. Beyni bloklar halinde keserek, tüm beynin daha fazla kesilmesine veya dokunun geniş kısımlarının kesilmesine gerek kalmadan ilgilenilen bölgeye doğrudan erişim mümkün olur. 40 μm'deki beyin dilimleri standart kuyucuk plakalarında toplanabilir ve diğer türlerin immün boyalarından büyük protokol değişiklikleri olmadan serbest yüzen bir şekilde boyanabilir. Tam beyin immün boyama, örneğin CLARITY yöntemleri kullanılarak da öngörülebilir21.

Genel olarak, kişiselleştirilmiş implant tasarımından implantasyona, işlevsellik takibine ve biyogüvenlik değerlendirmesine kadar uzanan bu protokol sağlam ve tutarlıdır. Burada işitsel sistemi incelemek için fizibilitesini gösterdik, ancak diğer fizyolojik işlevleri test etmek için aktarılabilir. Dahası, yöntemimizin gücü, mini domuzlarla sınırlı olmaması, koyun, keçi veya insan olmayan primatlar gibi diğer türlere tamamen aktarılabilir olması gerçeğinde yatmaktadır. Bir dereceye kadar, sıçanlara da kolayca uyarlanabilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F.F. ve S.P.L., yumuşak elektrot dizileri geliştiren Neurosoft Bioelectronics SA'nın kurucu ortakları ve hissedarlarıdır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Bertarelli Vakfı ve SNSF Sinergia hibe CRSII5_183519 mali destek için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca histoloji için boyama protokolünün geliştirilmesine yardımcı olduğu için EPFL'den Katia Galan'a, Cenevre'deki Wyss Biyo ve Nöromühendislik Merkezi'nin Nöral Mikrosistemler Platformu'ndaki personele, üretim süreçlerindeki yardımları için, hayvan bakımı için Cenevre Üniversitesi'ndeki (UNIGE) Üniversite Tıp Merkezi'ndeki (CMU) hayvan platformu personeline, minipigin cerrahi yardımı ve postoperatif yönetimi (John Diaper, Xavier Belin, Fabienne Fontao ve Walid Habre), Cenevre Üniversitesi Biyomedikal Görüntüleme Merkezi (CIBM) ekip üyeleri (Julien Songeon, François Lazeyras ve Rares Salomir), Cenevre Üniversite Hastanesi (HUG) Patoloji Bölümü personeli (Sami Schranz, Francesca Versili, Ruben Soto ve Coraline Egger) ve Université Grenobles-Alpes'ten Blaise Yvert'e kronik minipig deneyleri üzerine katkıları ve fikir alışverişleri için. Yazarlar, Neurosoft Bioelectronics SA çalışanlarının, üretim sürecindeki yardımları ve minipig deneylerindeki yardımları için (Benoit Huguet ve Margaux Roulet) teşekkür eder.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kemik matkabıBBraunElan 4 ile  GA861 piyasemen
Kemik matkap ucuBBraunNeurocutter GP204R
BonewaxEthiconW31G
KateterVenisystemsAbbocath 14G
Konfokal MikroskopZeissLSM 880
KriyostatLeicaCM1950
Jel KöpükPfizerJel Köpük
Hoparlörleri yerleştirinEtymoticEtymotic ER2 ekle Kulaklık
MultimetreFlukeFluke 1700
OsiloskopTektronixMDO3014 Karışık Alanlı Osiloskop
Perfüzyon pompasıShenzenLabS3/UD15
PotansiyostatGamry InstrumentsReferans 600
Birincil Antikor Anti-GFAPThermofischerAnti-GFAP, Sıçan, # 13-0300
Birincil Antikor Anti-Iba1FujifilmAnti Iba1, Tavşan, 019-19741
Birincil Antikor Anti-NeuNSigmaAldrichAnti-NeuN, Gine-Domuz, ABN90
Nabız JeneratörüSistemleriModel 2100 İzole Nabız Stimülatörü
Kayıt başlığıÇok kanallı sistemlerW2100-HS32
Kayıt sistemiÇok kanallı sistemlerW2100
TornavidaMedtronicSap: 001201, Mil: 8001205
İkincil Antikor 488Thermofischer KeçiAnti-Sıçan IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488, # A-11006
İkincil Antikor 555ThermofischerKeçi anti-kobay IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 555, # A-21435
İkincil Antikor 647ThermofischerKeçi Anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 647, # A-21245
Slayt TarayıcıOlympusVS120
SnapfrostExciloneExcilone Snapfrost
Bıçak bıçağıİnce Bilim Araçları10316-14
Sütür teli dermalEthiconVicryl 2-0
Sütür teli dura materEthiconMersilk 5-0 
Kateter için dikiş teliEthiconVycril 3-0 iğnesiz
Dura EthiconProlene 6-0 BV-1 iğneliiçin dikiş teli
Sütür teli deri altıEthiconVicryl 4-0
Titanyum köprüMedtronicTiMesh 015-2001-4İstenilen boyutta kesin
Titanyum vidalarMedtronic9001635, 9001640
X-ray sistemiGEGE OEC 9800 Plus C-Arm
kaldırmak

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ritaccio, A. L., Brunner, P., Schalk, G. Electrical stimulation mapping of the brain: Basic principles and emerging alternatives. Journal of Clinical Neurophysiology. 35 (2), 86-97 (2018).
  2. Mullin, J. P., Sexton, D., Al-Omar, S., Bingaman, W., Gonzalez-Martinez, J. Outcomes of subdural grid electrode monitoring in the stereoelectroencephalography era. World Neurosurgery. 89, 255-258 (2016).
  3. Vansteensel, M. J., et al. Fully implanted brain-computer interface in a locked-in patient with ALS. The New England Journal of Medicine. 375 (21), 2060-2066 (2016).
  4. Lacour, S. P., Courtine, G., Guck, J. Materials and technologies for soft implantable neuroprostheses. Nature Reviews. Materilas. 1, 16063(2016).
  5. Fallegger, F., Schiavone, G., Lacour, S. P. Conformable hybrid systems for implantable bioelectronic interfaces. Advanced Materials. 32 (15), 1903904(2019).
  6. Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
  7. Swindle, M. M., Makin, A., Herron, A. J., Clubb, F. J., Frazier, K. S. Swine as models in biomedical research and toxicology testing. Veterinary Pathology. 49 (2), 344-356 (2012).
  8. Khoshnevis, M., et al. Development of induced glioblastoma by implantation of a human xenograft in Yucatan minipig as a large animal model. Journal of Neuroscience Methods. 282, 61-68 (2017).
  9. Borton, D., et al. Developing implantable neuroprosthetics: A new model in pig. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine & Biology Society. 2011, 3024-3030 (2011).
  10. Sauleau, P., Lapouble, E., Val-Laillet, D., Malbert, C. H. The pig model in brain imaging and neurosurgery. Animal. 3 (8), 1138-1151 (2009).
  11. Gierthmuehlen, M., et al. Evaluation of mECoG electrode arrays in the minipig: Experimental procedure and neurosurgical approach. Journal of Neuroscience Methods. 202 (1), 77-86 (2011).
  12. Palma, M., et al. Chronic recording of cortical activity underlying vocalization in awake minipigs. Journal of Neuroscience Methods. 366, 109427(2022).
  13. Bjarkam, C. R., Glud, A. N., Orlowski, D., Sørensen, J. C. H., Palomero-Gallagher, N. The telencephalon of the Göttingen minipig, cytoarchitecture and cortical surface anatomy. Brain Structure & Function. 222 (5), 2093-2114 (2017).
  14. Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
  15. Shepherd, R. K., Villalobos, J., Burns, O., Nayagam, D. A. X. The development of neural stimulators: A review of preclinical safety and efficacy studies. Journal of Neural Engineering. 15 (4), 041004(2018).
  16. Schiavone, G., et al. Soft, implantable bioelectronic interfaces for translational research. Advanced Matererials. 32 (17), 1906512(2020).
  17. Fallegger, F., et al. MRI-compatible and conformal electrocorticography grids for translational research. Advanced Science. 8 (9), 2003761(2021).
  18. Minev, I. R., Wenger, N., Courtine, G., Lacour, S. P. Research update: Platinum-elastomer mesocomposite as neural electrode coating. APL Materials. 3 (1), 014701(2015).
  19. Schiavone, G., et al. Guidelines to study and develop soft electrode systems for neural stimulation. Neuron. 108 (2), 238-258 (2020).
  20. Musigazi, G. U., De Vleeschauwer, S., Sciot, R., Verbeken, E., Depreitere, B. Brain perfusion fixation in male pigs using a safer closed system. Laboratory Animals. 52 (4), 413-417 (2018).
  21. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Subdural ECoG ArrayCortical RecordingMinipig ModelSoft Electrode ImplantationLong Term ImplantationAuditory Cortex RecordingElectrophysiology RecordingMRI Compatible ImplantCraniotomy ProcedureNeuroprosthesis Development

Related Articles