Bu protokolün amacı, LC3 immünofloresan ve LC3 nokta ölçümü yoluyla pankreas kanseri ve pankreas asinar hücrelerinde otofajik düzeyleri belirlemektir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
LC3 İmmünofloresan Kullanılarak İki Farklı Pankreas Hücre Modelinde Otofaji Düzeylerinin Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Otofaji, proteinler ve hasarlı organeller de dahil olmak üzere sitoplazmik bileşenleri seçici olarak bozan özel bir katabolik süreçtir. Otofaji, hücrelerin stres uyaranlarına fizyolojik olarak yanıt vermelerini ve böylece hücresel homeostazı korumalarını sağlar. Kanser hücreleri, hipoksi, besin eksikliği veya kemoterapinin neden olduğu hasar gibi olumsuz koşullara uyum sağlamak için otofaji seviyelerini modüle edebilir. Duktal pankreatik adenokarsinom en ölümcül kanser türlerinden biridir. Pankreas kanseri hücreleri, otofaji proteinlerinin transkripsiyonel upregülasyonu ve post-translasyonel aktivasyonu nedeniyle yüksek otofaji aktivitesine sahiptir.
Burada, PANC-1 hücre hattı pankreas insan kanseri hücrelerinin bir modeli olarak kullanıldı ve AR42J pankreas asinar hücre hattı, oldukça farklılaşmış memeli hücrelerinin fizyolojik bir modeli olarak kullanıldı. Bu çalışmada, otofaji aktivasyonunun durumunun bir göstergesi olarak mikrotübül ile ilişkili protein hafif zincir 3'ün (LC3) immünofloresansı kullanılmıştır. LC3, bazal koşullarda, sitoplazmada yaygın bir dağılım paterni gösteren bir otofaji proteinidir (bu durumda LC3-I olarak bilinir). Otofaji indüksiyonu, LC3'ün yeni oluşan otofagozomların yüzeyindeki fosfatidiletanolamine konjugasyonunu tetikler ve otofagozomların oluşumuna ve genişlemesine yardımcı olan zara bağlı bir protein olan LC3-II'yi oluşturur. Etiketli otofajik yapıların sayısını ölçmek için, açık kaynaklı yazılım FIJI, "3D Nesneler Sayacı" aracının yardımıyla kullanıldı.
Hem fizyolojik koşullarda hem de kanser hücrelerinde otofajik seviyelerin ölçülmesi, hipoksi, kemoterapi tedavisi veya belirli proteinlerin yıkılması gibi çeşitli koşullar altında otofajinin modülasyonunu incelememizi sağlar.
Giriş
Makrootofaji (genellikle otofaji olarak adlandırılır), proteinler ve hasarlı organeller 1,2 dahil olmak üzere sitoplazmik bileşenleri seçici olarak parçalayan özel bir katabolik süreçtir. Otofaji, hücrelerin stres uyaranlarına fizyolojik olarak yanıt vermelerini ve böylece hücresel homeostazı korumalarını sağlar3. Otofaji sırasında, çift zarlı bir vezikül oluşur: otofagozom. Otofagozom kargo moleküllerini içerir ve onları bozunma için lizozoma götürür 1,4.
Otofagozomlar, otofajik protein mikrotübül il....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre hazırlığı
- 12 mm'lik yuvarlak kapakları mutlak etanol içine batırın ve dikey olarak 24 delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin.
- Kapağı çıkarın ve çok kuyucuklu plakayı 15 dakika boyunca ultraviyole radyasyona maruz bırakın.
- Kapakları yatay olarak konumlandırın ve Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile yıkayın.
- Pankreas hücrelerinin düşük geçiş sayısını tohumlayın. Miktar, fiksasyon gününde% 50 -% 75 akıcılık elde etmek için ayarlanmalıdır16.
NOT: 3 gün sonra hücreleri sabitlemek için kuyucuk başına 2,5 × 10 4 PANC-1 veya4 × 104 AR42J hücresi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, farklı koşullarda otofaji seviyelerini belirlemek için pankreas hücre hatlarında LC3'ün immünofloresansını gerçekleştirir. Bu deneyin sonucu, LC3 ve DAPI'ye karşılık gelen kırmızı ve mavi kanallardan hücresel görüntülerin gizlenmesiydi. LC3 görüntüleri bu proteinin hücresel dağılımını gösterirken, DAPI nükleer lokalizasyonu gösterir. Şekil 2A , LC3'ün immünofloresansının temsili bir görüntüsünü ve bazal veya gemsitabin tedavi koşulları altında PANC-1 hücrelerinde DAPI boyaması i.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolde açıklanan yöntem, hücredeki endojen LC3 dağılımının görselleştirilmesine ve farklı koşullar altında otofajik seviyelerin ölçülmesine izin verir. LC3 dağılımını analiz etmek ve otofaji aktivasyonunu belirlemek için kullanılan bir başka benzer yöntem, floresan etiketli LC3 transfeksiyonunu (RFP-LC3 gibi) içerir19. RFP-LC3 transfeksiyonu, fiksasyona ihtiyaç duymama (bu yöntemin canlı hücre görüntüleme20'de uygulanmasına izin verir), daha ucuz olma ve LC3 antikor .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hiçbir çıkar çatışması ilan edilmedi.
Teşekkürler
Bu çalışma, Buenos Aires Üniversitesi (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), Ulusal Bilimsel Araştırma ve Teknoloji Konseyi (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; ve PUE 22920170100033) ve Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Tanıtım Ajansı (PICT 2019-01664) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) | Corning | 46-013-CM | |
| 12 mm yuvarlak lameller | HDA | CBR_OBJ_6467 | |
| 24 Kuyu Hücre Kültürü Plakası | Sorfa | 220300 | |
| Mutlak etanol | Biopack | 2207.10.00 | |
| Alexa Fluor 594 Eşek anti-tavşan IgG (H + L) | Invitrogen | R37119 | |
| Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu | Zeiss | LSM 800 | |
| Deksametazon | Sigma Aldrich | D4902 | |
| DMEN | Sartorius | 01-052-1A | |
| Fetal Sığır Serumu | NATOCOR | Lintc-634 | |
| Gemcitabina | Eli Lilly | VL7502 | |
| LC3B (D11) XP Tavşan mAb | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | 3868S | |
| Metanol | Anedra | 6197 | |
| Parafilm "M" (Laboratuvar Sızdırmazlık Filmi) | Bemis/Curwood | PM-996 | |
| Kalem-Strep Çözeltisi | Sartorius | 03-031-1B | |
| PP242 | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-301606 | |
| Tripsin EDTA | Gibco | 11570626 |
Kaynaklar
- Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).
- Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
