Yöntem makalesi

Saplama1 aracılı peksofajinin izlenmesi

DOI:

10.3791/65010

⸱

12 Mayıs 2023

 , 
1Institute of Biological Chemistry, Academia Sinica, 2Institute of Biochemical Sciences, College of Life Sciences, National Taiwan University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, canlı hücrelerde Stub1 aracılı peksofajiyi tetiklemek ve izlemek için talimatlar sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücreleri, Stub1 aracılı peksofaji yoluyla peroksizomları çevirebilir. Yol potansiyel olarak peroksizomların miktarının ve kalitesinin hücresel kontrolüne izin verir. Bu işlem sırasında, ısı şoku proteini 70 ve ubikitin E3 ligaz, Stub1, peksofajiyi başlatmak için döndürülecek peroksizomlar üzerine translokasyona sahiptir. Stub1 ligaz aktivitesi, ubikitin ve diğer otofaji ile ilgili modüllerin hedeflenen peroksizomlarda birikmesine izin verir. Peroksizomal lümen içindeki reaktif oksijen türleri (ROS) seviyelerinin yükselmesi, Stub1 aracılı peksofajiyi aktive edebilir. Bu nedenle, bu yolu tetiklemek ve izlemek için boya destekli ROS üretimi kullanılabilir. Bu makalede, memeli hücre kültürlerinde peksofajiyi başlatmak için iki sınıf boya, floresan proteinleri ve sentetik floroforlar kullanma prosedürleri özetlenmektedir. Bu boya destekli ROS üretim tabanlı protokoller, yalnızca küresel olarak bir hücre popülasyonundaki tüm peroksizomları hedeflemek için kullanılamaz, aynı zamanda tek hücreler içindeki bireysel peroksizomların manipülasyonuna da izin verebilir. Ayrıca Stub1 aracılı peksofajinin canlı hücre mikroskobu kullanılarak nasıl takip edilebileceğini de açıklıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peroksizomlar, çoğu ökaryotik hücrede bulunan tek zara bağlı organellerdir. Peroksizomlar, çok uzun zincirli yağ asitlerinin, pürin katabolizmasının ve eter fosfolipid ve safra asidi sentezinin beta-oksidasyonunu gerçekleştirmek için gerekli metabolik bir bölmedir1. Peroksizom türevi asetil-CoA, metabolizmadaki merkezi sinyalizasyonu düzenleyerek lipid homeostazını kontrol eder2. Bu nedenle, tehlikeye giren peroksizomal fonksiyonların nörodejeneratif bozukluklar, yaşlanma, kanserler, obezite ve diyabet dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda ima edilmesi şaşırtıcı değildir 3,4,5. Peroksizomal operasyonun sürdürülmesinde önemli bir süreç peksofajidir. Pekzofaji, peroksizomların otofaji ile seçici devri için katabolik bir süreçtir. Hücreler, peroksizomların miktarını ve kalitesini kontrol etmeye yardımcı olmak için peksofaji kullanır, böylece uygun peroksizomal fonksiyonu sağlar. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, PEX1 peroksizomal biyogenez faktörleri 1 ve 6'daki mutasyonların neden olduğu peroksizom kaybının kontrolsüz peksofaji6'dan kaynaklandığını göstermiştir. Özellikle, tüm peroksizom biyogenez bozukluğu (PBD) hastalarının% 65'i, memeli hücrelerinde PEX1, PEX6 ve PEX26'dan oluşan peroksizomal AAA ATPaz kompleksinde eksiklikler barındırmaktadır7.

Pekzofajiyi başlatmak ve incelemek için bir dizi yöntem kullanılabilir. Mayada, sağlanan besinler peroksizoma bağımlı karbon kaynaklarından peroksizomdan bağımsız karbon kaynaklarına (hücresel peroksizom sayılarını düşürmek için) geçtiğinde peksofaji tetiklenir8. Örneğin, metanol tarafından yetiştirilen Pichia pastoris hücrelerinin metanol ortamından glikoz ortamına ve etanol ortamına transferi, sırasıyla 8,9,10 mikropeksofaji ve makropeksofajiyi indükler. Mikropeksofaji sekestörleri, vakuolün fincan benzeri vakuolar sekestrasyon membranları ve mikropekzofajiye özgü membran aparatı (MIPA) olarak adlandırılan kapak benzeri bir yapı oluşturacak şekilde yeniden şekillendirilerek peroksizomları bozunma için kümeledi. Makropeksofajide, bireysel peroksizomlar, peksofagozomlar olarak bilinen çift zarlı yapılar tarafından yutulur, ardından yıkım için vakuol ile füzyon 8,9,10 yapılır. Saccharomyces cerevisiae'deki Atg36p ve Pichia pastoris'teki Atg30p gibi peksofaji reseptörlerinin fosforilasyonu, reseptörlerin çekirdek otofaji makinelerini işe almaları ve otofagozomlara peroksizomal hedeflemeyi kolaylaştırmaları için kritik öneme sahiptir 8,11.

Memeli hücrelerinde, peksofaji ubikitinasyon ile indüklenebilir. Peroksizomal membran proteinleri PMP34 veya PEX3'ün sitozolik tarafta ubikitin ile etiketlenmesi peksofaji12'yi indükler. PEX3'ün aşırı ekspresyonu, lizozomlar13 tarafından peroksizom ubikitinasyonunu ve peroksizom eliminasyonunu indükler. Ek olarak, PEX5'in bir C-terminali EGFP ile füzyonu, monoubikitinlenmiş PEX5'in ihracatını bozar ve peksofaji14 ile sonuçlanır. Öte yandan, peksofajiH2O2tedavisi ile de tetiklenebilir. Peroksizomlar reaktif oksijen türleri (ROS) üretir; Spesifik olarak, çok uzun zincirli yağ asitlerinin (> 22 karbon) beta-oksidasyonunun ilk adımını katalize eden peroksizomal enzim Acox1, sadece asetil-CoA değil, aynı zamanda peroksizomal ROS da üretir. H2O2tedavisi altında artan ROS seviyelerine yanıtolarak, memeli hücreleri ROS üretimini azaltmak ve stresi hafifletmek için peksofajiyi aktive eder. H2O2tedavisinin ataksi-telanjiektazi mutasyona uğramış (ATM) peroksizomlara alımını yönlendirdiği bildirilmiştir. ATM daha sonra peksofaji15 ile peroksizomal ciroyu teşvik etmek için PEX5'i fosforile eder.

Peroksizomlar ROS üreten merkezler olduğundan, ROS hasarına da eğilimlidirler. ROS kaynaklı peroksizomal yaralanmalar, peroksizom kalite kontrol yollarını başlatmak için hücreleri peksofajiyi aktive etmeye zorlar (hasarlı peroksizomun otofaji ile uzaklaştırılması). Burada, ROS kaynaklı peroksizomal hasarın talep üzerine tetiklenmesi için bir yaklaşım özetliyoruz. Protokol, 16,17,18,19,20 organelleri içinde ışıkla aktive edilen ROS üretiminden yararlanır (Şekil 1). Boya etiketli peroksizomlar aydınlatılır ve peroksizomal lümen içinde ROS üretimine yol açar, bu da özellikle peroksizomal hasarı tetikler. Bu protokolü kullanarak, ROS stresli peroksizomların ubikitine bağımlı bir bozunma yolu ile uzaklaştırıldığı gösterilmiştir. ROS stresli peroksizomlar, ubikitin E3 ligaz Stub1'i, peksofaji16 ile bireysel olarak uzaklaştırılmak üzere otofagozomlara yutulmalarına izin vermek için işe alırlar. Bu protokol, aynı hücre içindeki yaralı ve sağlıklı peroksizomların kaderini hızlandırılmış mikroskopi ile karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda bir kültür kabındaki tüm peroksizomlara (tüm hücrelerde) küresel olarak zarar vermek için de kullanılabilir ve bu da peksofaji yolunun biyokimyasal analizine izin verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Peroksizom lümeninde diKillerRed veya kendi kendini etiketleyen proteinleri (SLP'ler) eksprese eden hücrelerin hazırlanması

  1. İstenilen hücreleri cam tabanlı hücre kültürü tabaklarına tohumlayın. Buradaki deney için, 840 μL kültür ortamında (DMEM / F-12% 10 fetal sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş) 2 x 105 insan SHSY5Y hücresini veya 840 μL kültür ortamında (DMEM% 10 sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş) 20 mm çapında bir cam mikro kuyuya sahip 35 mm'lik bir kültür kabında tohumlayın.
    NOT: Tohumlanan hücre sayısı, diğer spesifikasyonlardaki cam tabanlı tabaklar kullanılırken cam mikro kuyu alanına göre orantılı olarak ayarlanmalıdır.
  2. Hücreleri 24 saat boyunca% 5 CO2/37 ° C'nin altında büyütün.
  3. Bir transfeksiyon reaktifi kullanarak hücreleri istenen plazmidlerle transfekte edin.
    1. Canlı hücrelerdeki peroksizomları etiketlemek için PMP34-TagBFP kullanın. Peroksizom lümeninde ROS üretimi için peroksizom hedefli diKillerRed-VKSKL veya SLP-VKSKL (+ boya etiketli SLP ligandları) kullanın (ışıkla aktive edilen ROS üretimi yoluyla). Bu protokolde, kendi kendini etiketleyen protein HaloTag-VKSKL21'i kullanıyoruz. Sırasıyla Stub1 / Hsp70'in translokasyonunu, ubikitinlenmiş proteinlerin birikimini ve ROS stresli peroksizomlar, transfektif EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-Ub veya EGFP-LC3B üzerinde otofagozomların oluşumunu izlemek için. Peroksizomal lümende ROS üretimini kontrol etmek için, peroksizom lokalize floresan redoks probu roGFP2-VKSKL22 ile birlikte transfekt diKillerRed-VKSKL.
    2. SHSY5Y hücre transfeksiyonu için, plazmidleri 55 μL serumsuz DMEM / F-12 içinde seyreltin ve 55 μL serumsuz DMEM / F12 içinde 1 μL transfeksiyon reaktifini seyreltin. Seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş reaktif ile birleştirin. Yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
    3. Kompleksi, daha önce antibiyotiksiz SHSY5Y için 100 μL kültür ortamı ile kaplanmış 20 mm'lik mikro kuyucuğa ekleyin (% 10 fetal sığır serumu ile DMEM / F-12). Tabağı yavaşça ileri geri sallayın.
    4. NIH3T3 hücre transfeksiyonu için, plazmidleri ve transfeksiyon reaktifini seyreltmek için serumsuz DMEM / F-12 yerine azaltılmış serum ortamını kullanın. Kaplama kültür ortamını SHSY5Y ile antibiyotiksiz NIH3T3 hücreleri için kültür ortamı ile değiştirin (% 10 sığır serumu ile DMEM).
  4. 2 saatlik transfeksiyondan sonra, transfeksiyon reaktifi içeren ortamı çıkarın ve 1 mL taze kültür ortamı ekleyin. NIH3T3 veya SHSY5Y hücrelerini 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat boyunca inkübe edin.
    NOT: Diğer hücre hatları da Stub1 aracılı peksofajiyi (örneğin, HeLa hücreleri) incelemek için kullanılabilir.

2. Peroksizomların boya etiketli SLP ligandlarla boyanması (ışıkla aktive edilen ROS üretimi için)

  1. Transfeksiyondan 24 saat sonra, kültür ortamını çıkarın ve 20 mm'lik cam mikro kuyucuğa 100 μL 200 nM HaloTag TMR ligand veya 200 nM Janelia Fluor 646 HaloTag ligand ekleyin.
    NOT: Boya etiketli SLP ligandları, her hücre hattı için ilgili kültür ortamı ile seyreltilmelidir. Janelia Fluor 646 etiketli ligandların seçilmesi, aşağı akış floresan görüntüleme için mavi, yeşil ve kırmızı kanalları serbest bırakacaktır.
  2. Çanağı 37 ° C,% 5 CO2 inkübatöre aktarın. 1 saat boyunca lekeleyin. 1 saat sonra, boyama ortamını iyice çıkarın ve 1 mL taze kültür ortamı ekleyin.

3. Lazer taramalı konfokal mikroskopta peroksizomların ROS gerilmesi

  1. İstenilen hücreleri içeren cam tabanlı bir çanağı, bir sahne üstü inkübatör ile donatılmış lazer taramalı bir konfokal mikroskop üzerine yerleştirin.
  2. Araç Penceresi'ne tıklayın, Oküler'i seçin ve iletilen ışığı açmak için DIA düğmesine tıklayın (Şekil 2A). Çanağı mikroskop göz merceğinden görüntüleyin ve odak düğmesini çevirerek hücreleri odak noktasına getirin.
  3. LSM'yi seçin ve Boya ve Dedektör Seç düğmesine tıklayın (Şekil 2B). Hücreleri görüntülemek için uygun lazer ve filtre ayarlarını seçmek üzere açılır pencerede istediğiniz boyalara çift tıklayın (Şekil 2C). Hücrelerin floresan sinyallerini taramaya başlamak üzere hızlı lazer taramayı başlatmak için Canlı panelde Livex4'e tıklayın (Şekil 2D).
  4. Joystick denetleyicisini kullanarak sahneyi hareket ettirin ve ROS stresi (peroksizomlar üzerinde) uygulamak için orta diKillerRed-VKSKL veya SLP-VKSKL eksprese eden hücreleri bulun. İstediğiniz hücrenin görüntüsünü alın.
  5. Araç Penceresi'ne tıklayın ve LSM Stimülasyonu'nu seçin (Şekil 2E). Elips düğmesine tıklayın ve canlı görüntü penceresinde, ROS geriliminin uygulanacağı adım 3.4'te elde edilen istenen peroksizomları içeren 15 μm çapında dairesel bir ROI çizmek için fareyi kullanın (Şekil 2F) (örnek için Şekil 3'e bakın).
  6. ROS stresi uygulamak için, diKillerRed-PTS1 veya TMR etiketli SLP ligandına sahip hücreler için 561 nm ve Janelia Fluor 646 etiketli SLP ligandı ile boyanmış hücreler için 640 nm kullanın.
  7. ROS gerilimini uygulamak için lazer dalga boyunu seçin. İstediğiniz lazer yüzdesini ve süresini girin (Şekil 2G).
  8. Al'a tıklayın ve her biri 30 sn boyunca ROI'ler boyunca 561/640 nm ışıkla taramayı başlatmak için Stimülasyon düğmesine tıklayın (Şekil 2H). Bu, burada kullanılan konfokal mikroskopta hem 561 nm hem de 640 nm için ~% 5'lik bir lazer gücü ayarına karşılık gelir. Bu işlem peroksizomlarda ROS üretimine yol açacaktır.
    NOT: Farklı boyutlarda yatırım getirileri seçilebilir. Her bir yatırım getirisi için aydınlatma süresi, alanına göre orantılı olarak ayarlanmalıdır.
  9. 30 sn lazer aydınlatmadan sonra, ROI'lerdeki peroksizomlar diKillerRed-PTS1 / TMR / Janelia Fluor 646 sinyallerini kaybetmiş olacaklardır. Bu sinyal kaybı, aydınlatılanları bir hücre içindeki aydınlatılmamış peroksizomlardan (hasarlı ve sağlıklı) ayırt etmeyi sağlar.

4. Canlı hücrelerde peksofajinin hızlandırılmış görüntüleme ile izlenmesi

  1. EGFP etiketli Stub1, Hsp70, Ub, p62 veya LC3B'nin, çerçeveler arasında 10 dakikalık aralıklarla hızlandırılmış görüntüleme ile aydınlatılmış/ROS stresli peroksizomlara translokasyonunu izleyin (örneğin, bkz. Şekil 3-7).
    NOT: EGFP-Stub1 veya EGFP-Hsp70 sinyalleri aydınlatmadan 10-20 dakika sonra görünmeye başlar ve ~ 40 dakika sonra aydınlatmaya kadar tüm hasarlı peroksizomlarda kalır. EGFP-Ub sinyalleri aydınlatmadan 30 dakika sonra görünür ve 2-3 saat sürer. EGFP-p62 translokasyonu aydınlatmadan 60 dakika sonra görünür ve EGFP-LC3B sinyalleri aydınlatmadan ~ 3 saat sonra görünür hale gelir.
  2. ImageJ kullanarak hasarlı peroksizomlardaki (Stub1, Ub, p62 veya LC3B'den) EGFP sinyallerini sayısallaştırın. Üç kanallı bir görüntüyü (PMP34-TagBFP/EGFP-LC3B/HaloTag-VKSKL) ölçmek üzere ImageJ'yi kullanmak için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
    1. Görüntüyü açın ve tüm aydınlatılmış peroksizomları (PMP34-TagBFP sinyali pozitif ve HaloTag ligand sinyali ağartılmış; Şekil 8A).
    2. PMP34-TagBFP kanalını seçmek için Çoğalt'a tıklayın (Şekil 8A). Peroksizomları işaretlemek için Resim >> Eşiği Ayarla açılır menüsünü kullanarak bir eşik ayarlayın (Şekil 8B).
    3. Işıklı peroksizomların tam bölgelerini belirlemek için Analiz Et > Parçacıkları Analiz Et'i seçin. ImageJ, bu ilgi alanlarını (ROI) ROI yöneticisine kaydeder (Şekil 8C).
    4. EGFP konjuge Ub, p62 veya LC3B'den gelen floresan sinyalini analiz etmek üzere EGFP kanalını seçmek için Çoğalt'a tıklayın (Şekil 8D). YG Yöneticisi'nde tüm YG'leri seçin (Şekil 8E).
    5. Peroksizomlar üzerindeki EGFP sinyallerini ölçmek için ROI Manager'da Measure uygulayın (Şekil 8E). Sonuçlar tablosunda her YG için alanın değerini ve entegre yoğunluğu (tüm piksel yoğunluklarının toplamı) bulun (Şekil 8E).
    6. Aydınlatmadan sonra farklı zaman noktalarında ortalama EGFP floresan yoğunluklarını elde etmek için, entegre EGFP yoğunluğunu aydınlatılmış peroksizomların toplam alanına bölün (PMP34-TagBFP sinyali pozitif ve HaloTag ligand sinyali negatif alanları). Peroksizomlar üzerinde biriken sinyali elde etmek için, bir zaman noktasındaki ortalama yoğunluğu = 0 zamanındaki ortalama yoğunluktan çıkarın ve ardından = 0 zamanındaki ortalama yoğunlukla normalleştirin.

5. Bir kültür kabındaki tüm peroksizomlara (her hücrede) küresel olarak zarar vermek

  1. Adım 1'i (peroksizom hedefli diKillerRed [diKillerRed-VKSKL] veya SLP [SLP-VKSKL] eksprese eden hücrelerin hazırlanması) ve adım 2'yi (SLP ligandı ile peroksizomların boyanması [ışıkla aktive edilen ROS üretimi için]) gerçekleştirin.
  2. 1 saatlik TMR etiketli ligand boyamasından sonra, boyama ortamını çıkarın ve 30 mM 3-AT (3-amino-1,2,4-triazol; bir katalaz inhibitörü) içeren 1 mL kültür ortamı ekleyin.
    NOT: Katalaz, peroksizom lümeninde eksprese edilen bir ROS temizleyicidir, bu nedenle 3-AT tedavisi, peroksizomlar üzerindeki ışığa bağlı oksidatif hasarı arttırmaya yardımcı olur.
  3. Kültür kabını bir LED'in (555-570 nm) üzerine yerleştirin. Tüm hücreleri bir inkübatörde 9 saat boyunca 1,8 W /cm2 güç yoğunluğuyla aydınlatın.
    NOT: Bu adımı bir inkübatörün dışında gerçekleştirmek için, kültür kabını 37°C'lik bir ısıtma plakasına yerleştirin. 3-AT içeren ortama 20 mM HEPES ekleyin ve gaz değişimini en aza indirmek için kültür kabını şeffaf bir filmle örtün. HEPES, LED aydınlatma sırasında CO2 inkübatörü dışındaki hücre kültüründe fizyolojik pH'ı koruyan bir tamponlama ajanıdır.
  4. Peroksizomlardaki EGFP-Ub, EGFP-p62 veya EGFP-LC3B sinyallerini görüntüleyerek LED kaynaklı hasarın başarısını doğrulayın. Yukarıda özetlenen aydınlatma koşulunu kullanarak, HaloTag-VKSKL'yi kararlı bir şekilde ifade eden SHSY5Y hücrelerinin% 82'si Stub1 aracılı peksofaji gösterdi.
  5. Aşağı akış biyokimyasal analizi için hücreleri toplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada gösterilen Stub1 aracılı peksofaji indüksiyon şeması, peroksizom lümen içindeki boya destekli ROS üretiminden yararlanır. Bu işlem minimum ışık yoğunluğu gerektirir. Bu nedenle, floresan proteinler veya boyalar içeren peroksizomlar, standart lazer taramalı konfokal mikroskoplar kullanılarak aydınlatılabilir. Fokal aydınlatma, floresan muhabir roGFP2-VKSKL tarafından belirtildiği gibi, bireysel peroksizomlar içinde anlık ve lokalize ROS üretimine yol açar (Şekil 9). Görüntüleme sırasın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, peroksizomal ROS seviyelerini ışıkla yükselterek hücre kültürlerinde Stub1 aracılı peksofajinin nasıl tetikleneceğini ayrıntılarıyla açıklar. Protokol boya destekli ROS üretimine dayandığından, ilgili hücreler içinde diKillerRed-VKSKL veya boya etiketli SLP ligand boyamasının yeterli ekspresyonunun sağlanması gerekir. Farklı hücre tiplerinin veya farklı genetik geçmişlere sahip hücrelerin biraz farklı özelliklere sahip peroksizomları barındırabileceği göz önüne alındığında, peksofajinin indüksiyonunu sağlama...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen Tayvan'daki Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'nden MOST 111-2311-B-001-019-MY3 araştırma hibesi ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
20 mm çapında cam mikrokuyulu 35 mm kültür kabı MatTekP35G-1.5-20-C20 mm cam tabanlı
3-amino-1,2,4-triazol (3-AT)Sigma AldrichA8056
sığır serumuThermoFisher Scientific16170060
Hücre kültürü inkübatörüNuaireNU-4750
diKillerRed-PTS1Academia SinicaKillerRed tandem dimer ile PTS1(VKSKL) eklenerek yapılmıştır
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (DMEM)ThermoFisher Scientific11965092
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı/Besin Karışımı F-12 (DMEM/F-12)ThermoFisher Scientific11330032
EGFP-C1ClontechpEGFP-C1EGFP-C1'in omurgası, EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62, EGFP-Hsp70
Academia Sinica'yıklonlamak için kullanıldı.Hsp70 geni (HSPA1A) HeLa cDNA'dan amplifiye edilmiş ve EGFP-C1'e klonlanmış
EGFP-LC3BAddgene11546
EGFP-p62Academia Sinicainsan SQSTM1 geninin (HeLa hücresi cDNA'sının PCR amplifikasyonu yoluyla) EGFP-C1'e eklenmesiyle oluşturulan EGFP-Stub1
Academia Sinica'yaStub1 geninin (toplam fare böbrek cDNA'sının PCR amplifikasyonu yoluyla) eklenmesiyle oluşturulan EGFP-C1
EGFP-UbAddgene11928
fetal sığır serumuThermoFisher Scientific10437028
HaloTag TMR ligandı PromegaG8252
HaloTag-PTS1Academia SinicaPTS1, EGFP-C1 omurgasına eklenmiş ve klonlanmıştır
HEPESThermoFisher Scientific15630080
Ters Konfokal Mikroskop OlympusFV3000RS405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  TOKAI HIT hazneli inkübatör ve UNIV2-D35 çanak ataşmanı ile mikroskop
Janelia Fluor 646 HaloTag LigandPromegaGA1120
LEDVitaStarPAR6480 W, 555-570 nm
lipofektamin 2000 ThermoFisher Scientific11668transfeksiyon reaktifi
NIH3T3 hücresiATCCCRL-1658yapışık
Opti-MEMThermoFisher Scientific319850azaltılmış serum ortamı
penisilin/streptomisinThermoFisher Scientific15140
PMP34-TagBFPAcademia SinicaPMP34 PCR, HeLa cDNA'dan amplifiye edildi ve klonlandı intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1Academia Sinica, eroGFP'nin (Addgene plazmidi 20131'den alınmıştır) amino asit dizisi VKSKL ile eklenmesiyle oluşturulur ve EGFP-C1
SHSY5Y hücresineATCCCRL-2266yapışık
, , fare klonlanır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wanders, R. J., Waterham, H. R., Ferdinandusse, S. Metabolic interplay between peroxisomes and other subcellular organelles including mitochondria and the endoplasmic reticulum. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 83(2016).
  2. He, A., et al. Acetyl-CoA derived from hepatic peroxisomal β-oxidation inhibits autophagy and promotes steatosis via mTORC1 activation. Molecular Cell. 79 (1), 30.e4-42.e4 (2020).
  3. Cipolla, C. M., Lodhi, I. J. Peroxisomal dysfunction in age-related diseases. Trends in Endocrinology & Metabolism. 28 (4), 297-308 (2017).
  4. Fransen, M., Nordgren, M., Wang, B., Apanasets, O., Veldhoven, P. P. V. Aging, age-related diseases and peroxisomes. Peroxisomes and their Key Role in Cellular Signaling and Metabolism. 69, Springer. Dordrecht, the Netherlands. 45-65 (2013).
  5. Puri, P., et al. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 50 (6), 1827-1838 (2009).
  6. Law, K. B., et al. The peroxisomal AAA ATPase complex prevents pexophagy and development of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 868-884 (2017).
  7. Nazarko, T. Y. Pexophagy is responsible for 65% of cases of peroxisome biogenesis disorders. Autophagy. 13 (5), 991-994 (2017).
  8. Eberhart, T., Kovacs, W. J. Pexophagy in yeast and mammals: An update on mysteries. Histochemistry and Cell Biology. 150 (5), 473-488 (2018).
  9. Manjithaya, R., Nazarko, T. Y., Farré, J. -C., Subramani, S. Molecular mechanism and physiological role of pexophagy. FEBS Letters. 584 (7), 1367-1373 (2010).
  10. Till, A., Lakhani, R., Burnett, S. F., Subramani, S. Pexophagy: The selective degradation of peroxisomes. International Journal of Cell Biology. 2012, 512721(2012).
  11. Germain, K., Kim, P. K. Pexophagy: A model for selective autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (2), 578(2020).
  12. Kim, P. K., Hailey, D. W., Mullen, R. T., Lippincott-Schwartz, J. Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20567-20574 (2008).
  13. Yamashita, S., Abe, K., Tatemichi, Y., Fujiki, Y. The membrane peroxin PEX3 induces peroxisome-ubiquitination-linked pexophagy. Autophagy. 10 (9), 1549-1564 (2014).
  14. Nordgren, M., et al. Export-deficient monoubiquitinated PEX5 triggers peroxisome removal in SV40 large T antigen-transformed mouse embryonic fibroblasts. Autophagy. 11 (8), 1326-1340 (2015).
  15. Zhang, J., et al. ATM functions at the peroxisome to induce pexophagy in response to ROS. Nature Cell Biology. 17 (10), 1259-1269 (2015).
  16. Chen, B. -H., Chang, Y. -J., Lin, S., Yang, W. Y. Hsc70/Stub1 promotes the removal of individual oxidatively stressed peroxisomes. Nature Communications. 11 (1), 5267(2020).
  17. Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111(2013).
  18. Mageswaran, S. K., Yang, W. Y., Chakrabarty, Y., Oikonomou, C. M., Jensen, G. J. A cryo-electron tomography workflow reveals protrusion-mediated shedding on injured plasma membrane. Science Advances. 7 (13), eabc6345(2021).
  19. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
  20. Yang, J. Y., Yang, W. Y. Bit-by-bit autophagic removal of parkin-labelled mitochondria. Nature Communications. 4, 2428(2013).
  21. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  22. Lismont, C., Walton, P. A., Fransen, M. Quantitative monitoring of subcellular redox dynamics in living mammalian cells using RoGFP2-based probes. Methods in Molecular Biology. 1595, 151-164 (2017).
  23. Nordgren, M., et al. Potential limitations in the use of KillerRed for fluorescence microscopy. Journal of Microscopy. 245 (3), 229-235 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Stub1 Mediated PexophagyPeroxisome TurnoverReactive Oxygen SpeciesDye Assisted ROS GenerationUbiquitin E3 LigaseLive Cell MicroscopyFluorescent ProteinsSynthetic FluorophoresAutophagy AdaptersConfocal Microscopy

İlgili makaleler