$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvanlar, düzinelerce farklı doku ve organ halinde organize edilmiş yüzlerce farklı hücre tipinden oluşan oldukça karmaşık sistemlerdir. Embriyonik gelişim sırasında hücre gruplarının birbirleriyle ve çevreleriyle nasıl etkileşime girdiğini incelemek, bize yalnızca yetişkin bedenlerinin nasıl inşa edildiğini daha iyi anlamamızı sağlamakla kalmaz, aynı zamanda hastalıkların ve doğum kusurlarının moleküler ve hücresel temellerini de ortaya çıkarabilir. Bazı model sistemler, belirli biyolojik soruları ele almak için diğerlerinden daha uygundur ve bilim adamları, organizma biyolojisinin tüm çeşitliliğini araştırmak için çok çeşitli türler ve deneysel teknikler kullanır. Örneğin, belirli bir gelişimsel biyoloji deneyi, genetik mühendisliği, hayvan diseksiyonları, moleküler biyoloji, biyokimya ve yüksek çözünürlüklü mikroskopiyi içerebilir. Bu tür yöntemlerin yalnızca yazılı açıklamalara ve şekillere dayalı olarak çoğaltılması zor olabilir ve bu nedenle, uygun teknik ve analiz yöntemlerinin yayılmasını teşvik etmek için bunları video biçiminde belgelemek önemlidir.
Özellikle sinir sistemindeki gelişim mekanizmaları ile yenilenme arasındaki ilişki yoğun ilgi gören bir alandır ve zebra balığı Danio rerio, yaşam boyu büyümesi ve yenilenme yetenekleri nedeniyle bu alanda önemli bir model haline gelmiştir. Özellikle, retinadaki hücreler ile optik tektum arasında karmaşık bir etkileşim vardır ve bu etkileşim, gözlere ve beyne yeni nöronlar eklendikçe uygun bağlantıların kurulması için gereklidir1. Hagen ve ark. canlı zebra balığı embriyolarında gözün alınmasını takiben nöral büyüme ve gelişmenin denervasyondan nasıl etkilendiğini karakterize etmek için bir teknik tanımlayın2. 1) göz çıkarma ameliyatının nasıl gerçekleştirileceğini, 2) ameliyattan sonra larvaların nasıl kültürleneceğini, 3) beyin örneklerinin nasıl sabitleneceğini, parçalara ayrılacağını ve saklanacağını, 4) immünofloresan gerçekleştirileceğini ve 5) örneklerin uygun şekilde monte edilip görüntüleneceğini ayrıntılı olarak açıklarlar. Bu teknik, sabit dokularda çok çeşitli nörogelişimsel süreçleri incelemek için kullanılabilir ve ayrıca canlı embriyolarda deneyler için değiştirilebilir.
Nöral krest hücreleri (NCC'ler), pigment hücrelerine, kıkırdağa, kemiğe, düz kaslara, nöronlara ve gliaya yol açan önemli bir gelişimsel soyu temsil eder ve bu hücreler birçok doğum kusuru türünde rol oynar3. Etkileyici pluripotensilerine ek olarak, NCC'ler ayrıca epitelyalden mezenkimal geçişe ve ardından gelişim sırasında kapsamlı bir göçe uğrarlar, bu da onları hücre kaderi ve morfoloji4 arasındaki etkileşimi anlamak için büyüleyici bir paradigma haline getirir. Civciv embriyoları, NCC biyolojisini incelemek için güçlü bir sistemdir, çünkü NCC'ler in vivo olarak görselleştirilebilir ve ex vivo olarak kültürlenebilir, böylece diğer sistemlerle zor olan birçok moleküler tedavi türüne izin verir. Jacques-Fricke ve ark. fibronektin kaplı lameller üzerinde birincil NCC kültürleri oluşturmak için kraniyal nöral kıvrımların kültürlenmesi için esnek bir yöntem tanımlar ve bunu daha sonra sabit görüntüleme veya canlı görüntüleme deneyleri takip edebilir5. 1) embriyoların nasıl inkübe edileceğini ve izole edileceğini, 2) nöral kıvrımların nasıl kesileceğini ve plakalanacağını, 3) NCC'lerin nasıl sabitleneceğini ve boyanacağını ve 4) NCC morfolojisinin nasıl ölçüleceğini ve analiz edileceğini açıklarlar.
Epitel hücrelerinin bazal yüzeyi boyunca üretilen hücre dışı bir matris olan bazal membran, hayvanlar arasında doku morfolojisi ve organ fonksiyonunun kurulması için kritik öneme sahiptir6. Oluşan yumurtayı çevreleyen Drosophila foliküler epiteli, bazal membranın7 tüm ana korunmuş bileşenlerini salgıladığından ve matris yumurta odasının "dışına" doğru yönlendirildiğinden, bazal membranların nasıl oluştuğunu incelemek için mükemmel bir modeldir, böylece mikroskopi tabanlı analizlerikolaylaştırır 8. Shah ve Devergne, veziküler kaçakçılığın bazal membran oluşumunu nasıl etkilediğini incelemek için en popüler süper çözünürlüklü mikroskopi türlerinden biri olan Airyscan'in kullanımını açıklamaktadır9. 1) Drosophila yumurtalıklarının nasıl toplanacağını ve düzeltileceğini, 2) immünofloresan gerçekleştirileceğini, 3) numunelerin uygun şekilde monte edileceğini ve 4) üç boyutlu analiz için yüksek kaliteli süper çözünürlüklü veri kümelerinin nasıl yakalanacağını gösterirler. Bu makalenin, floresan görüntülerini ölçmek isteyen herkesin genel ilgisini çekmesi gereken, doymamış olmayan, üç boyutlu konfokal veri kümelerinin uygun şekilde elde edilmesi konusunda son derece yararlı ve özlü bir eğitim içerdiğini not ediyoruz.
Mikroskop tabanlı süper çözünürlüklü teknolojiler (örneğin, STED, SIM ve Airyscan)10 giderek daha yaygın hale gelirken, standart konfokal mikroskoplardan daha pahalıdır ve tüm araştırmacılar tarafından kullanılamaz. Süper çözünürlüklü görüntüler elde etmek için alternatif bir teknik, biyolojik bir numunenin şişebilir bir hidrojele 11 gömülmesi ve bağlanması yoluyla üç boyutlu olarak fiziksel olarak büyütülmesini içeren genleşme mikroskobudur (ExM). Genişletilmiş numuneler daha sonra, diğer süper çözünürlüklü mikroskopi12 türlerine rakip olarak, onlarca nanometre mertebesinde yanal çözünürlüğe sahip görüntüler oluşturmak için standart bir konfokal mikroskop kullanılarak görselleştirilebilir. Grubumuz, standart konfokal mikroskopi13 ile saptanamayan aktomiyosin hücre iskeleti ve mitokondriyal ağların hücre altı özelliklerini ortaya çıkarmak için tam montajlı Drosophila embriyolarında ExM'nin nasıl uygulanacağını açıklamaktadır. 1) uygun şekilde evrelenmiş embriyoların nasıl seçileceğini, 2) immünofloresan gerçekleştirileceğini, 3) embriyoların genişleme için nasıl hazırlanacağını ve monte edileceğini, 3) embriyoların nasıl sindirileceğini ve genişletileceğini ve 4) süper çözünürlüklü veri kümelerinin nasıl toplanacağını açıklıyoruz. Bu teknik, 1 mm mertebesinde çok çeşitli biyolojik örnekler için değiştirilebilir olmalı ve bu da onu çok çeşitli biyoloji laboratuvarları için erişilebilir kılmalıdır.
Gelişim biyolojisi, zorunlu olarak, hayvanda meydana gelen hücre biyolojisini ölçmek için çeşitli bilimsel alanlardan tekniklerden yararlanan oldukça yaratıcı ve disiplinler arası bir alandır. Burada, zebra balığı, civciv ve meyve sineğinde, hayvan gelişimi sırasında hücre morfolojisini ve hücre altı protein lokalizasyonunu araştırmak için hem klasik hem de en son teknikleri içeren dört gelişimsel biyoloji yöntemini vurguluyoruz. Şu anda alan, hayvan gelişimini kontrol eden moleküllerin ve biyomekanik kuvvetlerin tüm çeşitliliğini ortaya çıkarmak için hücre morfolojisi ve davranışının nicel analizlerini transkriptomik ve proteomik deneylerle birleştirmeye odaklanmıştır.