Bu yazıda, murin aortlarının izole edilmesi, ardından mineralizasyon potansiyelini gözlemlemek için kalsifiye hücre dışı veziküllerin ekstraksiyonu ile vasküler kalsifikasyonun elde edilmesi ve değerlendirilmesi için metodoloji sunulmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücre Dışı Vezikül Aracılı Vasküler Kalsifikasyonun In Vitro ve In Vivo Modeller Kullanılarak Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Kardiyovasküler hastalık dünyada önde gelen ölüm nedenidir ve vasküler kalsifikasyon kardiyovasküler olayların en önemli belirleyicisidir; Bununla birlikte, şu anda vasküler kalsifikasyon için herhangi bir tedavi veya terapötik seçenek bulunmamaktadır. Kalsifikasyon, kalsiyum ve fosfat iyonlarını toplayarak çekirdeklendirici odaklar olarak işlev gören özel hücre dışı veziküller (EV'ler) içinde başlar. Bu protokol, murin aortlarda kalsifikasyonun elde edilmesi ve değerlendirilmesi ve ilişkili ekstrakte edilen EV'lerin analizi için yöntemleri açıklamaktadır. İlk olarak, farenin brüt diseksiyonu, böbrekler, karaciğer ve akciğerler gibi ilgili organları toplamak için gerçekleştirilir. Daha sonra murin aort izole edilir ve aort kökünden femoral artere eksize edilir. İki ila üç aort daha sonra, ilgilenilen EV'leri izole etmek için ultrasantrifüjlemeye tabi tutulmadan önce bir sindirim çözeltisinde toplanır ve inkübe edilir. Daha sonra, EV'lerin mineralizasyon potansiyeli, yüksek fosfatlı bir çözeltide inkübasyon ve ışık emiciliğinin 340 nm dalga boyunda ölçülmesi yoluyla belirlenir. Son olarak, kollajen hidrojelleri, EV'ler tarafından in vitro olarak üretilen kalsifiye mineral oluşumunu ve olgunlaşmasını gözlemlemek için kullanılır.
Giriş
Kalsifikasyon kardiyovasküler hastalık mortalite ve morbiditesinin en önemli belirleyicisidir1. Kalsifikasyon, kalsiyum ve fosfat minerallerinin birikmesi nedeniyle arteriyel duvar mekaniğini değiştirir2. Aterosklerozda, kalsifikasyon lokal stresi şiddetlendirebilir ve kalp krizinin önde gelen nedeni olan plak rüptürüne neden olabilir. Genellikle kronik böbrek hastalığından kaynaklanan medial kalsifikasyon daha yaygındır ve önemli arteriyel sertleşme, disfonksiyon ve kardiyak aşırı yüklenmeye yol açar 2,3. Şu anda, vasküler kalsifikasyonun tedavisi veya önlenmesi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
In vivo çalışma, Florida Uluslararası Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve denetlenmiş ve mevcut Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) kurallarına uygun hale getirilmiştir. Bu protokol için prosedür, farenin gerginliğine, ağırlığına, yaşına ve cinsiyetine bağlı olarak farklılık göstermez. İncelenen kalsifikasyon türü, diyetler ve tedaviler, çalışmanın uzunluğunu ve kullanılan farenin ağırlığını değiştirebilir ve çalışmada kullanılan farenin belirli bir suşuna ve cinsiyetine bağlı olabilir. Bu protokol için hem erkek hem de dişi C57BL/6J fareler kullanıldı ve kalsifikasyon diyetiyle beslendiler. Fareler 20 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Aortlar çıkarıldıktan sonra, yakın kızılötesi optik tarayıcı kullanılarak yapılan görüntüleme, aortun yanı sıra vasküler kalsifikasyonun görsel bir temsilini gösterir (Şekil 1). Taranan floresan görüntüdeki piksel yoğunluğu değerleri, kireçlenmenin dağılımını temsil eder ve burada renkli bir ısı haritası kullanılarak gösterilir. Niceleme yöntemleri, pozitif bir eşik belirlemeyi ve aortun yüzde alanını bu eşik değerinden daha büyük değerlerle raporlamayı ve / veya aort içindeki piksellerin or.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protokolü gerçekleştirirken, başarılı sonuçlar elde etmek için kritik adımları not etmek önemlidir. Murin aortun izolasyonu sırasında, perfüzyonun uygun şekilde yapılması hayati önem taşır. PBS'yi enjekte ederken, sağ ventrikülün delinmemesine dikkat edilmelidir. Bu, sıvının doğrudan ventrikülden sızmasına ve akciğerlerde dolaşamamasına ve aort içinde kan bırakmasına neden olur. Perfüzyon düzgün bir şekilde yapıldıktan ve mikrodiseksiyon başladıktan sonra, tamamlanmadan ve taramadan önce tüm yağ ve yağ dokusu aorttan çık.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (1R01HL160740 ve 5 T32GM132054-04) ve Florida Kalp Araştırma Vakfı'ndan gelen hibelerle desteklenmiştir. Kassandra Gomez'e hidrojellerin sentezlenmesi ve görüntülenmesindeki yardımları için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 8 kuyulu odacıklı kapak camı | Thermo Scientific | 155409PK | |
| 10 mL Şırınga | BD | 302995 | |
| 20 G 1 inç İğne | BD | 305175 | |
| Kollajen, Yüksek Konsantrasyon, Sıçan Kuyruğu | Corning | 354249 | |
| Kollajenaz | Worthington Biyokimyasal | LS004174 | |
| Kavisli Forseps | Roboz Cerrahi Alet | RS-8254 | |
| Diseksiyon Çanağı | Yaşam Sistemleri Enstrümantasyon | DD-90-S | |
| Diseksiyon Pan ve Balmumu | Birleşik Bilimsel Malzemeler | DSPA01-W | |
| DMEM | Cytiva | SH30022. | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| LI-COR Odyssey | LI-COR | DLx | |
| Mikro Diseksiyon Kavisli Makas (24 mm Bıçak) | Roboz Cerrahi Alet | RS-5913 | |
| Mikro Diseksiyon Yaylı Makas (13 mm Bıçak) | Roboz Cerrahi Alet | RS-5677 | |
| Mikro Diseksiyon Yaylı Makas (5 mm Bıçak) | Roboz Cerrahi Alet | RS-5600 | |
| Mikro Diseksiyon Cımbızı (0.10 x 0.06 mm Tip) | Roboz Cerrahi Alet | RS-4976 | |
| Optima MAX-TL Ultrasantrifüj | Beckman Coulter | B11229 | |
| OsteoSense 680EX | Perkin Elmer | NEV10020EX | |
| Pierce Proteaz İnhibitörü | Thermo Scientific | A32963 | |
| Potasyum Klorür | Fischer Kimyasal | P217 | |
| RIPA Lizis ve Ekstraksiyon Tamponu | G Biosciences | 786-489 | |
| Sodyum Klorür | Fischer Kimyasal | BP358 | |
| Sodyum Hidroksit | Termo Bilimsel | A4782602 | |
| Sodyum fosfat monobazik | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| Sükroz | Sigma | S7903 | |
| Sinerji HTX Çok Modlu Okuyucu | Agilent | ||
| Doku kültürü plakası, 96 kuyulu | Thermo Fisher | 167008 | |
| T-Pins | Birleşik Bilimsel Malzemeler | TPIN02-PK / 100 | |
| Tris Hidroklorür | Fischer Kimyasal | BP153 |
Kaynaklar
- Bakhshian Nik, A., Hutcheson, J. D., Aikawa, E. Extracellular vesicles as mediators of cardiovascular calcification. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 4, 78(2017).
- Ho, C. Y., Shanahan, C. M. Media....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
