Yöntem makalesi

Hücresiz İfade Sistemleri: Üretim ve Kullanım Yöntemleri

393 görüntüleme

⸱

28 Temmuz 2023

 ,  , 
1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

Bu makalede

Özet

TARTIŞILAN MAKALELER:

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE hücresiz sistem. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (172), doi:10.3791/62625 (2021).

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. Hücresiz otoindüksiyon iş akışını kullanarak 24 saat içinde hücrelerden hücresiz protein sentezine. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (173), doi:10.3791/62866 (2021).

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Hızlı, uygun fiyatlı ve karmaşık olmayan bakteri hücresiz lizat üretimi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (176), doi:10.3791/62753 (2021).

Dopp, J. L., Reuel, N. F. Hücresiz sistemler kullanarak protein prototiplemesi için minimal, doğrusal şablonların amplifikasyonu için hızlı, enzimatik yöntemler. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (172), doi:10.3791/62728 (2021).

McManus, J. B. et al. Hücresiz sistemlerle genetik parçaların hızlı karakterizasyonu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (174), doi:10.3791/62816 (2021).

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P.S., Moore, S.J. Sentetik biyoloji ve doğal ürün uygulamaları için yüksek verimli bir streptomyces transkripsiyon-çeviri araç seti. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (175), doi:10.3791/63012 (2021).

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Lizat bazlı hücresiz sistemlerde metabolit profili oluşturma için kırılma indisi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (175), doi:10.3791/62852 (2021).

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. RNA aptamerlerini ve riboswitchleri kodlayan DNA plazmitleri ile yüklenmiş çok işlevli ipek bazlı mikrokapsüllerin hazırlanması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (176), doi:10.3791/62854 (2021).

Jaenes, K. et al. Kağıt tabanlı ayak pedalı teşhisinin geliştirilmesi ve hasta tarafından doğrulanması için tasarımdan uygulamaya çalışması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (184), doi:10.3791/63223 (2022).

Editöryal

Hücresiz ekspresyon (CFE) sistemleri, hücre1'in sınırları dışında transkripsiyon, translasyon ve metabolizma gibi temel hücresel süreçleri yeniden oluşturan bir araç paketidir. Bu tür yöntemler, hücre zarlarının çıkarılması yoluyla basitleştirilmiş deneyler ve genomik DNA'nın çıkarılması yoluyla azaltılmış karmaşıklık ve bir genetik yapı ile konakçı arasındaki etkileşimlerin karşılık gelen karmaşıklığı sunarak popülaritesini hızla artırdı. CFE sistemleri artık temel araştırma, algılama, biyoüretim ve eğitim için kullanılmaktadır. Bu yöntem koleksiyonu, hücresiz sistemleri üretmenin ve kullanmanın yeni yollarına ilişkin dokuz örnek sunar.

Yöntemlerden üçü, hücresiz sistemlerin üretimini daha erişilebilir hale getirmeye odaklanıyor. Grasemann et al. hücresel lizatlar2 kullanmak yerine, transkripsiyon ve translasyon için gerekli tüm bileşenleri yeniden oluşturan bir CFE sistemi olan PURE sistemini yapmanın daha kolay bir yolunu açıklar. Yazarlar, 36 protein bileşeninin her birini eksprese etmek ve saflaştırmak yerine, ekspresyon suşlarını bir araya getirerek bir hafta içinde fonksiyonel bir PURE sisteminin üretimini sunar. Smith ve ark. normal çalışma saatleri içinde gerçekleştirilebilen, toplam iş akışını 24 saate indiren modern bir kültürleme yaklaşımı kullanarak lizat bazlı CFE sistemlerinin üretimi için basitleştirilmiş bir süreç sunar3. Cooper ve ark. modifiye edilmiş bir yöntem kullanan bir yöntem tanımlayın E. koli donma-çözülme yoluyla hücre lizizini mümkün kılan ve diğer yöntemlerin gerektirdiği özel ekipmana olan ihtiyacı ortadan kaldıransuşu 4. Tüm bu yöntemler, hücresiz sistemlerin üretimini, karmaşık geleneksel protokollerde daha az altyapıya ve uzmanlığa sahip laboratuvarlar tarafından ulaşılabilir hale getirme çabalarının eğilimine katkıda bulunur. Rakip ticari kitlerin mevcudiyeti ile giderek daha fazla laboratuvar, CFE sistemlerinin avantajlarını çok az riskle keşfedebilir. Burada sunulanlar gibi yöntemlerle, bu laboratuvarlar daha sonra ekipman veya zamana büyük bir yatırım yapmadan ihtiyaçlarına göre uyarlanmış kendi CFE sistemlerini yapmayı seçebilirler.

İki yöntem, CFE sistemleriyle mümkün olan hızlı ve yüksek verimli deneylerin avantajlarına odaklanır. Dopp ve ark. genetik yapıların hızlı taranması için lineer DNA şablonlarını çoğaltmak için bir yöntem sunar5. Yaklaşımlarını kullanarak, genetik tasarımlar DNA sentezi şirketlerinden sipariş edilebilir ve daha sonra 24 saat içinde çoğaltılabilir ve taranabilir. McManus ve ark. bir raportör genin, farklı düzenleyici bileşenlerikodlayan değişen primerlerle amplifiye edildiği benzer bir yaklaşımı tanımlayın 6. CFE sistemleriyle eşleştirilmiş oligoların düşük maliyeti, promotörler gibi bileşenlerin hızlı ve uygun maliyetli bir şekilde taranmasını sağlar. Her iki yöntem de CFE sistemlerinin hızlı deney yapma potansiyelini vurgulayarak, geleneksel klonlamayı kullanarak bir yapının tasarlanması ve test edilmesi için gereken zaman çizelgelerini haftalardan günlere, hatta saatlere indiriyor.

Sonraki üç yöntem, CFE sistemlerinin özel kullanımları için araçlar sağlar. Toh ve ark. Streptomyces venezuelae7'den CFE sistemleri oluşturmak için bir yöntem sunar. CFE protokollerinin çoğu, bu koleksiyondaki diğer tüm yöntemler de dahil olmak üzere E. coli'ye dayanmaktadır. S. venezuelae için bu yeni yöntem, CFE sistemlerinin avantajlarını doğal ürün üretimi için geniş ilgi gören bir organizmaya getiriyor. Dinglasan ve ark. hücresiz reaksiyonlarda metabolit konsantrasyonlarını ölçmek için bir yol sağlar8. Bu tür ölçümler, CFE sistemlerinin bozulmamış metabolizmasının ilgilenilen protein olmayan ürünleri üretmek için kullanıldığı hücresiz metabolik mühendislik uygulamaları için kritik öneme sahiptir. Üçüncüsü, Drachuk ve ark. CFE reaksiyonlarına ek olarak DNA'nın mikrokapsüllenmesini sunar9. Bu yaklaşım, CFE sistemlerinin üretimi sırasında doğal membranların çıkarılmasından sonra bölümlendirmenin avantajlarının CFE sistemlerine rasyonel olarak yeniden dahil edilmesini sağlayan bir dizi tekniği temsil etmektedir. Bu yöntemlerin her biri, CFE sistemlerinin uygulanabileceği uygulama yelpazesini çeşitlendirir.

Son olarak, Jaenes ve ark. CFE sistemlerine10 dayalı olarak Zika virüsü için gerçek dünya teşhisi üretme yöntemlerini açıklar. Testler ve enstrümantasyon, PCR gibi rakip teknolojilere kıyasla düşük maliyetlidir ve yazarlar, teşhislerini birden fazla ülkede hasta örneklerini kullanarak başarıyla test etmişlerdir. Bu çalışma, belki de CFE sistemlerinin gerçek dünyada en acil etkiyi yaratmaya hazır olduğu alan olan ihtiyaç noktası algılama uygulamalarının güçlü bir örneğidir.

Bir koleksiyon olarak, bu yöntemler, son yıllarda CFE sistemlerindeki aktif araştırmaların ana alanlarının temsili bir alanını yakalar. CFE sistemlerinin üretimini iyileştiren ve yüksek verimli deneyler sağlayan yöntemler iyi temsil edilmektedir ve CFE sistemlerinin çok sayıda daha spesifik kullanımının örnekleri mevcuttur. Diğer ilgi alanları arasında tıbbi uygulamalar için karmaşık proteinlerin üretimi, kanonik olmayan amino asitlerin dahil edilmesi, uzun süreli depolama için optimizasyon ve yapay hücrelerin geliştirilmesi yer almaktadır. Tümü bu koleksiyonda sunulanlar gibi yöntemlerle sağlanan giriş engelinin azalması, hızlı deney potansiyeli ve daha geniş yetenek yelpazesi göz önüne alındığında, CFE sistemlerinin benimsenmesinin hızlanmaya devam etmesini bekliyoruz. Kalan zorluklar uygulama alanına bağlıdır. Biyoüretim için, daha ucuz alt tabakalara geçerek maliyetlerin büyük ölçekte azaltılması ve geri dönüşümün iyileştirilmesi kritik öneme sahip olacaktır. Algılama için, Jaenes ve ark. çeşitli ihtiyaç noktası uygulamalarında sağlam performans göstermek için gereklidir. Genel olarak, alanın CFE sistemleriyle neler yapılabileceğine dair repertuarı genişletirken temel teknikleri geliştirmeye devam etmesi gerekiyor.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu koleksiyona yol açan işbirliğini desteklediği için Savunma Bakanlığı Ofisi'nin S&T Önceliklerinin Geliştirilmesi için Uygulamalı Araştırma programına teşekkür eder.

Kaynaklar

  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein SynthesisCell free AutoinductionBacterial Cell free LysateGenetic Parts CharacterizationSynthetic BiologyTranscription translation ToolkitMetabolite ProfilingSilk based MicrocapsulesRNA AptamersRiboswitchesDiagnostics

İlgili makaleler