$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Amyotrofik lateral skleroz (ALS), yaşamları boyunca yaklaşık 400 kişiden 1'ini etkileyen yıkıcı bir nörodejeneratif hastalıktır. Hastalık başlangıçta üst ve alt motor nöron bozukluğu olarak ortaya çıkar ve sonunda semptom başlangıcından sonraki 2-5 yıl içinde solunum yetmezliği sonucu felç ve ölüme ilerler1. ALS, 30'dan fazla farklı genetik mutasyonla kalıtsal olabilir, ancak ailesel ALS'nin yaklaşık %55'ini oluşturan yalnızca 4 gen varyantı (C9orf72, FUS, SOD1, TARDBP) vardır. ALS vakalarının çoğunluğu, yaklaşık %90'ı, önde gelen nedenlerin hala tam olarak anlaşılamadığı sporadik ALS'yi temsil etmektedir2. Uygun araçlar ve model organizmalar kullanılarak ALS'nin mekanizmalarının çözülmesine acil ihtiyaç vardır. Bu yöntemler koleksiyonunda, bu hastalığı taklit etme ve umarız nihayetinde tedavi seçenekleri bulma açısından son araştırma ilerlemelerine genel bir bakış sunuyoruz. Örneğin, motor nöronlara veya astrositlere farklılaştırılabilen indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (iPSC'ler) uygulanması, insanlaştırılmış bir model sistem 3,4,5 sunar. Ek olarak, bu yöntem koleksiyonunda, glikoz alımını ve nöromüsküler kavşağı (NMJ) in vivo 6,7 incelemek için Drosophila, kortikal nöronları8 incelemek için fareler ve motor bozuklukları 9,10 ve ölüm sonrası hasta dokusunu araştırmak için C. elegans veya zebra balığı11 gibi hayvan modelleri sunulmaktadır.
Zebra balığı larvaları şeffaftır ve motor nöronları doğrudan görülebilir, bu da onları invaziv olmayan in vivo çalışmalar için mükemmel bir araç haline getirir. Asakawa ve ark. optogenetik olarak eksprese edilen TDP-43'ün tek spinal motor nöronlarda faz geçişini gösterir9. Işınlamadan sonra, TDP-43'ün sitoplazmik yer değiştirmesi gözlemlenebilir ve analiz edilebilir. Sitoplazmik TDP-43'ün agregasyonu, ALS'de dejenere motor nöronların ayırt edici özelliğidir. Bu yöntem, ALS ile ilişkili proteinlerin hücre altı, zamansal bir şekilde fonksiyonel çalışmasına ve analizine izin verir.
Süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanan Coyne ve Rothstein, çekirdekleri izole eden ve nükleoporin komplekslerinin11 nasıl araştırılacağını açıklayan bir protokolü detaylandırır. Nükleoporin kompleksleri, yaklaşık 30 farklı nükleoporin proteininin (Nup'lar) çoklu kopyalarından oluşur. Nükleositoplazmik taşıma (NCT) bozukluğu ve Nup değişikliklerinin, ALS dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalığın erken ayırt edici özellikleri olduğu gösterilmiştir. Çekirdekleri çıkararak, NPC ve nükleoplazma içindeki tek tek Nup proteinlerini 3D olarak araştırmak mümkündür. İlginç bir şekilde, bu sadece iPSC'den türetilen hücrelere değil, aynı zamanda ölüm sonrası dokuya da uygulanabilir.
Currey ve Liachko, ALS10'un C. elegans modellerinde hafif, orta ve şiddetli motor bozukluk arasında ayrım yapmak için iki tahlil tanımlamaktadır. Radyal hareket tahlilinde, bir yüzey üzerinde sürünme ölçülür, bu da bunu kolay ve uygun maliyetli bir tahlil haline getirir. İkinci yöntemleri olan yüzme tahlilinde, vuruş hareketleri bilgisayar tabanlı bir izleme yöntemi kullanılarak ölçülebilir. Yazarlar bunu TDP-43 ve tau'yu incelemek için kullanırlar.
Hayes ve ark. ayrıca NCT8'i incelemek için bir yöntem tanımlamaktadır. Nöronal kültürlere geçirgenleştirme yöntemi uygularlar. Birincil fare kortikal nöronlarını kullanarak, bir sığır serum albümin yastığı ile birlikte hipotonik lizis kullanarak nükleer membran bütünlüğünü koruyan bir yöntemi tanımlarlar. Bunu yaparak, nükleer ithalat hala enerjiye bağımlı bir şekilde çalışmakta ve böylece yüksek içerikli bir mikroskopi ve analiz platformu sağlamaktadır. Bu platform, gelecekte birincil nöronlarda pasif ve aktif nükleer taşımayı incelemek için geniş bir uygulanabilirliğe sahip olacaktır.
Manipülasyonun, hastalıkla ilişkili proteinlerin veya RNA'nın sinaptik süreçleri nasıl etkilediğinin ve terapötik ilaçların bu işlevleri geri getirip getiremeyeceğinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesi ALS araştırması için çok önemlidir. iPSC'den türetilen motor nöronların yanı sıra farelerden alınan birincil nöronları kullanarak, Krishnamurthy ve ark. presinaptik kalsiyum akış dinamiklerinin ve sinaptik vezikül membran füzyonunun gerçek zamanlı izlenmesini sağlayan bir protokol sunar3. Yazarlar, C9orf72-(GA)50 transfeksiyonunun sinaptik iletimi bozduğunu göstererek, bu yöntemlerin sinaptik fonksiyondaki mutasyona dayalı farklılıkları saptamak için uygunluğunu vurgulamaktadır.
Değişmiş glikoz alımı, ALS'nin patobiyolojik özelliklerinden biridir. Bu Drosophila modelinde, Loganathan ve ark. belirli hücrelerde glikoz alımındaki hücre içi değişiklikleri ölçmek için FRET tabanlı bir yöntem tanımlayın6. Genetik olarak kodlanmış bir glikoz FRET sensörü kullanarak, yöntemlerini daha yüksek glikoz alımı gösteren TDP-43 ekspresyon nöronlarıyla doğruluyorlar. TDP-43G298S mutant hattında, artan glikoz alımı yalnızca glikoz stimülasyonu üzerine tespit edilebilir. Bu yöntem, sadece ALS'de değil, aynı zamanda genel olarak motor nöron rejenerasyonu ile ilgili olarak glikolizi incelemek için önemli bir araç sağlar.
NMJ mimarisini koruyan diseksiyon teknikleri, Drosophila bacağı boyunca motor nöronlarda zaman içinde meydana gelen değişiklikleri incelemek için son derece önemlidir. Stilwell ve Agudelo, immünositokimya7 kullanarak motor nöron çardaklarını tanımlamak için NMJ'nin karakterizasyonuna izin veren bir teknik kullanır. İlginç bir şekilde, yetişkin nöronlar, yaklaşık 90 gün olan bir sineğin ömrü boyunca mevcuttur. Bir SOD1H71Y mutasyonunu vahşi tiple karşılaştıran yazarlar, yaşa bağlı bouton şişmesi, protein agregatları ve genişlemiş mitokondri için farklı belirteçler göstermektedir.
Bir ko-kültür sistemi kullanarak bir NMJ'yi taklit etme yeniliği, motor nöronlar ve miyotüpler arasındaki ayrışmayı incelemeye yönelik acil ihtiyacı karşılamaktadır. Bu yöntem açısından, Stoklund Dittlau ve ark. fonksiyonel olarak aktif NMJ'ler oluşturmak için insan iPSC'den türetilen motor nöronların ve insan birincil mezoanjiyoblasttan türetilen miyotüplerin nasıl yetiştirileceğini açıklar4. Yazarlar, daha sonra NMJ blokerlerinin uygulanmasıyla ortadan kaldırılan Fluo-4 etiketli miyotüplerde motor nöronların potasyum klorür ve kalsiyum akışı ile aktivasyonu ile işlevselliklerini göstermektedirler.
Son zamanlarda, ortak kültür sistemleri giderek daha fazla ilgi görmeye başlamıştır. Bir tabakta yalnızca bir değil, birden fazla hücre tipini incelemek, fizyolojik koşulları monokültürlü hücrelerin kullanıldığı yöntemlerden daha iyi taklit etme avantajına sahiptir. Astrosit aracılı toksisite ve nöronal hiper-uyarılabilirlik gibi ALS ile ilişkili patobiyoloji bu yaklaşım kullanılarak incelenebilir. Taga ve arkadaşlarının videosunda, elektrofizyolojiyi izlemek için çok elektrotlu bir dizi (MEA) kurulumuyla birleştirilmiş bir ko-kültürde kortikal nöronların ve astrositlerin üretimi gösterilmektedir5. Fonksiyonel aktivite zaman içinde izlenebilir, bu da hücresel bileşimde ve farklı kültür koşullarında esneklik sağlar. Bu ayrıca ilaçların terapötik potansiyelini ve fonksiyonel aktivite üzerindeki etkilerini test etmek için bir platform sağlar.
Şu anda, ALS için tümü sınırlı uygulama potansiyeline sahip yalnızca üç FDA onaylı tedavi vardır. Daha umut verici tedaviler bulmak için, gelecekteki araştırmalar birden fazla model sistem ve yaklaşım kullanarak patobiyolojiyi daha iyi anlamalıdır. Şüphesiz, insan iPSC'den türetilen modeller, altta yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için ilginç bir platform sağlayacaktır. Bu, zebra balığı, C. elegans, Drosophila veya kemirgenler gibi model sistemlerle birleştiğinde bu alanda ilerlemeye yol açacaktır. Ayrıca, gelecekteki epidemiyolojik araştırmaların, çevresel faktörlerin ALS12'nin gelişiminde nasıl bir rol oynadığına dair daha fazla bilgi sağlayacağını umuyoruz. Genişleyen veri setleri ve biyoinformatiklerin yüksek hızda gelişmesiyle, gelecekte nörodejeneratif hastalıkların ortak paydalarını çözmek daha kolay hale gelecektir. Bu, terapi ve hatta önleme için yeni yollara yol açacaktır.