$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Biyolojik moleküllerin kriyo-elektron mikroskobu (kriyoEM) için 2017 Nobel Ödülü verilmeden önce bile, alan heyecan yaratıyordu. Çözünürlük devrimi iyi bir şekilde devam ediyordu ve yapısal biyoloji, x-ışını kristalografisi1'in altın standardına yaklaşan bir karakterizasyon yöntemi olarak kriyoEM'ye bakıyordu. Başlangıçta, kriyoEM alanı öncelikle kriyotransmisyon elektron mikroskopları (kriyoTEM'ler) tarafından üretilen verileri kapsıyordu. Artık mikroskoplar, numune hazırlama cihazları ve numune hazırlama yöntemleri geliştikçe, üretilen veri türleri de daha çeşitli hale geldi. CryoEM artık cryoTEM ile protein karakterizasyonu için ayrılmamıştır. Alan büyüdü ve artık kriyo taramalı elektron mikroskoplarından ve odaklanmış iyon ışınından (kriyoSEM/FIB) üretilen verileri içeriyor. Etki, moleküller, hücreler, dokular ve hidrojeller gibi sentetik malzemeler üzerinde görüntüleme araştırmaları da dahil olmak üzere birçok disiplinde daha geniş bir şekilde hissedilmektedir.
Görüntüleme yeteneklerindeki ilerlemeler, kriyoEM geliştirmede itici bir güç olmuştur. Kameralar, dedektörler ve görüntü işlemedeki gelişmeler, daha az enerji girişi ile görüntülemenin önünü açmış ve bu da hassas biyolojik numunelerin görüntüleme sürecinde hayatta kalmasını sağlamıştır. TEM'lerde, düşük doz ışın maruziyeti, bir 3D rekonstrüksiyon 2,3 oluşturmak için tek bir numunenin birden fazla açıdan tekrar tekrar görüntülendiği tomografi uygulamasına çevrilmiştir. SEM/FIB'lerdeki ilerlemeler aynı zamanda daha az enerji kullanırken çözünürlüğün artmasına da yol açtı. Daha da önemlisi, bu, iletken olmayan numunelerin daha iyi görüntülenmesine yol açmıştır, bu da SEM/ FIB'lerde 4,5'te daha iyi hacimli görüntüleme anlamına gelir. Bu gelişmeler, tüm biyolojik elektron mikroskobu görüntülemeyi geliştirmiştir, ancak özellikle numunelerin hassas olduğu ve kontrastı iyileştirmek için ek ağır metallerin eklenmediği kriyo görüntülemeyi geliştirmiştir.
Görüntüleme yetenekleri geliştikçe numune hazırlama cihazları da gelişti. KriyoEM numune hazırlamada ilk adım, numunelerin başarılı bir şekilde vitrifikasyonudur. Hidratlı numuneler amorf buz oluşturacak şekilde dondurulur, böylece buz kristallerinin oluşumunun neden olduğu hasar önlenir. Önde gelen stratejiler, moleküller ve küçük hücreler için sıvı etan içinde daldırmalı dondurma veya kalınlığı birkaç yüz mikrona kadar olan daha büyük numuneler için yüksek basınçlı dondurmadır (HPF). Daldırmalı dondurma teknolojisindeki gelişmeler, hava/su arayüzü boyunca kendi kendine montajı azaltarak moleküllerin tüm yönlerde daha iyi yakalanmasını sağlar6. Ek olarak, HPF teknolojisindeki gelişmeler, numunelerin dondurulmadan birkaç dakika önce ışıkla ve elektrikle uyarılmasına olanak tanır7. Son zamanlarda, canlı hücrelerin floresan görüntülemesi ile HPF dondurması 8 arasında kısa bir zaman gecikmesine (<2 s) izin veren bir floresan mikroskobu ile arayüz oluşturabilen yeni bir HPF teknolojisigeliştirilmiştir.
Yukarıdaki ilerlemeler kriyoEM alanına enerji vermiş ve yeni yöntemlerin geliştirilmesine ilham vermiştir. Ayrıca yerleşik tekniklerin yeniden canlandırılması da söz konusudur. Burada, bu stratejileri hızla genişleyen araştırma alanına yaymak amacıyla kriyoEM'i ilerletmeye odaklanan bir yöntem koleksiyonu sunuyoruz.
Görüntüleme yetenekleri ve numune hazırlama cihazlarındaki gelişmeler, kriyoEM alanındaki ilerlemelerin arkasındaki önemli bir itici güç olsa da, bu araştırmadaki en büyük engel, numunelerin uygulamalı olarak hazırlanması olmaya devam ediyor. Truong ve ark.9 hava/su arayüzünde lipid tek tabaka oluşumundan yararlanan bir yöntem sunmaktadır. TEM ızgarasında bir lipit tabakası oluşur ve ilgilenilen zar proteinleri için bir iskele görevi görür. Çok katmanlı veya istiflenmiş membran numuneleri için Johnson ve ark.10 , ızgara üzerinde TEM görüntüleme için uygun olan tek bir katman bırakarak fazla katmanları "soymak" için bir strateji sunmaktadır. Başka bir makalede Chang ve ark.11 bazı proteinlerin sıcaklığa bağımlı olduğunu ve ilgili yapının yüksek sıcaklıklarda gözlendiğini kabul etmişlerdir. Numunelerin yüksek sıcaklıklarda ızgaraya uygulanmasına izin verirken, daldırma-dondurmadan sonra camsı buz elde etmeye devam eden modifiye edilmiş bir daldırma-dondurma yöntemini tanımlarlar. Kriyo ızgara hazırlama sürecini daha fazla kontrol etmek için Kang ve ark.12 , gözeneklerin kontrol edilebilir bir derinliğe sahip olduğu TEM ızgaraları için mikro desenli çipler üretmek için yüksek verimli bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, ızgara hazırlığı sırasında amorf buzun kalınlığını kontrol etmek için başka bir değişken sağlayabilir.
Çoklu görüntüleme yöntemlerinin korelasyonu etkilidir. Bieber ve ark.13 , ilgilenilen bir floresan bölgesini bulmak için donmuş bir ızgaranın bir kriyo floresan mikroskobunda görüntülendiği bir kriyo iş akışını tanımlamaktadır. Izgara daha sonra, floresan görüntüsünü SEM görüntüsüyle hizalamak için referansların kullanıldığı bir kriyoSEM/FIB'ye aktarılır, böylece floresan bölgenin FIB frezeleme için hedeflenmesine izin verilir. Hedef bölge birkaç yüz nanometreye kadar inceltilir ve daha sonra ızgara, inceltilmiş hedef konumda tomografi için bir kriyoTEM'e aktarılır. DiCecco ve ark.14 , sıvı TEM ve kriyoTEM arasında bir korelasyon olduğunu göstererek, yüksek çözünürlüklü kriyoTEM verilerini dinamik hareket halindeki moleküllerin TEM verileriyle birleştirme hedefine yaklaşmaktadır.
Büyük veri setlerinin otomatik olarak edinilmesi de bir ilgi alanıdır. Değerli cihaz zamanının en üst düzeye çıkarılması gerekir ve otomasyon önemli bir adımdır. Kumar ve ark.15 , kriyoTEM görüntüleme için otomatik bir veri toplama yazılımının tıkla tıkla kurulumunu tanımlamaktadır.
KriyoEM alanı gelişmeye devam ettikçe, numune hazırlamada daha fazla ilerleme görülecek ve kriyoEM'in etkisi daha fazla disiplinde geniş çapta hissedilecektir. Bazı ilerlemeler yeni teknikleri değil, mevcut tekniklerin güçlendirilmesini içerecektir. Teknikler daha hızlı, daha kolay ve daha sağlam olacak ve daha yüksek verim elde edecek. Otomasyon veri çıkışını artırdıkça, temel geliştirme alanları görüntü analizi ve veri işleme olacaktır. Ayrıca yapay zeka da önemli bir rol oynayacak. Bu gelişmelerin gerçekleşmesi daha yavaş olsa da, bu teknolojinin daha geniş çapta erişilebilir olmasını sağlayacak enstrümantasyon maliyetlerinde ve ayak izinde bir azalma görmeyi beklemeliyiz.