$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Dallanmış bir glikoz polimeri olan glikojen, prokaryotlarda ve ökaryotlarda enerji metabolizmasında önemli bir rol oynar. Besin sınırlaması koşulları altında, bakteri ve maya, hücrenin hayatta kalması için glikojeni kullanır1. Memelilerde glikojen, kasılmayı hızlandırmak için kaslarda ve kan şekeri seviyelerini düzenlemek için karaciğerde lokal kullanım dahil olmak üzere dokuya özgü rollere sahiptir2. Glikojen sentezi, glikoz kalıntılarını alfa 1,4 bağları yoluyla birleştiren glikojen sentaz ve alfa 1,6 bağları oluşturan dallanma enzimi tarafından katalize edilir, böylece glikojen makromolekülünde dallar oluşturur. Bu enerji deposunun kullanımı, dallanma enzimi ile birlikte glikojen fosforilaz tarafından kolaylaştırılır, bu da glikojenin yeniden şekillenmesine ve glikoz-1-P'nin salınmasına neden olur. Partikül boyutu ve dallanma dahil olmak üzere glikojenin yapısı kısmen ilgi çekicidir çünkü dallanma glikojen çözünürlüğünü etkiler, glikojen partiküllerinin boyutu bozunma hızlarını etkiler ve glikojen yapısal kararsızlığı diyabette rol oynar. Ayrıca, glikojenin hücre altı lokalizasyonunun araştırılması, bu yakıtın egzersiz sırasındaki rolü hakkında bilgi vermek için kaslar gibi dokularda önemlidir.
Glikojen birikimi, glikojen sentezleyen enzimlerin ve makromolekülü parçalayan enzimlerin nispi aktiviteleri tarafından kontrol edilir. Wilson3 , glikojen sentaz, glikojen fosforilaz, dallanma enzimi ve dallanma enziminin enzimatik aktivitesini ölçmek için teknikleri açıklar. Bu biyokimyasal yöntemler, bir spektrofotometre ile NADH/NADPH üretimini veya tüketimini veya kolorimetrik değişimi ölçer. Bunlar, radyoizotopları kullanan daha hassas yöntemle ilişkili yüksek maliyeti, özel ekipmanı ve düzenleyici yükü ortadan kaldıran ölçeklenebilir yaklaşımlardır. Tarif edilen yöntemler, saflaştırılmış enzimlerle enzim aktivitesini ölçmek için en uygun olanıdır, ancak yeterli homojenat seyreltme ve uygun kontrollerle doku örnekleriyle kullanılmıştır. Wilson3 ayrıca glikojen dallanmasını ölçmek için basit bir kolorimetrik testi de açıklar. Bu yöntem, glikojenin ince yapısı hakkında daha zahmetli ayırma tekniklerinden daha az bilgi vermesine rağmen, nispi dallanma derecelerinin basit ve hızlı bir ölçümünü sağlar.
Fermont ve ark.4 , glikojen partikül boyutunun ve dallanma yüzdesinin bir yansıması olan zincir uzunluğu dağılımını (CLD) belirlemek için bir yöntem olan florofor destekli karbonhidrat elektroforezinin (FACE) kullanımını tanımlamaktadır. Glikojenin yapısı, bakterilerin açlıktan kurtulma yeteneğini etkiler ve anormal glikojen, çeşitli glikojen depo hastalıklarında birikir, böylece bu yakıt kaynağının boyutunu ve dallanmasını incelemek için yöntemlerin önemini vurgular. FACE, bir hemiasetal grubun 8-amino 1,3,6 piren trisülfonik asit (APTS) ile indirgeyici aminasyonunu içerir. FACE, CLD hakkında bilgi sağlamanın yanı sıra, çeşitli kaynaklardan dallanan enzimlerin katalitik özelliklerini ölçmek için de kullanışlıdır. Birincil rakip teknik olan HPAEC-PAD, indirgeyici olmayan uçlar gerektirmeme avantajına sahiptir, ancak bu tekniğin bir kütle yanlılığı sorunu vardır.
Dallanma derecesi ve glikojen parçacıklarının boyutu, glikoz polimerinin önemli özellikleridir. Elektron mikroskobu kullanılarak glikojenin üç yapıda bulunduğu gözlemlenmiştir: birkaç gama parçacığı (3 nm) içeren küresel beta parçacıkları (~20 nm) ve beta parçacıklarından oluşan daha büyük rozet şeklindeki alfa parçacıkları (~300 nm)5. Glikojeni izole etmek için geleneksel yöntemler, glikojen konsantrasyonunu ölçmek için yeterlidir, ancak glikojenin ince yapısını tehlikeye atarlar, bu da daha hafif bir tekniğin geliştirilmesi gerektiği anlamına gelir. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifüjleme kullanılarak yapılan bir soğuk su ekstraksiyonu, bakterilerde kullanılmak üzere Wang, Wang ve ark.6 tarafından tanımlanmıştır. Bu teknik, hem boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile ölçülen daha büyük glikojen moleküllerini hem de florofor destekli kılcal elektroforez (FACE) 6 ile ölçülen daha uzun zincirleri korumada diğer yöntemlerden üstündür. Wang, Liu ve ark.7 da benzer bir yöntemi karaciğere uygulamaktadır. Glikojen yapısını anlamanın önemi, diyabette karaciğer glikojen alfa partiküllerinin "kırılgan" olduğunu, bunun da stabil alfa partiküllerine kıyasla daha hızlı bozulmaya neden olduğunu ve dolayısıyla muhtemelen kan şekeri kontrolünü etkilediğini gösteren yakın tarihli bir raporla gösterilmiştir. Bu sükroz gradyan bazlı izolasyon yöntemlerinin sınırlamaları, daha düşük bir sükroz konsantrasyonu ile hafifletilebilen süpernatanttaki glikojen kaybını ve kullanılan hafif koşullar nedeniyle glikojenin bir kısmının enzimatik bozunmasını içerir. İkincisi, kısa bir kaynatma adımıyla hafifletilir, ancak bu, ilişkili proteinleri bozar.
Son olarak, Jensen ve ark.8 tek iskelet kası liflerinde glikojen hücre altı dağılımını ve partikül boyutunu görüntülemek için transmisyon elektron mikroskobunun (TEM) kullanımını tanımlamaktadır. Bu yöntem, subsarkolemmal, intermiyofibriler ve intramiyofibriler glikojen havuzlarını araştırmak için mevcut olan tek yöntemdir ve çeşitli hayvanlardan alınan kas dokularında kullanılmıştır. Bazı hücre altı süreçler tercihen yakıt olarak glikojeni kullandığından, bu yakıt depolarının yerini karakterize etmek önemlidir. Ek olarak, bu yöntem, yorgunluğun sadece seçilmiş liflerde glikojene bağımlı olduğu egzersizde önemli olan farklı kas lifi tiplerinde glikojen metabolizmasını inceleme yeteneği sağlar. TEM yönteminin bir sınırlaması, küçük glikojen partiküllerinin tespit edilememesidir ve bu, özellikle kas kasılması gibi glikojenin parçalandığı koşullar için bir endişe kaynağıdır.
Sonuç olarak, bu yöntem koleksiyonu, glikojenin yapısını ve bu makromolekülün anabolizmasını ve katabolizmasını düzenleyen enzimleri araştırmak için kullanılan tekniklerin bir örneğini sağlar. Bu yöntemler, hem fizyolojik hem de patolojik durumlarda glikojen metabolizması anlayışımızı geliştirmede etkili olacaktır.