Biyomühendislik için On-Chip Oktanol Destekli Lipozom Montajı

Özet

Mevcut protokol, biyouyumlu lipozomlar üretmek için mikroakışkan bir teknik olan oktanol yardımlı lipozom montajını (OLA) tanımlamaktadır. OLA, verimli kapsülleme ile monodispersed, mikron boyutunda lipozomlar üretir ve anında çip üzerinde deneylere izin verir. Bu protokolün sentetik biyoloji ve sentetik hücre araştırmaları için özellikle uygun olması beklenmektedir.

Özet

Mikroakışkanlar, kontrollü ve yüksek verimli bir şekilde çeşitli türlerde damlacıklar ve veziküller üretmek için yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Lipozomlar, bir lipit çift katmanı ile çevrili sulu bir iç kısımdan oluşan basit hücresel taklitlerdir; Sentetik hücrelerin tasarlanmasında ve biyolojik hücrelerin temellerinin in vitro bir şekilde anlaşılmasında değerlidirler ve terapötik uygulamalar için kargo teslimatı gibi uygulamalı bilimler için önemlidirler. Bu makalede, monodispersed, mikron boyutunda, biyouyumlu lipozomlar üretmek için çip üzerinde mikroakışkan bir teknik olan oktanol yardımlı lipozom montajı (OLA) için ayrıntılı bir çalışma protokolü açıklanmaktadır. OLA, bir iç sulu (IA) fazın ve çevreleyen lipit taşıyan 1-oktanol fazının, yüzey aktif madde içeren dış sıvı akışları tarafından sıkıştırıldığı kabarcık üflemeye benzer şekilde işlev görür. Bu kolayca çıkıntılı oktanol cepleri ile çift emülsiyon damlacıkları üretir. Lipid çift katmanlı damlacık arayüzünde bir araya geldiğinde, cep kendiliğinden ayrılarak daha fazla manipülasyon ve deney için hazır olan unilamellar bir lipozoma yol açar. OLA, sabit lipozom üretimi (>10 Hz), biyomalzemelerin verimli kapsüllenmesi ve monodisperse lipozom popülasyonları gibi çeşitli avantajlar sağlar ve değerli biyolojiklerle çalışırken çok önemli olabilecek çok küçük numune hacimleri (~ 50 μL) gerektirir. Çalışma, laboratuvarda OLA teknolojisini kurmak için gerekli olan mikrofabrikasyon, yumuşak litografi ve yüzey pasivasyonu ile ilgili ayrıntıları içermektedir. İlke kanıtı sentetik biyoloji uygulaması, transmembran proton akısı yoluyla lipozomların içinde biyomoleküler kondensatların oluşumunu indükleyerek de gösterilmiştir. Beraberindeki bu video protokolünün, okuyucuların laboratuvarlarında OLA kurmalarını ve sorunlarını gidermelerini kolaylaştıracağı tahmin edilmektedir.

Giriş

Tüm hücrelerin fiziksel sınırları olarak bir plazma zarı vardır ve bu zar esasen amfifilik lipit moleküllerinin kendi kendine montajıyla oluşan bir lipit çift katmanı şeklinde bir iskeledir. Lipozomlar, biyolojik hücrelerin minimal sentetik karşılıklarıdır; Fosfolipitlerle çevrili sulu bir lümeni vardır, bu da sulu faza bakan hidrofilik kafa grupları ve içeriye gömülü hidrofobik kuyruklarla bir lipit çift katmanı oluşturur. Lipozomların stabilitesi, hidrofobik etkinin yanı sıra kutup grupları arasındaki hidrofilik, hidrofobik karbon kuyrukları arasındaki van der Waals kuvvetleri ve su molekülleri ile hidrofilik kafalar arasındaki hidrojen bağı tarafından yönetilir ^1,2. Lipid çift katmanlı sayısına, lipozomlar iki ana kategoriye ayrılabilir, yani tek bir çift katmanlı tek katmanlı unilamellar veziküller ve birden fazla çift katmandan oluşan çok katmanlı veziküller. Unilameller veziküller ayrıca boyutlarına göre sınıflandırılır. Tipik olarak küresel şekilli olan bu veziküller, küçük unilamellar veziküller (SUV, 30-100 nm çap), büyük unilamellar veziküller (LUV, 100-1.000 nm çap) ve son olarak dev unilamellar veziküller (GUV, >1.000 nm çap)^3,4 dahil olmak üzere çeşitli boyutlarda üretilebilir. Lipozomlar üretmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir ve bunlar toplu teknikler⁵ ve mikroakışkan teknikler⁶ olarak geniş bir şekilde kategorize edilebilir. Yaygın olarak uygulanan dökme teknikler arasında lipid film rehidrasyonu, elektroformasyon, ters emülsiyon transferi ve ekstrüzyon 7,8,9,10 bulunur. Bu teknikler nispeten basit ve etkilidir ve bunlar sentetik biyoloji topluluğunda yaygın kullanımlarının başlıca nedenleridir. Bununla birlikte, aynı zamanda, boyuttaki polidispersite, lamellerite üzerinde kontrol eksikliği ve düşük kapsülleme verimliliği ^7,11 ile ilgili büyük dezavantajlardan muzdariptirler. Sürekli damlacık arabirimi çapraz kapsülleme (cDICE)¹² ve damlacık çekimi ve boyut filtreleme (DSSF)¹³ gibi teknikler bu sınırlamaların bir dereceye kadar üstesinden gelir.

Mikroakışkan yaklaşımlar son on yılda ön plana çıkmaktadır. Mikroakışkan teknolojisi, karakteristik laminer akış ve difüzyon ağırlıklı kütle transferi sayesinde kullanıcı tanımlı mikrokanallar içindeki sıvı akışlarını manipüle etmek için kontrol edilebilir bir ortam sağlar. Ortaya çıkan çip üzerinde laboratuvar cihazları, moleküllerin mekansal zamansal kontrolü için önemli ölçüde azaltılmış numune hacimleri ve çoklama yetenekleri ile benzersiz olanaklar sunar¹⁴. Lipozomları yapmak için darbeli püskürtme 15, çift emülsiyon şablonlama 16, geçici membran ejeksiyonu 17, damlacık emülsiyon transferi 18 ve hidrodinamik odaklama ¹⁹ dahil olmak üzere çok sayıda mikroakışkan yöntem geliştirilmiştir. Bu teknikler, yüksek kapsülleme verimliliği ve yüksek verime sahip monodispersed, unilamellar, hücre büyüklüğünde lipozomlar üretir.

Bu makalede, hidrodinamik sıkıştırma ve ardından çözücü ıslatma mekanizması^20'ye dayanan çip üstü mikroakışkan bir yöntem olan oktanol yardımlı lipozom montajı (OLA) prosedürü detaylandırılmıştır (Şekil 1). OLA'nın çalışmasını kabarcık üfleme işlemiyle ilişkilendirebilirsiniz. Altı yönlü bir kavşak, iç sulu (IA) fazı, iki lipit taşıyan organik (LO) akışı ve iki yüzey aktif madde içeren dış sulu (OA) akışını tek bir noktada odaklar. Bu, su içinde su (lipitler + oktanol) içinde çift emülsiyon damlacıkları ile sonuçlanır. Bu damlacıklar aşağı doğru akarken, ara yüzey enerjisinin en aza indirilmesi, harici kesme akışı ve kanal duvarları ile etkileşim, çözücü cebi ayrıldıkça arayüzde bir lipit çift katmanının oluşmasına yol açar, böylece unilamellar lipozomlar oluşur. Oktanol cebinin boyutuna bağlı olarak, ıslatma işlemi onlarca saniye ila birkaç dakika sürebilir. Çıkış kanalının sonunda, daha az yoğun oktanol damlacıkları yüzeye yüzerken, daha ağır lipozomlar (daha yoğun kapsüllenmiş bir çözelti nedeniyle) görselleştirme odasının dibine deney için hazır olarak batar. Temsili bir deney olarak, lipozomların içindeki sıvı-sıvı faz ayırma işlemi (LLPS) gösterilmiştir. Bunun için gerekli bileşenler, LLPS'yi önleyen asidik bir pH'ta lipozomların içinde kapsüllenir. Harici olarak bir pH değişimini ve dolayısıyla bir transmembran proton akısını tetikleyerek, lipozomların içinde fazla ayrılmış kondens damlacıkları oluşur. Bu, OLA sisteminin etkili kapsülleme ve işleme yeteneklerini vurgular.

Protokol

1. Ana gofret imalatı

1. 4 inç (10 cm) çapında temiz silikon gofret alın (bkz. Toz parçacıklarını gidermek için basınçlı hava kullanarak daha fazla temizleyin.
2. Gofreti bir spin kaplayıcı üzerine monte edin ve gofretin ortasına ~ 5 mL'lik negatif bir fotorezisti (bakınız Malzeme Tablosu) yavaşça dağıtın. Hava kabarcıklarından kaçınmaya çalışın, çünkü gofretin çıkış yönündeki baskı işlemine müdahale edebilirler.
3. 10 μm kalınlığında bir fotorezistli tabaka elde etmek için, gofreti ilk yayılma için 100 rpm/s ivmelenme ile 30 s boyunca 500 rpm'de spin ile kaplayın, ardından 500 rpm/s ivmelenme ile 3.000 rpm'de 60 sn spin yapın. Farklı bir kalınlık istenmesi durumunda, eğirme parametrelerini üreticinin talimatlarına göre değiştirin.
4. Gofreti bir ısıtma plakasında 65 ° C'de 2 dakika ve daha sonra 95 ° C'de 5 dakika pişirin.
5. Gofret soğuduktan sonra, gofreti doğrudan yazma optik litografi makinesinin baskı odasına monte edin (bkz. Malzeme Tablosu) ve OLA tasarımını (Şekil 2A, Ek Kodlama Dosyası 1) yazılıma besleyin.
   NOT: OLA tasarımı temel olarak iki AE kanalı, iki LO kanalı ve bir IA kanalından oluşur ve bunlar bir post-prodüksiyon kanalı olarak devam eden ve deneysel kuyuda (EW) sona eren altı yönlü bir kavşak oluşturmak üzere birleşir.
6. OLA tasarımlarını kaplanmış gofret üzerine UV lazer kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu) 300 mJ/^cm2'lik bir dozda yazdırın.
7. Tasarım basıldıktan sonra, gofreti 65 ° C'de 1 dakika, ardından 95 ° C'de 3 dakika pişirin.
8. Bu noktada, yazdırılan aygıtın anahattının gofret üzerinde göründüğünden ve çıplak gözle görülebildiğinden emin olun. Kürlenmemiş fotodirenci yıkamak için, gofreti geliştirici çözeltisini içeren bir cam beher içine daldırın (bkz.
   NOT: Aşırı geliştirici muamelesi tasarım çözünürlüğünü etkileyebilir.
9. Gofreti sırayla aseton, izopropanol ve deiyonize (DI) su ile ve son olarak bir üfleme tabancası kullanarak basınçlı hava / N₂ ile yıkayın.
10. Basılı tasarımın gofret yüzeyine sıkıca tutturulduğundan ve çıkış yönündeki imalat sürecinde çıkmadığından emin olmak için gofreti 150 ° C'de 30 dakika boyunca sert bir şekilde pişirin. Ana gofret daha sonra kullanıma hazırdır (Şekil 2B).

2. Mikroakışkan cihazın hazırlanması

1. Ana gofreti kare bir alüminyum parçasına yerleştirin ve alüminyum folyoyu gofret etrafına sararak iyi bir yapı oluşturun (Şekil 2C).
2. 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 40 g polidimetilsiloksan (PDMS) ve 4 g kürleme maddesi (10:1, ağırlık oranı, Malzeme Tablosuna bakınız) ölçün ve 2-3 dakika boyunca bir spatula veya pipet ucu kullanarak kuvvetlice karıştırın.
3. PDMS ve kürleme maddesinin kuvvetli bir şekilde karıştırılması, karışımın içindeki hava kabarcıklarını hapseder. Büyük hava kabarcıklarının çoğunu çıkarmak için tüpü 2-3 dakika boyunca 100 x g'de döndürün.
4. Adım 2.3'te hazırlanan karışımın yaklaşık 15-20 g'ını ana gofret üzerine dökün ve bir kurutucu kullanarak gazı temizleyin. PDMS kaplı cam kızaklar yapmak için fazla karışımı kaydedin (adım 3).
5. Düzeneği 70 ° C'de bir fırında en az 2 saat boyunca inkübe edin.
6. Ana gofreti fırından çıkarın ve soğumaya bırakın. Katılaşmış PDMS bloğunu çıkarmak için, alüminyum folyoyu çıkarın ve PDMS bloğunu gofret kenarından dikkatlice çıkarın.
   NOT: Gofret kırılgandır ve kırılabilir, bu nedenle bu işlemi dikkatli bir şekilde yapmak önemlidir.
7. PDMS bloğu çıkarıldıktan sonra, desenli yapıyı yukarı bakacak şekilde tutun ve keskin bir bıçak veya neşter kullanarak, her biri tek bir mikroakışkan cihaz içeren ayrı ayrı PDMS bloklarını kesin.
8. PDMS bloğunu karanlık bir yüzeye yerleştirin ve ışık yönünü ayarlayın (bunun için bir masa lambası kullanışlıdır), böylece oyulmuş kanallar parlak ve sonuç olarak görünür olur. Sırasıyla 0,5 mm ve 3 mm çapında biyopsi zımbaları kullanarak girişlerde ve çıkış kanalında delikler açın (bkz.
   NOT: PDMS'de daha sonra sızıntıya neden olabilecek çatlakları önlemek için keskin bir biyopsi zımbası kullanın. Biyopsi zımbasını PDMS bloğundan yavaşça itin ve tamamen içinden geçtiğinden emin olun. Biyopsi yumruğunu çıkarmak için, alternatif yönlerde döndürürken yavaşça geri çekin. Oyulmuş OLA tasarımına sahip PDMS bloğu artık PDMS kaplı cam slayta bağlanmaya hazırdır.

3. PDMS kaplı cam slaytın yapılması

1. Şeffaf bir cam kapak kapağı alın, cam slaytın ortasına yaklaşık 0,5 mL PDMS (adım 2.4'te fazla hazırlanmış) dökün ve cam slaytı hafifçe eğerek kapak kapağı boyunca yayın ve PDMS ile cam slaytın tamamen kaplanmasını sağlayın.
2. Cam sürgüyü sıkma kaplayıcısına monte edin, merkezi olarak yerleştirildiğinden emin olun (kızağın ortası basınç milinin merkezi ile örtüşecek şekilde) ve cam sürgüyü 15 s için 500 rpm'de (100 rpm / s'lik bir artışla) ve daha sonra 30 s için 1.000 rpm'de (500 rpm / s'lik bir artışla) döndürün.
3. PDMS kaplı cam sürgüyü (kaplanmış tarafı yukarı bakacak şekilde) kapalı bir Petri kabında PDMS bloğu (1 cm x 1 cm) gibi yükseltilmiş bir platforma yerleştirin ve 70 ° C'de 2 saat pişirin.

4. Mikroakışkan cihazın bağlanması

1. PDMS bloğunu (2. adımda hazırlanan) ticari olarak temin edilebilen skoç bandı (bkz. Malzeme Tablosu) iki kez yapıştırıp çıkararak temizleyin. Temizlenen tarafı kullanana kadar yukarı bakacak şekilde tuttuğunuzdan emin olun.
2. PDMS kaplı cam sürgüyü basınçlı hava/N₂ ile bir üfleme tabancası kullanarak temizleyin ve temiz tarafı yukarı bakacak şekilde tutun.
3. PDMS bloğunu (oyulmuş kanallar yukarı bakacak şekilde) ve PDMS kaplı cam sürgüyü (kaplanmış tarafı yukarı bakacak şekilde) plazma temizleyicinin vakum odasına yerleştirin (bkz.
4. Vakumu açın ve yüzeyleri etkinleştirmek için içeriği 15 s boyunca 12 MHz (RF modu yüksek) radyo frekansında hava plazmasına maruz bırakın. Oksijen plazması pembemsi bir renk tonu şeklinde görülebilir.
5. Plazma işleminden hemen sonra, PDMS kaplı cam slaydı PDMS tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir yüzeye yerleştirin. PDMS bloğunu, mikroakışkan desen şimdi PDMS kaplı cam kızağa bakacak şekilde yavaşça yerleştirin ve yapışmalarını sağlayın (Şekil 2D).
   NOT: Cihazda sıkışan havanın giderilmesi, tam bir yapışma sağlamak için çok önemlidir.
6. Yapıştırılmış cihazları 70 °C'de 2 saat pişirin.

5. Mikroakışkan cihazın yüzey fonksiyonelleştirilmesi

NOT: Yüzey fonksiyonelleştirmeden önce, basınç pompasını üreticinin protokolüne göre kalibre etmek (bakınız Malzeme Tablosu) ve boruyu mikroakışkan cihaza bağlamak için monte etmek önemlidir.

1. Mikroakışkan cihazın basınç pompalarına bağlanması
   1. Basınçla çalışan akış kontrolörünü harici bir basınç kaynağına (6 bar'a kadar) bağlayın. En az dört bağımsız hava basıncı kanalı gereklidir: 0-2 bar'lık üç ayrı modül ve -0,9-4 bar'lık bir modül.
   2. Basınç pompasını üreticinin protokolüne göre kalibre edin (bkz.
   3. Boruyu (OD x ID'de 1/16) yaklaşık 20 cm uzunluğunda dört eşit boyutlu parçaya bölün.
   4. Her parçanın bir ucuna 23 G paslanmaz çelik 90° bükülmüş konektörler takın (bkz. Bu uç daha sonra mikroakışkan cihazın üç girişine (OA, LO ve IA) yerleştirilir ve dördüncüsü fazla çözeltiyi çıkarmak için kullanılır (adım 5.2.5).
   5. Borunun diğer ucunu mikroakışkan rezervuar standına yerleştirin ve mikroakışkan bağlantı parçaları kullanarak kapatın, borunun rezervuarın dibine dokunacak kadar uzun olmasını sağlayın (1,5 mL tüpler , bkz. Bu, PVA tedavisi / lipozom üretimi sırasında istenmeyen hava kabarcıklarının mikroakışkan cihaza girmesini önler.
2. Çıkış kanalının PVA arıtımı
   NOT: Lipozom üretiminden önce, cihazın üretim kavşağının çıkış yönünde kısmen hidrofilik hale getirilmesi çok önemlidir. Bu, bu kanalların% 5 (w / v) polivinil alkol (PVA) çözeltisi ile muamele edilmesiyle yapılır. PVA çözeltisi, PVA tozunun (bakınız Malzeme Tablosu) 80 ° C'de suda 3 saat boyunca manyetik bir karıştırıcı kullanılarak sürekli karıştırılarak çözülmesiyle hazırlanır. Çözeltiyi yüzey işlemi için kullanmadan önce filtreleyin. Cihazın bağlanmasından hemen sonra, mikroakışkan kanallar plazma kaynaklı yüzey aktivasyonu nedeniyle hidrofiliktir ve yavaş yavaş tekrar hidrofobik hale gelirler. PVA tedavisine başlamadan önce pişirmeden sonra (adım 4.6) 2 saat beklemeniz önerilir.
   1. 200 μL'lik %5'lik PVA çözeltisini 1,5 mL'lik bir tüpe dağıtın ve mikroakışkan rezervuar standına bağlayın. Boruyu (adım 5.1.3'te belirtilen), bir ucu PVA çözeltisine batırılacak ve diğer ucu mikroakışkan cihazın OA kanalının girişine bağlanacak şekilde yerleştirin.
      NOT: Daha düşük bir PVA konsantrasyonu, standart altı yüzey fonksiyonelleşmesine yol açabilir.
   2. Yukarıdaki adımı PVA olmadan tekrarlayın (boş 1,5 mL tüp) ve LO ve IA kanallarına bağlayın.
   3. PVA çözeltisini OA kanallarında akıtmak için OA fazının basıncını 100 mbar'a yükseltin. PVA çözeltisinin bu kanallar içindeki geri akışını önlemek için IA ve LO fazlarının basınçlarını 120 mbar'a yükseltin (Şekil 2E).
      NOT: Gerekirse, menisküsü üretim kavşağında sabit tutmak için bireysel kanalların basınçlarını ayarlayın.
   4. PVA çözeltisini yaklaşık 5 dakika boyunca bu şekilde akıtarak çıkış kanalının tam olarak çalışmasını sağlayın.
   5. PVA çözeltisini çıkarmak için, boruyu OA girişinden ayırın ve LO ve IA kanallarındaki basıncı derhal 2 bar'a yükseltin. Aynı zamanda, negatif basınç kanalına (-900 mbar) bağlı bir boru kullanın, fazla PVA'yı önce çıkış kanalından ve ardından OA girişinden çıkarın (Şekil 2F).
   6. Cihazı 120 ° C'de 15 dakika pişirin ve kullanmadan önce soğumaya bırakın. Cihaz ortam koşullarında en az 1 ay saklanabilir.
      NOT: Plazma işleminden sonra tedavi edilmemiş PDMS'nin hidrofobikliğini geri kazanmasını sağlamak için OLA ile devam etmeden önce 1 gün (oda sıcaklığında) beklemeniz önerilir.

6. Oktanol yardımlı lipozom tertibatı (OLA)

1. Lipid stoğunun hazırlanması
   NOT: Burada, 1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) ve 1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-(lissamin rhodamine B sülfonil) (Liss Rhod PE) lipitlerinin bir karışımı (bakınız Malzeme Tablosu) örnek olarak kullanılmıştır; Kullanıcılar ihtiyaç duydukları lipit bileşimini benzer şekilde hazırlamalıdır.
   1. Ayrı cam şırıngalar kullanarak yuvarlak tabanlı bir şişeye 76 μL DOPC (25 mg / mL) ve 16,6 μL Liss Rhod PE (1 mg / mL) dağıtın.
   2. Yuvarlak tabanlı şişeyi dik tutun ve kloroformu buharlaştırmak ve şişenin altında kurutulmuş bir lipit filmi oluşturmak için yumuşak bir azot akışı sağlamak için sıkıştırılmış bir N₂ üfleme tabancası kullanın.
   3. Kalan kloroformu çıkarmak için şişeyi kurutucuya en az 2 saat boyunca sürekli bir vakum altında yerleştirin.
   4. Yuvarlak tabanlı şişeye 100 μL etanol ekleyin, ardından lipitlerin %10 (w/v) lipit stoğu oluşturacak şekilde çözünmesini sağlamak için nazik pipetleme veya çalkalama yapın.
      NOT: Belirli bir lipit bileşiminin etanol içinde tamamen çözünmemesi durumunda, kloroform hacmini mümkün olduğunca küçük tutarak bir etanol/kloroform karışımı kullanın.
   5. Çözeltiyi koyu cam bir şişeye pipetleyin. Havayı inert bir atmosferle değiştirmek için bir üfleme tabancası kullanarak şişeyi azotla yavaşça yıkayın. Kapağı parafin filmle kapatın ve -20 ° C'de saklayın.
      NOT: Stok çözeltisi birkaç aya kadar kullanılabilir. Flakon her açıldığında, havayı yavaşça azotla değiştirin ve parafin filmli kapakla yeniden kapatın.
2. OLA çözümlerini hazırlama
   1. Vazgeçilmez bileşenlerin stok çözümlerini yapın: 20 mM dekstran (Mw 6,000); % 60 (v / v) gliserol; tercih edilen bir tampon. Bu durumda, 5x fosfat tamponlu salin (0.68 M NaCl, 13.5 mM KCl, 50 mM Na 2 HPO 4_, 9 mM KH₂PO 4; pH_7.4) hazırlanmıştır (bkz.
      NOT: Saf gliserol oldukça viskoz olduğundan, etkili pipetleme için pipet ucunun ucundaki küçük bir parçanın eğimli bir şekilde kesilmesi önerilir.
   2. 100 μL IA, OA ve çıkış çözeltisi (ES, EW'yi doldurmak için istenen çözelti) numuneleri hazırlayın. Görselleştirme kolaylığı için, bu özel durumda IA çözeltisine sarı floresan proteini (YFP) eklenmiştir. Kapsüllenmiş bileşenlerin ozmolaritesini hesaplayarak ve gerekirse OA'ya uygun miktarda şeker veya tuz ekleyerek IA ve OA arasındaki ozmotik dengeyi kontrol edin. Bu, üretim sırasında lipozomların patlamasını veya büzülmesini önlemek için yapılır.
      NOT: Üç aşamanın son bileşimleri aşağıdaki gibidir:
      IA: %15 gliserol, 5 mM dekstran (Mw 6.000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA:% 15 gliserol,% 5 F68 yüzey aktif madde, 1x PBS
      ES:% 15 gliserol, 1x PBS
      Daha düşük bir F68 yüzey aktif madde konsantrasyonu, çift emülsiyonların oluşumunu olumsuz yönde etkiler.
   3. 4 μL stok lipiti 76 μL 1-oktanol içine pipetleyerek 80 μL LO fazını hazırlayın (bkz. DOPC'nin nihai konsantrasyonu 5 mg / mL'dir.
   4. Mikroakışkan deneylere devam etmeden önce büyük agregaları çıkarmak için numuneleri 700 x g'de 60 s boyunca santrifüj edin. Bu, herhangi bir belirgin tıkanma faktörünün mikroakışkan çipe girmesini önler.
3. Lipozom üretimi
   1. Çözeltileri (IA, LO, OA) üç adet 1,5 mL tüpe dağıtın, birleştirin (adım 5.1'de belirtildiği gibi) ve PVA ile muamele edilmiş mikroakışkan çipe bağlayın (adım 5.2.6).
   2. Üç kanala pozitif basınç uygulayın: IA ve LO kanallarında ~100 mbar ve AE kanalında ~200 mbar.
      NOT: OA basıncı diğerlerinden daha yüksek olduğundan, AE çözümü EW'ye ilk ulaşan çözüm olacaktır; Bu şiddetle tavsiye edilir.
   3. OA çözümü EW'ye ulaştığında, OA basıncını 100 mbar'a düşürün ve LO'yu 200 mbar'a yükseltin.  Üretim kavşağına ulaşan LO çözümü, LO kanallarından yer değiştiren hava nedeniyle muhtemelen hava kabarcıklarına neden olacaktır. Hava kabarcıkları EW'ye dağıtıldıktan sonra, LO basıncını 100 mbar'a ayarlayın. Son olarak, IA basıncını 200 mbar'a yükseltin ve IA kanalındaki tüm hava alınana kadar bekleyin. Bu nedenle, üç fazın birleşme noktasına ideal varış sırası OA, LO ve IA'dır.
   4. Havayı üç kanaldan çıkardıktan sonra, tüm kanal basınçlarını 50 mbar'a ayarlayın ve çıkış odasına 10 μL ES pipet yapın. ES'yi pipetledikten sonra, buharlaşmayı önlemek için çıkış deliğine bir kapak sürgüsü koyun. LO'nun geri itilmesi durumunda, LO basıncını kavşağa akmaya başlayana kadar 1 mbar'lık artışlarla kademeli olarak artırın.
   5. Her üç faz da kavşakta birlikte akmaya başladığında, çift emülsiyon üretiminin başladığından emin olun ve kalitesine göre ayarlayın (Şekil 3A-C). Kanaldaki istenmeyen bir tıkanıklığı ortadan kaldırmak için basınç değiştirilmediği sürece basınçları aniden değiştirmek yerine kademeli olarak (0,1-1 mbar'lık adımlar) değiştirin.
      NOT: Ayarlanacak kanallar kavşakta neler olup bittiğine bağlıdır. Örneğin, emülsiyonlar çok büyükse IA'nın azaltılması gerekir; çift emülsiyonlar oluşursa ancak sıkışmak yerine patlarsa OA'nın arttırılması gerekir; ve oktanol cebi çok büyükse LO'nun azaltılması gerekir.
   6. Çift emülsiyon damlacıklarının aşağı yönde EW'ye akıp akmadığını kontrol edin. Aktıkça, oktanol cepleri gittikçe daha belirgin hale gelir ve sonunda lipozomlar oluşturarak sıkışır (Şekil 3D-F). Post prodüksiyon kanalının yeterince uzun olduğundan ve çift emülsiyonların göçünün ıslanma için yeterince yavaş olduğundan emin olun.
      NOT: İyi üretimden birkaç dakika sonra, lipozomlar ve oktanol damlacıkları post-prodüksiyon kanalından çıkacak ve EW'ye girecektir. Sonuç olarak, sudan daha az yoğun olan oktanol damlacıkları ES yüzeyine yüzer. IA'da dekstran ilavesi nedeniyle, lipozomlar çevrelerinden daha ağırdır ve gözlem ve daha fazla manipülasyon için hazır olan odanın dibine giderler.

Sonuçlar

Bu çalışma, temsili bir deney olarak lipozomlar içinde sıvı-sıvı faz ayırma (LLPS) işlemi yoluyla membransız kondensatların oluşumunu göstermektedir.

Numune hazırlama
IA, OA, ES ve yem çözeltisi (FS) aşağıdaki gibi hazırlanır:

IA: gliserol, 5 mM dekstran, 150 mM KCl, 5 mg/mL poli-L-lizin (PLL), 0,05 mg/mL poli-L-lizin-FITC etiketli (PLL-FITC), 8 mM adenozin trifosfat (ATP), 15 mM sitrat-HCl (pH 4)

OA: v/v gliserol, %5 w/v F68 ile, 150 mM KCl, 15 mM sitrat-HCl (pH 4)

ES: gliserol, 150 mM KCl, 15 mM sitrat-HCl (pH 4)

FS: gliserol, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)

Lipozomların içinde kondens oluşumu
Lipozomlarda LLPS fenomenini göstermek için pozitif yüklü poli-L-lizin (PLL) ve negatif yüklü çok değerli adenozin trifosfatın (ATP) pH'a duyarlı kompleks koaservasyonunun basit bir tahlili seçildi. Kapsülleme sırasında polilizin ve ATP'nin faz ayrımını önlemek için, çözeltinin pH'ı, ATP'nin nötr olduğu 4'te tutuldu. FS (pH 9'luk bir tampon) ekleyerek ES'nin pH'ını arttırmak, sonunda transmembran proton akısı nedeniyle lipozomların içindeki pH'ı arttırdı, ATP'yi negatif yüklü hale getirdi ve pozitif yüklü PLL²¹ ile faz ayrımını tetikledi (Şekil 4A). Yaklaşık 2 saatlik lipozom üretiminden sonra, IA ve LO basınçları kapatıldı. Kalan lipozomları gözlem odasına yavaşça akıtmak için OA kanal basıncı 100 mbar'da tutuldu. Kanaldaki tüm lipozomlar EW'de geri kazanıldıktan sonra, akışı durdurmak ve lipozomların hareket etmesini önlemek için basınçlar kapatıldı. Daha düşük bir pH'ta üretilen lipozomlar, lümenlerinde homojen bir floresan (kapsüllenmiş floresan PLL-FITC'den) gösterdi (Şekil 4B, D). Yüzeyde yüzen oktanol damlacıkları, daha sonraki pipetleme adımlarını etkilemelerini önlemek için üstten 5 μL çözeltiyi dikkatlice pipetleyerek uzaklaştırıldı. Daha sonra, EW'ye 10 μL FS tamponu eklendi, bu da kapsüllenmiş PLL ve ATP'nin faz ayrımını indükledi. Her lipozomdan homojen FITC floresansı yavaş yavaş farklı floresan kondens damlacıklarına dönüştü. Sonunda, bireysel damlacıklar, lipozomlar içinde serbestçe dağılan daha büyük bir kondens damlacığı halinde birleşti (Şekil 4C, E-G).

Şekil 1: OLA'nın montajını ve çalışmasını gösteren şematik. Basınç kontrolörü, dış sulu, oktanol içinde lipit ve iç sulu çözeltiler içeren rezervuarlara bağlanır. Rezervuarlara yerleştirilen tüpler, OLA cihazının ilgili girişlerine bağlanır. Üç kanaldaki uygun akışlar, su içinde su (oktanol içindeki lipit) çift emülsiyonlarının oluşumuna yol açar. Oluşan çift emülsiyonlar, oktanol ceplerinin lipozomlar oluşturmak için ayrıldığı çıkış kuyusuna göç eder. Oluşan lipozomlar, görselleştirme ve daha fazla deney için kuyunun dibinde toplanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: OLA çipinin hazırlanması (fotolitografi, mikrofabrikasyon, yüzey işleme). (A) Üç giriş, bir çıkış ve altı yönlü bir üretim kavşağı dahil olmak üzere OLA tasarımının temel özelliklerini gösteren dijital tasarım. (B) UV litografisi kullanılarak üretilen birden fazla OLA tasarımını gösteren ana gofret şeması. (C) Ana gofret üzerine dökülen, alüminyum folyodan iyi oluşturulmuş bir alana yerleştirilen ve 70 °C'de 2 saat boyunca pişirilerek kürlenen bir PDMS elastomeri. (D) OLA tasarımını içeren PDMS bloğunun PDMS kaplı bir cam slayta tutturulduğu oksijen plazma işlemi kullanılarak bağlanmış mikroakışkan bir cihaz. (E) Cihazı kısmen hidrofilik hale getirmek için imal edilen çipin yüzey işlevselliği. Bu, dış sulu kanaldan çıkış kanalına doğru 5 dakika boyunca% 5 w / v PVA akıtılarak yapılır. Diğer kanallardaki pozitif hava basıncı, PVA çözeltisinin bu kanallara girmesini engeller. (F) PVA, çıkış kanalına bir vakum uygulanarak uzaklaştırılır. Cihaz 120 °C'de 15 dakika pişirilir ve daha sonra kullanıma hazır hale getirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: OLA'nın verimli bir şekilde monodisperse çift emülsiyonlar ve nihayetinde mükemmel kapsülleme ile lipozomlar ürettiği gösterilmiştir. (A) Çift emülsiyon damlacıklarının hızlı oluşumunu gösteren parlak alan görüntüsü. (B) Floresan lipit kanalı, kısmi ıslanma nedeniyle bir oktanol cebinin oluşumunu gösterir. Oktanol içindeki lipid fazı, 1.000: 1 oranında DOPC (5 mg / mL) ve Lis Rhod PE karışımı içeriyordu. (C) Sarı floresan proteinin (YFP) kapsüllenmesini gösteren iç sulu kanal. (A-C) içindeki iç kısımlar, ilgili panellerin temsili yakınlaştırılmış görünümlerini gösterir (ölçek çubukları = 10 μm). (D-F) Bir lipozom oluşturan çıkış kanalındaki oktanol cebinin ıslatılması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Lipozomlar içinde pLL/ATP'nin pH ile tetiklenen sıvı-sıvı faz ayrımı. (A) Lipozom içinde kapsüllenmiş homojen pLL ve ATP çözeltisinin (solda) fazla ayrılmış pLL/ATP koakervatlarına (sağda) pH bağımlı geçişinin şeması. Lipozomdaki ilk asidik ortam, ATP'nin moleküler yükünü nötr hale getirir ve koaservasyonu inhibe eder. Lipozomların içindeki pH, dışarıdan uygulanan pH artışı ile dengelendiğinde, ATP negatif bir yük kazanır ve koaservasyonu tetikler. (B-C) Çizgi grafikler (sırasıyla [D] ve [G] panellerindeki noktalı çizgilere karşılık gelir) pLL (yeşil kanal) ve membranın (kırmızı kanal) uzamsal dağılımını gösterir. (D-G) Lipozomlar içinde pLL/ATP coaservatlarının oluşumunu gösteren hızlandırılmış görüntüler. Temel bir tamponun harici ilavesi, lipozomların içindeki pH seviyesini dakikalar boyunca yükseltir ve koaservasyonu başlatır. t = 0 dakika, ilk coacervation olayının meydana gelmesinden hemen önceki zamanı ifade eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 1: OLA tasarımının CAD dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Hücresel karmaşıklık, bir bütün olarak incelendiğinde canlı hücreleri anlamayı son derece zorlaştırır. Temel bileşenleri in vitro olarak yeniden yapılandırarak hücrelerin fazlalığını ve birbirine bağlanabilirliğini azaltmak, biyolojik sistemleri daha iyi anlamamız ve biyoteknolojik uygulamalar için yapay hücresel taklitler yaratmamız için gereklidir^22,23,24. Lipozomlar, hücresel olayları anlamak için mükemmel bir minimal sistem görevi görür. Bu fenomenlerin kapsamlı olmayan bir listesi, sitoiskelet dinamiklerini ve sonuçta ortaya çıkan membran deformasyonlarını 25,26, biyomoleküler kondensatların mekansal zamansal regülasyonunu^27,28 ve membran²⁹ ile etkileşimlerini, hücresiz transkripsiyon-translasyon sistemleri 30^, hücresiz lipit sentezi 31 ve proteinlerin evrimi ³² dahil olmak üzere çok çeşitli biyomoleküllerin ^{kapsüllenmesini,33,34}. Lipozomlar ayrıca ilaç dağıtımı için taşıyıcı olarak yaygın olarak kullanılmaktadır ve klinik kullanım için Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından onaylanmıştır¹¹. Lipozomlar ve lipit bazlı nanopartiküller, son COVID-19 aşısı³⁵ gibi mRNA aşıları da dahil olmak üzere ilaç dağıtımı için taşıyıcı olarak kullanılmaktadır.

Bu çalışmada, çip üzerinde lipozomlar üretmek için OLA tekniğini gerçekleştirmek için fotolitografi, mikroakışkan montaj ve yüzey işlevselliği hakkında ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır (Şekil 1 ve Şekil 3). OLA kullanılarak üretilen lipozomlar monodisperse (varyasyon katsayısı: ortalamanın% 4-11'i) ve biyolojik hücre büyüklüğü aralığında (tipik olarak 5-50 μm çapında) ve iç ve dış sulu kanalların uygun akış hızları kullanılarak ayarlanabilirler³⁶. Örneğin, Şekil 1'de görülen lipozom popülasyonu 23.3 μm ± 1.8 μm (n = 50) boyut dağılımına sahiptir. 10-30 Hz'lik tipik üretim hızları ile, oluşan lipozomlar, daha önce membrana tek bir çift katmanlı spesifik transmembran proteini olan alfa-hemolizin^36'nın yerleştirilmesiyle ve ayrıca ditionat-ağartma testi^37'nin kullanılmasıyla doğrulandığı gibi, unilamellardır. OLA ayrıca çok çeşitli lipit bileşimleriyle uyumludur ve kullanıcıya lipit seçiminde esneklik sunar. Önemli olarak, başlangıçta kullanılan lipit bileşimi, nihai lipozom bileşimi^38'e yansır.

Nispeten yeni bir teknoloji olarak, OLA'yı geliştirmek için daha fazla kapsam var. Örneğin, PVA kullanarak yüzey işlevselleştirme çok önemlidir, ancak gerçekleştirilmesi sıkıcıdır. Cihazı yüzeysel olarak işlevselleştirmenin daha kolay ve basit bir yolu, çip üretim süresini ve çipten çipe değişkenliği önemli ölçüde azaltacaktır. Pluronic F68 yüzey aktif madde, çift emülsiyonları başlangıçta stabilize etmek için dış sulu fazda önemli bir bileşendir; Bununla birlikte, kullanımı bazı durumlarda kısıtlayıcı olabilir. Pluronic F68'in daha biyouyumlu bir yüzey aktif madde ile değiştirilmesi veya yüzey aktif maddenin tamamen uzaklaştırılması, sistemin çok yönlülüğünü artırabilir. Çıkış kanalında üretilen çift emülsiyonların göçü sırasında, kayma nedeniyle patlayabilirler. Çift emülsiyon stabilitesini ve oktanol cep ayrımını iyileştirmek için OLA tasarımını yükseltmek, böylece verimi artırabilir. Bununla birlikte, OLA'nın esas olarak verimli kapsülleme, monodisperse ve unilamellar lipozomlar ve kontrollü çip üstü deneyleri içeren çeşitli avantajları vardır.

OLA, lipozomların büyümesi ve bölünmesi³⁹, sıvı-sıvı faz ayırma süreci²⁷ ve membran²¹ ile etkileşiminin incelenmesi ve lipozomlarda bakteriyel büyüme biyoürün oluşumunun anlaşılması dahil olmak üzere çeşitli çalışmalarda kullanılmış ve uyarlanmıştır⁴⁰. OLA bazlı yüksek verimli analizler ayrıca membran 41 boyunca iyon taşınımını ve lipit çift katmanlı³⁷ boyunca ilaç geçirgenliğini anlamak, terapötik amaçlar için bir ilaç dağıtım sistemi olarak 42, antimikrobiyallerin membran⁴³ üzerindeki etkisini incelemek ve sıvı kristalleri kapsüllemek için bir araç olarak kullanılmaktadır ⁴⁴. OLA teknolojisinin geniş uygulama yelpazesine ek olarak, OLA'nın belirli amaçlara uygun değiştirilmiş sürümleri geliştirilmektedir 45,46,47,48,49,50. Genel olarak, artıları ve eksileri göz önünde bulundurarak, OLA'nın sentetik biyoloji için çok yönlü bir platform olduğuna inanıyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1-Oktanol	Sigma-Aldrich	No. 297887
1.5 mL tüpler	Fisher scientific	10451043	Eppendorf 3810X Polipropilen mikrosantrifüj tüpleri
ATP	Sigma-Aldrich	No. A2383
Biyopsi yumruğu	Darwin mikroakışkanlar	PT-T983-05	0.5 mm ve 3 mm çap
Sitrat bazlı	Sigma-Aldrich	No. 71405
Dextran	Sigma-Aldrich	No. 31388	Mr ~ 6.000
Doğrudan yazma optik litografi makinesi	Durham Magneto Optics Ltd	MicroWriter ML3 Bebek	kurulumu ve yazılımı
DOPC lipid	Avanti	SKU:850375C
F68	Sigma-Aldrich	No. 24040032
Cam kapak kayması	Corning	#1, 24 x 40 mm
Gliserol	Sigma-Aldrich	No. G2025
Hidroklorik asit	Thermo Scientific Acros	No. 124630010
Liss Rhod PE lipid	Avanti	SKU: 810150C
Parafilm	Sigma-Aldrich	No. P7793
Photoresist	Mikro direnç teknolojisi GmbH	EpoCore 10
Photoresist geliştirici	micro resist technology GmbH	mr-Dev 600
Plazma temizleyici	Harrick plazma	PDC-32G
Polidimetilsiloksan	Dow	Sylgard 184	PDMS ve kürleme maddesi
Poly-L-lizin	Sigma-Aldrich	No. P7890
Poli-L-lizin– FITC Etiketli	Sigma-Aldrich	No. P3543
Polivinil alkol	Sigma-Aldrich	no. P8136	moleküler ağırlık 30.000 < 70.000, %87 &; % 90 hidrolize
Basınç kontrolörü	Elveflow	OBK1 Mk3 +	Akış kontrolörü
Scotch bant	Sihirli Bant Görünmez Mat Bant
Silikon gofret	Silikon Malzemeler	0620R16002
Spin kaplayıcı ve nbsp;	Laurell Technologies Corporation Modeli	WS-650MZ-23NPP
Paslanmaz Çelik 90 derece; Bükülmüş PDMS Kuplörleri	Darwin mikroakışkanları	PN-BEN-23G
Tris-base	Sigma-Aldrich	No. 252859
Tygon boru	Darwin mikroakışkanları	1/16 "OD x 0.02" ID
UV lazer ve nbsp;			365 nm dalga boyu