Yöntem makalesi

Floresan Aktif Çekirdek Ayıklama Kullanarak Yağ Dokuları ile Adiposit-Spesifik ATAC-Seq

DOI:

10.3791/65033

⸱

17 Mart 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Indiana University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nükleer floresan etiketlemeli transgenik muhabir farelerden izole edilen yağ dokuları ile çekirdek sıralama kullanarak özellikle adipositler üzerinde yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için bir test protokolü sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek verimli dizileme (ATAC-seq) ile transpozaz erişilebilir kromatin için test, genom çapında kromatin erişilebilirlik profillemesini sağlayan sağlam bir tekniktir. Bu teknik, bir dizi biyolojik süreçte gen ekspresyonunun düzenleyici mekanizmalarını anlamak için yararlı olmuştur. ATAC-seq farklı numune tipleri için modifiye edilmiş olmasına rağmen, yağ dokuları için ATAC-seq yöntemlerinin etkili modifikasyonları olmamıştır. Yağ dokuları ile ilgili zorluklar arasında karmaşık hücresel heterojenite, büyük lipit içeriği ve yüksek mitokondriyal kontaminasyon sayılabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, transgenik muhabir Nuclear etiketleme ve Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) faresinden yağ dokuları ile floresan aktive edilmiş çekirdek sıralama kullanarak adiposit spesifik ATAC-seq sağlayan bir protokol geliştirdik. Bu protokol, çekirdek girişi ve reaktiflerin miktarını azaltırken minimum boşa harcanan sıralama okumalarıyla yüksek kaliteli veriler üretir. Bu yazıda, fare yağ dokularından izole edilen adiposit çekirdeklerinin kullanımı için doğrulanmış ATAC-seq yöntemi için ayrıntılı adım adım talimatlar verilmektedir. Bu protokol, adipositlerdeki kromatin dinamiklerinin çeşitli biyolojik stimülasyonlar üzerinde araştırılmasına yardımcı olacak ve bu da yeni biyolojik anlayışlara izin verecektir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fazla enerjiyi lipit molekülleri şeklinde depolamak için uzmanlaşmış olan yağ dokusu, metabolik düzenleme için kilit bir organdır. Adiposit oluşumunun ve bakımının sıkı kontrolü, yağ dokusu fonksiyonu ve tüm vücut enerji homeostazı için hayati öneme sahiptir1. Birçok transkripsiyonel düzenleyici, adiposit farklılaşmasının, plastisitesinin ve fonksiyonunun kontrolünde kritik bir rol oynamaktadır; Bu düzenleyicilerin bazıları insanlarda metabolik bozukluklarla ilişkilidir 2,3. Gen ekspresyonu ve epigenomik analiz için yüksek verimli dizileme tekniklerindeki son gelişmeler, adiposit biyolo....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan bakımı ve deneyleri, Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan prosedürlere göre gerçekleştirildi.

1. Deneye başlamadan önceki hazırlıklar

  1. Doku hazırlama
    1. Adiposit çekirdeği etiketlemesi için, hem Adipoq-Cre hem de NuTRAP için hemizygot olan Adipoq-NuTRAP fareleri üretmek için NuTRAP farelerini adiposit spesifik adiponektin-Cre hatları (Adipoq-Cre) ile çaprazlayın.
    2. Daha önce tarif edildiği gibi Adipoq-NuTRAP farelerinden ilgilenilen yağ dokularını diseke edin14.
    3. Dokuları sıvı azot içinde çırpın ve ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu ATAC-seq protokolünü kullanarak yağ dokusunu analiz etmek için, chow diyetleriyle beslenen Adipoq-NuTRAP fareleri ürettik; daha sonra epididim beyaz yağ dokusundan (eWAT), inguinal beyaz yağ dokusundan (iWAT) ve kahverengi yağ dokusundan (BAT) akım sitometrisi kullanarak adiposit çekirdeklerini izole ettik. İzole edilen çekirdekler etiketleme için kullanıldı, bunu yukarıda açıklandığı gibi DNA saflaştırma, PCR amplifikasyonu, kalite kontrol adımları, dizileme ve veri analizi izledi. Bu temsili deneyin amacı, farklı ya.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, adiposit spesifik kromatin erişilebilirliğini in vivo olarak değerlendirmek için optimize edilmiş bir ATAC-seq protokolü sunduk. Adipoq-NuTRAP fareyi kullanan bu ATAC-seq protokolü, adiposite özgü kromatin erişilebilirlik profillerini başarıyla oluşturdu. Başarılı ve tekrarlanabilir ATAC-seq deneyleri için en kritik faktör çekirdek kalitesidir. Disseke edilmiş yağ dokularının sıvı azot içinde derhal yapışıp dondurulması ve kullanıma kadar çözülmeden -80 ° C'de güvenli bir şekilde saklanması çok önemli.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makalede açıklanan araştırma ile ilgili herhangi bir ilgili veya maddi finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, IUSM Showalter Araştırma Güven Fonu (H.C.R.'ye), bir IUSM Diyabet ve Metabolik Hastalıklar Merkezi Pilot ve Fizibilite hibesi (HCR'ye), Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (R01DK129289'dan H.C.R.'ye) ve Amerikan Diyabet Derneği Genç Fakülte Ödülü (7-21-JDF-056'dan H.C.R.'ye) tarafından desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hayvanlar
Adiponektin-Crefaresi Jackson Laboratuvarı28020
NuTRAP faresiJackson Laboratuvarı29899
Reaktifler ve Malzemeler
1.5 mL DNA-LoBind tüpleriEppendorf86-923
100 & mikro; m hücre süzgeciFalcon352-360
15 mL tüplerVWR525-1071
2x TD tamponuIllumina15027866
384 kuyulu PCR plakasıUygulanan biyosistem4483285
40 ve mikro; m hücre süzgeciFalcon352-340
50 mL tüplerVWR525-1077
AMPure XP reaktifi (SPRI boncukları)Beckman CoulterA63881
Biyoanalizör Yüksek Hassasiyetli DNA kitiAgilent Technologies5067-4626
Şeffaf yapışkan filmDNase
Invitrogen10977015
Dounce doku öğütücüDWK Yaşam Bilimleri357542
DTTSigmaD9779
DynaMag-96 yan etekli mıknatısThermo Fishers12027
FACS tüpleriFalcon 
HEPESBoston BioProductsBBH-75
Hoechst 33342Invitrogen2134015
KCl (2 M)Boston BioProductsMT-252
PCR 8 tüplü şeritler için manyetik ayırma rafıEpiCypher10-0008
MgCl2 (1 M)Boston BioProductsMT-200
MinElute PCR saflaştırma kitiQiagen28004
NEBNext Yüksek Sadakatli 2x PCR ana karışımıBioLabsM0541S
NP40Thermo Fishers28324
PCR 8 tüplü şeritABD bilimsel1402-4708
Proteaz inhibitör kokteyli (100x)Thermo Fishers78439
Qubit dsDNA HS test kitiInvitrogenQ32851
SükrozSigmaS0389-1KG
SYBR Yeşil I (10.000x)InvitrogenS7563
TDE I enzimIllumina15027865
Instruments
Flow sitometreBD BiosciencesFACSAria Fusion
Qubit florometreInvitrogenQ33226
Gerçek Zamanlı PCR sistemiThermo FishersQuantStudio?5
/RNaz içermeyen damıtılmış su 4306311 uygulanan biyosistem28719128

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
  2. Farmer, S. R. Transcriptional cont....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

ATAC SeqAdipocyte NucleiAdipose TissueChromatin AccessibilityNucleus IsolationFluorescence Activated SortingTransgenic Reporter MiceMitochondrial ContaminationAdipocyte Marker GenesNucleosome Profiling

İlgili makaleler