Method Article

Aktif Fotosistem I-Işık Hasat Kompleksi I'in Bitki Dokularından Saflaştırılması

DOI:

10.3791/65037

⸱

February 3rd, 2023

 , 
1School of Molecular Sciences, Arizona State University, 2Biodesign Center for Applied Structural Discovery, Arizona State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Fotosistem I (PSI) - Hafif Hasat Kompleksi I'in (LHCI) bitki dokularından izolasyonunu açıklar. PSII ile birlikte PSI, oksijenli fotoototroflarda ışığın kimyasal enerjiye dönüştürülmesinden sorumludur ve ~ 1'lik bir kuantum verimliliğine sahiptir, bu da onu ışıkla çalışan enerji transferini incelemek için bir hedef haline getirir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, Fotosistem I'i (PSI), doğal anteni olan Işık Hasat Kompleksi I (LHCI) ile birlikte bitkilerden izole etmek için kullanılır. PSI-LHCI, yüzlerce ışık toplama ve elektron taşıma faktörünü koordine eden büyük bir zar protein kompleksidir ve doğada bulunan en verimli ışık toplama sistemidir. LHCI'yi oluşturan dört LHCA anten proteini tarafından emilen fotonlar, eksitonik etkileşim yoluyla PSI çekirdek reaksiyon merkezine aktarılır ve fotoototrofik organizmalarda karbon fiksasyonu için azaltıcı güç ve enerji sağlayarak, tilakoid zar boyunca ışıkla çalışan yük ayrılmasını kolaylaştırmak için kullanılır. PSI'nin yüksek kuantum verimliliği, bu kompleksi ışıkla çalışan enerji transferini incelemek için mükemmel bir model haline getirir. Bu protokolde, bitki dokusu mekanik olarak homojenize edilir ve kloroplastlar, filtrasyon ve santrifüjleme ile toplu hücresel döküntülerden ayrılır. İzole edilen kloroplastlar daha sonra ozmotik olarak parçalanır ve tilakoid zarlar santrifüjleme yoluyla geri kazanılır ve deterjan n-dodesil-beta-maltosit kullanılarak çözündürülür. Çözündürülmüş malzeme, klorofil içeren komplekslerin çoğunu toplamak için bir anyon değişim kolonuna yüklenir. Daha büyük kompleksler çözeltiden çökeltilir, küçük bir hacimde yeniden süspanse edilir ve ana klorofil içeren kompleksleri ayırmak için sakaroz gradyanlarına yüklenir. Elde edilen sükroz gradyan fraksiyonları, PSI-LHCI içeren ilgi bandını tanımlamak için karakterize edilir. Bu protokol, bazı basitleştirmelerle PSI-LHCI bitkisinin kristalizasyonunda kullanılan protokole oldukça benzer ve Nathan Nelson'ın laboratuvarında yıllar içinde geliştirilen yöntemlere dayanır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oksijenli fotosentez, gezegenimizdeki en önemli kimyasal reaksiyonlardan biridir. Işığın kimyasal enerjiye dönüşümü, fotosistem I (PSI) ve fotosistem II (PSII)1 olmak üzere iki fotosistemin reaksiyon merkezlerinde gerçekleşir (Şekil 1A). PSI, 3,5 milyar yıl önce evrimleşen büyük, yüksek oranda korunmuş çok alt birimli bir pigment-protein kompleksidir 2,3. Yaklaşık 100 klorofil molekülü ve yaklaşık 20 karotenoid içeren bu kompleks, fotosentetik elektron taşıma zincirinin 1,4,5 terminal elektron alıcısı olarak hareket ederek elektronların tilakoid zar boyunca plastosyaninden ferredoksine transferini kolaylaştırır (Şekil 1B, C). Bitkilerde, bu ışıkla çalışan yük ayrımı, hem PSI çekirdek anten pigmentlerinden hem de Işık Hasat kompleksi I'in (LHCI) çevresel anten pigmentlerinden PSI reaksiyon merkezine aktarılan ışık enerjisinin sonucudur (Şekil 1D). LHCI, dört klorofil a/b bağlayıcı LHCA anten proteini 6,7'den oluşan tilakoid membran içinde PSI'ye özgü bir anten kompleksidir.

figure-introduction-1
Şekil 1: Fotosentetik elektron taşıma zinciri ve PSI-LHCI kompleksinin genel yapısı. (A) Fotosentetik elektron taşıma zinciri, dört ana zara bağlı fotosentetik kompleks ve üç çözünür elektron taşıyıcısı içerir. Taşıma zinciri boyunca elektron akışı (kırmızı oklar) ve lümene proton pompalanması (siyah oklar), indirgeyici güç (NADPH) oluşturmak ve karbon fiksasyonu 37,38,39,40 için ATP üretmek için kullanılır. Biorender.com ile oluşturuldu. (B) Lümen tarafından PSI-LHCI bitkisinin yapısı. PsaA ve PsaB, PSI'nin en büyük alt birimleridir ve kompleksin çekirdeğini oluşturur. LHCI, PSI ile ilişkili ışık hasat anten kompleksidir ve LHCA1-4 olmak üzere dört antenden oluşur. (C) PSI-LHCI kompleksi 150'den fazla ligandı koordine eder. Burada klorofiller (yeşil), karotenoidler (pembe), kinonlar (mor), lipitler (turuncu) ve reaksiyon merkezinin sarı/turuncu renkteki FeS kümeleri gösterilmiştir. (D) PSI'nin reaksiyon merkezi, reaksiyon merkezi özel klorofil çifti olan P700'den başlayarak, iki aksesuar klorofile (A-1A/B) ve ardından başka bir klorofil çiftine (A0A/B) gitmek üzere iki dala (A ve B) ayrılır. Bu klorofilleri, demir-kükürt kümesi Fx'te bir araya gelmeden önce her dalda bir filokinon (bazı yayınlarda A1A/B veya QA/B) takip eder ve ardından PsaC alt birimi tarafından koordine edilen FA ve FB olmak üzere iki küme daha gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1966'da bitkilerden PSI'nin ilk izolasyonu, PSI ve PSII arasındaki hafif hasat pigment içeriğindeki farklılıklara ışık tuttu ve PSI'nin PSII'ye göre β-karoten açısından yüksek oranda zenginleştirildiğini ve sitokromların f ve b6'nın (sitokrom b6f komplekslerinin bir parçası) PSI'ye sıkı sıkıya bağlı olmadığını, ancak tilakoid zar içinde gevşek bir şekilde ilişkili olduğunu gösterdi8. Dokuz yıl sonra, SDS tedavisi ile izole edilmiş PSI'nin kısmi denatürasyonu ile, küçük PSI alt birimlerinin ayrışmasının, PSI ile NADP + fotoredüksiyonu söndürdüğü, P700 sinyalinin ve klorofillerin çoğunun kalan büyük moleküler ağırlıklı PSI partikülü içinde kaldığı, PSI'nın bazı küçük alt birimlerinin tam biyolojik işlev için gerekliliğini ve PSI reaksiyon merkezinin konumunu belirlediğigösterilmiştir 9. PSI çekirdeği ve LHCI arasındaki ilişkiye ilişkin araştırmalar ilk olarak 1980'lerin başında, farklı oranlarda klorofil A ila P700 içeren farklı büyüklükteki PSI türlerinin izolasyonları gözlemlendiğinde yayınlandı ve bu da PSI'nin klorofil içeren bir çevresel anten sistemiile ilişkisini düşündürdü. Bununla birlikte, 2003 yılına kadar PSI bitkisinin ilk kristal yapısı yayınlandı14. PSI-LHCI bitkisinin kristal yapısı, bitkilerin PSI çekirdeği ile siyanobakteriler arasındaki dikkate değer korumayı vurguladı ve bitki PSI çekirdeği ve LHCI anteni içindeki klorofil düzenlemesinin ilk resmini sağladı ve bitki PSI-LHCI kompleksi14 içindeki enerji transfer yollarının anlaşılmasını ilerletti. Son on yılda, daha fazla bitki PSI-LHCI yapısı belirlendi ve süper kompleks 15,16,17,18,19'un yapısal tanımına atomik seviye ayrıntıları eklendi.

PSI sadece bire yakın bir kuantum verimliliğine sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda doğadaki en negatif indirgeme potansiyeline sahiptir20,21. PSI-LHCI ve özelliklerinin tam olarak anlaşılması, ışıkla çalışan enerji transferini anlamak ve gelecekteki ışık hasadı teknolojisine biyo-ilham veren çözümler uygulamak için çok önemlidir. PSI-LHCI ve birçok alt biriminin bu kadar verimli enerji dönüşümünü nasıl başarabileceğine dair bu anlayışı ilerletmek için, çalışma için izole edilen komplekslerin aktif ve bütün olması gerekir. Bu protokol, kompleksin bu aktif durumda(22,23) nazikçe saflaştırılmasına izin verir.

Bu yöntemde bitki dokuları mekanik olarak parçalanır ve fotosentetik elektron taşıma zincirini içeren kloroplastlar santrifüj işlemi ile izole edilir. Tilakoid zarlar, hipotonik kloroplast lizinden sonra ayrılır ve daha sonra deterjan n-dodesil-beta-maltosit (β-DDM) kullanılarak çözündürülür. Çözündürülmüş klorofil içeren membran kompleksleri, anyon değişim kromatografisi kullanılarak ayrılır ve PSI-LHCI, sükroz gradyan santrifüjlemesi kullanılarak daha da ayrılır. Gradyandan çıkarıldıktan ve hem spektroskopi ile hem de sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) kullanılarak karakterizasyondan sonra, kompleks daha ileri deneyler için hazırlanabilir. Bu prosedür, PSI-LHCI kompleksini herhangi bir afinite etiketi kullanmadan bitkilerden saflaştırmak için kullanılır. Küçük modifikasyonlarla, kompleksin diğer organizmalardan hazırlanması için uyarlanabilir, alternatif PSI komplekslerini veya fotosentetik elektron taşıma zincirinin diğer komplekslerini stabilize edebilir. Yüksek çözünürlüklü yapısal analiz 23,24,25,26,27,28,29,30 için uygun PSI kompleksi elde etmek için benzer protokoller kullanılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ispanak yapraklarından tilakoid zarların hazırlanması

  1. Bu hazırlıkta buz üzerinde çalışın ve mümkünse ışığa maruz kalmaktan kaçının. Yüksek klorofil konsantrasyonları korunursa düşük ışıklı bir ortam yeterlidir ve numunelerin mümkün olduğunca kapalı tutulmasına özen gösterilir. Aksi belirtilmedikçe tüm santrifüj adımlarını 4 °C'de gerçekleştirin.
  2. Ispanak yapraklarının saplarını (500 g) makas kullanarak çıkarın, yaprakları bir karıştırıcıya hafifçe bastırın ve buz gibi soğuk sükroz, trisin, NaCl (STN) tamponu ile tamamen kaplayın (Tablo 1). Darbe ayarını kullanarak aşırı ısınmayı önlemek için darbeler arasında 10 saniye bırakarak STN tamponunda bitki dokusunu 10 saniye boyunca iki kez (toplam 20 saniye) homojenize edin.
    NOT: Tipik bir tamponun yapraklara oranı, 500 g ıspanak yaprağı için 1 L STN tamponudur.
  3. Tülbent katmanlarını büyük, soğutulmuş bir beher veya başka bir kap üzerine sabitleyerek ve karıştırılmış karışımı kumaştan dökerek hücre kalıntılarını sekiz kat tülbentten süzün. Lizatın akmasına izin vermek için filtredeki hücre kalıntılarını karıştırmak için bir cam çubuk veya kaşık kullanın.
  4. Hücre lizatından elde edilen pelet kloroplastları, 9 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleme yoluyla. Kloroplastları 1 L hipotonik tampon içinde yeniden süspanse edin (Tablo 1). Kloroplastları yeniden süspanse etmek için, tampon içinde bir pipet veya girdaplı kloroplast peleti kullanın ve uygun boyutta bir doku öğütücüye veya benzer bir homojenizatöre aktarın.
    NOT: Bir doku öğütücüde hipotonik çözeltiye ve yeniden süspansiyona maruz kalmak kloroplastları parçalar.
  5. Nişastayı çıkarmak için 500 x g'da 2 dakika santrifüjleyin (beyaz bir pelet olarak toplanır). Nişastanın yeniden süspansiyonundan mümkün olduğunca kaçınırken, bir pipet veya küçük bir boya fırçası kullanarak süpernatana geri peletlenen herhangi bir yeşil malzemeyi nazikçe yeniden süspanse edin. Tilakoid membranları peletlemek için çözeltiyi 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
  6. Peletlenmiş membranları, bir pipet veya küçük boya fırçası kullanarak minimum miktarda yüksek tuzlu yeniden süspansiyon tamponunda (Tablo 1) yeniden süspanse edin ve adım 1.4'teki gibi bir homojenizatör kullanarak homojenize edin. 8000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin.
  7. Minimum miktarda STN2 tamponunda (Tablo 1) daha önce olduğu gibi yeniden süspanse edin, sadece membranları yeniden süspanse etmeye ve bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak klorofil içeriğini ölçmeye yetecek kadar. Numuneyi 1/1000 oranında %80 aseton çözeltisi içinde seyrelterek ve Porra ve ark.31 yöntemini kullanarak klorofil konsantrasyonunu belirleyin.
  8. STN2 tamponu ve alikotu iki veya üç santrifüj tüpüne eşit şekilde ekleyerek istenen klorofil konsantrasyonuna, tipik olarak 3 mg / mL'ye ayarlayın. 500 g yapraktan beklenen verim yaklaşık 200 mg klorofildir, ancak başlangıç malzemesinin durumuna bağlı olarak değişiklik olması beklenir. Membran çözünmesine hazır olana kadar -80 °C'de dondurun. Bu aşamada dondurulan membranlar en az 6 ay stabildir.

2. Membran çözündürme

  1. Tilakoid membranları β-DDM ile çözündürün. 6:1 β-DDM / klorofil oranı elde etmek için %1 β-DDM stoğundan yeterli deterjan ekleyin. 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Tüpü birkaç kez yavaşça ters çevirerek her 5-10 dakikada bir yavaşça karıştırın.
  2. Çözünmeyen materyali çıkarmak için bir ultrasantrifüj kullanarak 30 dakika boyunca 120.000 x g'da santrifüjleyin. Peleti atın ve süpernatanı sonraki adımlar için saklayın.

3. Dietilaminoetil (DEAE) sütunu kullanılarak elüsyon

  1. Çözündürülmüş numunede 1 mg toplam klorofil için 1.5 mL yatak hacmi kullanarak anyon değişim kolonunu hazırlayın. Kolonu hazırlayın ve 4 °C'de çalıştırın. Reçineyi bir halka standına sabitlenmiş bir sütuna dökün. Kolonun kurumasını önlemek için su veya kolon düşük tuz tamponu eklerken reçinenin çökmesine izin verin. Sütunda kabarcık olmadığından ve üst kısmın düz ve düz olduğundan emin olun.
  2. Kolonu iki kolon hacmi (CV) kolon düşük tuz tamponu (Tablo 1) kullanarak yıkayın ve süpernatanı adım 2.2'den kolona yükleyin. Devam etmeden önce süpernatantın sütuna tamamen girmesine izin verin.
  3. Sütunu, düşük tuz tamponunun bir CV'sinde yıkayın.
  4. Düşük tuzlu ve yüksek tuzlu kolon tamponları (5-250 mM NaCl; Tablo 1) toplam altı CV hacminde yapılmıştır (yani, sütun yatağı hacmi 30 mL ise, 90 mL düşük tuz tamponu ve 90 mL yüksek tuz tamponu kullanın).
    1. İki kabı düşük ve yüksek tuz tamponlarıyla doldurun. Kolona düşük tuz tamponu damlatırken, yavaş yavaş karıştırmak için suyla dolu bir tüp kullanarak yüksek ve düşük tuz tamponları arasında bir tuz köprüsü oluşturun. Düşük tuz tamponuna hareket eden yüksek tuz tamponunun kolona damlatılmadan önce karıştırıldığından emin olmak için bir karıştırma çubuğu kullanın. Bu, NaCl gradyanının doğrusal olmasını sağlar. Kesirleri toplamaya başlayın.
  5. 4 mL fraksiyonları toplayın (yaklaşık 35 mg klorofil ile başlayan tipik bir deney için) ve gradyanın son üçte biri etrafında uzanan koyu yeşil fraksiyonları birleştirin (Şekil 2A).

4. Polietilen glikol (PEG) çökeltme

  1. Kombine klorofil fraksiyonlarına, yavaşça% 8'lik bir nihai konsantrasyona PEG6000 ekleyin. PEG konsantrasyonu biraz değişebilir; % 8'e ulaştıktan sonra yağış görülmezse, yağış görülene kadar PEG konsantrasyonunu %2'lik artışlarla artırın (çözelti bulanıklaşacaktır).
  2. 5 dakika boyunca 3.214 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen atın; Bir sonraki adımda iyi bir çözünürlük elde etmek için tüm artık PEG'nin tamamen uzaklaştırılması esastır. Yeşil çökeltiyi 2-5 mL kolon sonrası yeniden süspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 1).
  3. Tilakoidlerin PEG'den tamamen yıkandığını doğrulamak için, malzemenin çözünür olduğundan emin olmak için yeniden süspanse edilmiş malzemenin küçük bir alikotunu 18,407 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüjde döndürün. Bu aşamada küçük bir yeşil çökelti kabul edilebilir, ancak hepsi olmasa da çoğu klorofil çözelti içinde kalmalıdır. Çözünür fraksiyonu koruyun.

5. Sükroz gradyanlarının hazırlanması

  1. Sükroz gradyan tamponu ile beş katmanda (%10, %15, %20, %25 ve %30 katmanlar) %10-30 süreksiz sükroz gradyanları hazırlayın (Tablo 1). Sükroz fraksiyonlarını bir poliallomer santrifüj tüpünde, %30'luk katmandan başlayıp %10'luk katmanla biten dikkatlice katmanlayarak sükroz gradyanlarını birleştirin. Her katmanın hacmini, tüpün üst kısmında istenen hacimde numune yüklemek için yeterli üst boşluk olacak şekilde ayarlayın.
  2. Adım 4.2'deki çözünür malzemeden numuneleri sükroz gradyanlarına yükleyin. Her bir bandın homojenliğini değerlendirmek için farklı konsantrasyonlarda gradyanlar elde etmek için bir tüpe 170 μg klorofil ve diğerine 420 μg klorofil eşit olacak kadar numune yükleyin (Şekil 3A).
    NOT: Eklenen numune miktarı isteğe bağlıdır, ancak genellikle yaklaşık 150 ila 500 μg klorofil aralığı uygundur.
  3. Numune içindeki farklı kompleksleri ayırmak için gradyanları 16 saat boyunca 100.000 x g'da santrifüjleyin.

6. Sükroz fraksiyonlarının uzaklaştırılması ve PEG çökelmesi

  1. Santrifüjlemeden sonra, gradyanları rotordan çıkarın ve bir dijital kamera veya cep telefonu kullanarak tüplerin resimlerini çekin. Alttaki tüpleri bir iğne ile delerek ve ardından içeriği yavaşça boşaltarak fraksiyonları izole edin. Santrifüj tüplerinde klorofil içeren farklı fraksiyonları toplayın.
    NOT: İstenirse numuneler sonraki analizler için ayrı ayrı alıntılanabilir ve dondurulabilir.
  2. Bazı uygulamalar için sükrozun uzaklaştırılması arzu edilir. Sükrozu çıkarmak için, ikinci bir PEG çökeltme adımı (veya jel filtrasyonu) kullanın. PSI-LHCI fraksiyonundaki NaCl konsantrasyonunu 120 mM'ye ayarlayın ve %10'luk bir nihai konsantrasyona PEG6000 ekleyin.
  3. Numuneyi 18,407 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüjde santrifüjleyin. Yeşil peleti 30 mM Trisin-NaOH pH 8.0, 50 mM NaCl ve %0.05 β-DDM'de yeniden süspanse edin.
  4. Tüm malzemenin çözelti içinde kalmasını sağlamak için numuneyi 18,407 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca bir tezgah üstü santrifüjde santrifüjleyin.

7. PSI'nin P700 içeriğinin ölçülmesi

NOT: Bu yöntem, PSI'yi hızlı bir şekilde test etmek için kullanılabilir.

  1. Numuneleri 1-1.5 OD680'e seyreltin ve P700'ü tamamen azaltmak için karanlıkta 10 mM askorbik asit ile 1 saat inkübe edin.
  2. Bir UV-Vis spektrometresi kullanarak numunenin absorpsiyon spektrumunu ölçün. P700 içeriğini test etmek için 0,50 nm'lik bir veri aralığı ve 60 nm/dak'lık bir tarama hızı ile yalnızca 650 nm'den 750 nm'ye kadar absorbansı ölçün.
  3. Numuneyi parlak ışığa (350 μmol foton/m2/s) maruz bırakın ve maruz kalma sırasında spektrumu tekrar ölçün.
  4. Bitkilerde yaklaşık 702 nm'de P700 ağartmasını gözlemlemek için karanlık spektrumu ışık spektrumundan çıkarın.
  5. Hiyama ve Ke 700'te açıklandığı gibi 700 nm'de absorpsiyon ve 64/mM/cm'lik bir sönme katsayısı kullanarak P32,33,34 içeriğini belirleyin.
  6. Porra ve ark.31'de açıklanan yöntemi kullanarak toplam klorofil miktarını (klorofil A ve klorofil B) ölçün. Klorofil / P700 oranını belirlemek için bu konsantrasyonları kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, aktif PSI-LHCI'yi üç gün boyunca bitki dokularından izole etmek ve karakterize etmek için kullanılır. PSI-LHCI, önce bitki tilakoid zarlarının izole edilmesiyle saflaştırılır ve daha sonra β-DDM ile çözündürülür. Membran hazırlama aşamasından elde edilen tipik verim, 500 g yapraktan 200 mg klorofildir. Bu, kullanılan ilk malzemeye göre değişebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolü kullanarak, bitki dokularından PSI-LHCI kompleksi aktif durumda saflaştırılabilir. Burada ıspanak yaprakları kullanılmıştır, ancak bu yöntemler çeşitli bitkilerden elde edilen müstahzarlara uygulanabilir 23,40. Her durumda, kompleksi hasardan korumak için bu protokolü uygularken dikkatli olunmalıdır. Bu hazırlık karanlıkta veya yeşil ışık altında, önceden soğutulmuş tamponlarla buz üzerinde yapılmalı ve tüm yeniden s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

YM, 2034021 No'lu Ödül kapsamında Ulusal Bilim Vakfı ve ABD Enerji Bakanlığı, Bilim Ofisi, Temel Enerji Bilimleri Ofisi, Kimya Bilimleri, Yerbilimleri ve Biyolojik Bilimler Bölümü'nün Ödül No'lu olarak desteğini kabul eder. DE-SC0022956. C.G., Ulusal Bilim Vakfı tarafından 00036806 No'lu Ödül kapsamında desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Falcon tüpüVWR62406-200Tilakoidleri depolamak için kullanılır
Bio rad Econo-Column 1.5 X 30 cmbiorad7374153
Tülbent sınıfı 50, %100 pamukArkwright LLCAmazon'danB07D1FZZMB
Cam çubuklarMillipore SigmaBR135825herhangi bir çubuk yeterli olacaktır
Düşük profilli 64 oz vitamix blenderVitamix
NaClSigma-AldrichS7653
Üstü açık poliallomer santrifüj tüpleriSeton Scientific5030
Optima XE Ultrasantrifüjbeckman coulterA94471
Polietilen glikol 6.000Hampton ResearchHR2-533
Potter-Elvehjen Doku Öğütücü, 30 ml.WHEATON358049
SükrozSigma-AldrichS7903
SW 40 Tibeckman coulter 331301
TOYOPEARL DEAE-650CTosoh Bioscience7988
TricineSigma-AldrichT0377
β-DDMGlycon - Biochemicals GmbHD97002-20 &°'de %10 stok olarak depolanır; Ç
Benzer

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nelson, N., Junge, W. Structure and energy transfer in photosystems of oxygenic photosynthesis. Annual Review of Biochemistry. 84, 659-683 (2015).
  2. Fischer, W. W., Hemp, J., Johnson, J. E. Evolution of oxygenic photosynthesis. Annual Review of Earth and Planetary Sciences. 44 (1), 647-683 (2016).
  3. Yoon, H. S., Hackett, J. D., Ciniglia, C., Pinto, G., Bhattacharya, D. A molecular timeline for the origin of photosynthetic eukaryotes. Molecular Biology and Evolution. 21 (5), 809-818 (2004).
  4. Busch, A., Hippler, M. The structure and function of eukaryotic photosystem i. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1807 (8), 864-877 (2011).
  5. Rochaix, J. D. Regulation of photosynthetic electron transport. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1807 (3), 375-383 (2011).
  6. Croce, R., Morosinotto, T., Castelletti, S., Breton, J., Bassi, R. The Lhca antenna complexes of higher plants photosystem I. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1556 (1), 29-40 (2002).
  7. Croce, R., Van Amerongen, H. Light-harvesting in photosystem I. Photosynthesis Research. 116 (2-3), 153-166 (2013).
  8. Anderson, J. M., Boardman, N. K. Fractionation of the photochemical systems of photosynthesis I. Chlorophyll contents and photochemical activities of particles isolated from spinach chloroplasts. Bibliotek for Laeger. 112 (3), 403-421 (1966).
  9. Bengis, C., Nelson, N. Purification and properties of the photosystem I reaction center from chloroplasts. Journal of Biological Chemistry. 250 (8), 2783(1975).
  10. Lam, E., Ortiz, W., Malkin, R. Chlorophyll a/b proteins of Photosystem I. FEBS Letters. 168 (1), 10-14 (1984).
  11. Kuang, T. Y., Argyroudi-Akoyunoglou, J. H., Nakatani, H. Y., Watson, J., Arntzen, C. J. The origin of the long-wavelength fluorescence emission band (77°K) from photosystem I. Archives of Biochemistry and Biophysics. 235 (2), 618-627 (1984).
  12. Mullet, J. E., Burke, J. J., Arntzen, C. J. A developmental study of Photosystem I peripheral chlorophyll proteins. Plant Physiology. 65 (5), 823-827 (1980).
  13. Mullet, J. E., Burke, J. J., Arntzen, C. J. Chlorophyll a/b proteins of Photosystem I. Plant Physiology. 65 (5), 814-822 (1980).
  14. Ben-Shem, A., Frolow, F., Nelson, N. Crystal structure of plant photosystem I. Nature. 426 (6967), 630-635 (2003).
  15. Mazor, Y., Borovikova, A., Nelson, N. The structure of plant photosystem I super-complex at 2.8 A resolution. eLife. 4, 07433(2015).
  16. Qin, X., Suga, M., Kuang, T., Shen, J. R. Photosynthesis. Structural basis for energy transfer pathways in the plant PSI-LHCI supercomplex. Science. 348 (6238), New York, N.Y. 989-995 (2015).
  17. Mazor, Y., Borovikova, A., Caspy, I., Nelson, N. Structure of the plant photosystem I supercomplex at 2.6 resolution. Nature Plants. 3, 17014(2017).
  18. Pan, X., et al. Structure of the maize photosystem I supercomplex with light-harvesting complexes I and II. Science. 360 (6393), New York, N.Y. 1109-1113 (2018).
  19. Wang, J., et al. Structure of plant photosystem I−light harvesting complex I supercomplex at 2.4 Å resolution. Journal of Integrative Plant Biology. 63 (7), 1367-1381 (2021).
  20. Jensen, P. E., et al. function, and regulation of plant photosystem I. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1767 (5), 335-352 (2007).
  21. Nelson, N. Plant photosystem I - The most efficient nano-photochemical machine. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 9 (3), 1709-1713 (2009).
  22. Amunts, A., Toporik, H., Borovikova, A., Nelson, N. Structure determination and improved model of plant photosystem I. Journal of Biological Chemistry. 285 (5), 3478-3486 (2010).
  23. Gorski, C., et al. The structure of the Physcomitrium patens photosystem I reveals a unique Lhca2 paralogue replacing Lhca4. Nature Plants. 8 (3), 307-316 (2022).
  24. Perez-Boerema, A., et al. Structure of a minimal photosystem I from the green alga Dunaliella salina. Nature Plants. 6 (3), 321-327 (2020).
  25. Toporik, H., et al. The structure of a red-shifted photosystem I reveals a red site in the core antenna. Nature Communications. 11 (1), 5279(2020).
  26. Toporik, H., Li, J., Williams, D., Chiu, P. L., Mazor, Y. The structure of the stress-induced photosystem I-IsiA antenna supercomplex. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (6), 443-449 (2019).
  27. Caspy, I., et al. Structure and energy transfer pathways of the Dunaliella Salina photosystem I supercomplex. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1861 (10), 148253(2020).
  28. Naschberger, A., et al. Algal photosystem I dimer and high resolution model of PSI:plastocyanin complex. Nature Plants. 8 (10), 1191-1201 (2022).
  29. Furukawa, R., et al. Formation of a PSI-PSII megacomplex containing LHCSR and PsbS in the moss Physcomitrella patens. Journal of Plant Research. 132 (6), 867-880 (2019).
  30. Gisriel, C. J., et al. High-resolution cryo-electron microscopy structure of photosystem II from the mesophilic cyanobacterium, Synechocystis sp. PCC 6803. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (1), 2116765118(2021).
  31. Porra, R. J., Thompson, W. A., Kriedemann, P. E. Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents: verification of the concentration of chlorophyll standards by atomic absorption spectroscopy. Biochemica et Biophysica Acta. 12 (2), 103-107 (2004).
  32. Bassi, R., Simpson, D. Chlorophyll-protein complexes of barley photosystem I. European Journal of Biochemistry. 163 (2), 221-230 (1987).
  33. Hiyama, T., Ke, B. Difference spectra and excitation coefficients of P700. Biochimica et Biophysica Acta. 267 (459), 160-171 (1972).
  34. Anderson, J. M. P-700 content and polypeptide profile of chlorophyll-protein complexes of spinach and barley thylakoids. Biochimica et Biophysica Acta. 591 (1), 113-126 (1980).
  35. Caspy, I., et al. Dimeric and high-resolution structures of Chlamydomonas Photosystem I from a temperature-sensitive Photosystem II mutant. Communications Biology. 4 (1), 1-10 (2021).
  36. Caffarri, S., Kouřil, R., Kereïche, S., Boekema, E. J., Croce, R. Functional architecture of higher plant photosystem II supercomplexes. EMBO Journal. 28 (19), 3052-3063 (2009).
  37. Su, X., et al. Structure and assembly mechanism of plant C2S2M2-type PSII-LHCII supercomplex. Science. 357 (6353), 815-820 (2017).
  38. Malone, L. A., et al. Cryo-EM structure of the spinach cytochrome b 6 f at 3.6 Å resolution. Nature. 575 (7783), 535-539 (2019).
  39. Guo, H., Rubinstein, J. L. Structure of ATP synthase under strain during catalysis. Nature Communications. 13 (1), 2-10 (2022).
  40. Mazor, Y., Borovikova, A., Caspy, I., Nelson, N. Structure of the plant photosystem I supercomplex at 2.6 Å resolution. Nature Plants. 3, 17014(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Photosystem ILight Harvesting Complex IPSI LHCIChloroplast IsolationElectron TransportThylakoid MembraneEnergy TransferChlorophyll ComplexesSucrose GradientPurification ProtocolMechanical HomogenizationAnion Exchange ColumnN dodecyl beta maltosidePlant TissuesPhotoautotrophic Organisms
Video Coming Soon