Bu protokol, yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip transmembran voltajının ve hücre içi Ca2+ geçici akımlarının elektrofizyolojik ölçümleri de dahil olmak üzere, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardiden etkilenen vahşi tip ve knock-in hayvanlardan elde edilen fare kalplerinin çift boyutlu optik haritalamasını sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Katekolaminerjik Polimorfik Ventriküler Taşikardi RyR2R2474S Knock-In Farelerinden Kalplerin Çift Boyutlu Optik Haritalaması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Proaritmik kardiyak bozukluk katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi (CPVT), fiziksel aktivite, stres veya katekolamin zorluğunu takiben polimorfik ventriküler taşikardi atakları olarak ortaya çıkar ve potansiyel olarak ölümcül ventriküler fibrilasyona dönüşebilir. Fare kalbi, CPVT dahil kalıtsal kardiyak aritmik hastalıkları modellemek için yaygın bir türdür. Langendorff perfüze fare kalplerinden transmembran potansiyelinin (Vm) ve kalsiyum geçişlerinin (CaT) eşzamanlı optik haritalanması, aritmogenezin altında yatan mekanizmaları aydınlatma potansiyeline sahiptir. Hücresel seviye araştırması ile karşılaştırıldığında, optik haritalama tekniği, aktivasyonun belirlenmesi, iletim hızı, aksiyon potansiyeli süresi ve CaT süresi gibi bazı elektrofizyolojik parametreleri test edebilir. Bu makale, izoproterenol mücadelesi öncesinde ve sırasında programlanmış elektrik pacing ile birlikte murin vahşi tip ve heterozigot RyR2-R2474S/+ kalplerinde CaT ve V m'nin yüksek verimli optik haritalaması için enstrümantasyon kurulumunu ve deneysel prosedürü sunmaktadır. Bu yaklaşım, bir ex vivo fare kalp preparatında CPVT hastalığını mekanik olarak incelemek için uygulanabilir ve güvenilir bir yöntem göstermiştir.
Giriş
Kalıtsal kardiyak bozukluk katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi (CPVT), fiziksel aktivite, stres veya katekolamin zorluğunu takiben polimorfik ventriküler taşikardi (PVT) atakları olarak kendini gösterirve potansiyel olarak ölümcül ventriküler fibrilasyona dönüşebilir 1,2,3,4 . 1995 yılında klinik bir sendrom olarak ilk raporunu takip eden son kanıtlar, tümü bu durumda sarkoplazmik retiküler (SR) deposu Ca 2+ salınımında yer alan yedi gende mutasyonları içermiştir: en sık bildirilen RYR2 kodlayan ryR2 kodlayan Ca2+....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneyler için 10-14 haftalık erkek vahşi tip fareler veya 20-25 g ağırlığındaki RyR2-R2474S/+ fareler (C57BL/6 arka plan) kullanılmıştır. Tüm prosedürler, Southwest Medical University, Sichuan, Çin'in hayvan bakımı ve kullanımı komitesi (onay NO:20160930) tarafından, kurumun faaliyet gösterdiği ulusal yönergelere uygun olarak onaylanmıştır.
1. Hazırlık
- Stok çözümleri
- Blebbistatin stok çözeltisi: 10 mM'lik bir konsantrasyona ulaşmak için 2.924 mg (-) blebbistatin tozu içeren orijinal şişeye 1 mL %100 dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
- Voltaj göstergesi RH237 stok çözeltisi: 2,01 mM'lik bir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Optik haritalama, son on yılda karmaşık kardiyak aritmilerin incelenmesinde popüler bir yaklaşım olmuştur. Optik haritalama kurulumu, 1.000 Hz'e kadar örnekleme hızı ve her piksel için 74 x 74 μm uzamsal çözünürlük sağlayan bir EMCCD kameradan oluşur. Sinyal örneklemesi sırasında oldukça yüksek bir sinyal-gürültü oranı sağlar (Şekil 1). Langendorff perfüze edilmiş kalp stabil bir duruma ulaştığında ve boya yüklemesi bittiğinde, kalp, RH237 ve Ca2+ göstergesi Rhod-2'nin uyarılması .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Deneyimlerimize dayanarak, bir fare kalbinin başarılı bir çift boyutlu optik haritalamasının anahtarları, iyi hazırlanmış bir çözüm ve kalp, boya yüklemesi, en iyi sinyal-gürültü oranının elde edilmesi ve hareket artefaktının azaltılmasını içerir.
Çözeltinin hazırlanması
Başarılı bir kalp deneyi için Krebs çözümü şarttır. MgCl 2 ve CaCl2 stok çözeltileri (1 mol/L) su emilimleri göz önünde bulundurularak önceden hazırlanır ve diğer tüm bileşenler saf su.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların hiçbirinin beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81700308'dan XO'ya ve 31871181'dan ML'ye ve 82270334'dan XT'ye), Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Destek Programı (CN) (2021YJ0206'dan XO'ya, 23ZYZYTS0433 ve 2022YFS0607'den XT'ye ve 2022NSFSC1602'den TC'ye) ve Tıbbi Kaynakların Kimyası ve Moleküler Mühendisliği için Devlet Anahtar Laboratuvarı (Guangxi Normal Üniversitesi) (CMEMR2017-B08'den XO'ya), MRC (ML02647, G1002082, ML için G10031871181), BHF (PG/14/80/31106, PG/16/67/32340, PG/12/21/29473, PG/11/59/29004 ML), BHF CRE at Oxford (ML) hibeleri.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.2 ve mu; m şırınga filtresi | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Şangay, Çin'in tıbbi ekipman fabrikası | N/A | Çözeltiyi filtrelemek için |
| 15 mL santrifüj tüpü | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. Çin | CFT011150 | |
| 1 mL Pastör pipeti | Beijing Labgic Technology Co., Ltd. Çin | 00900026 | |
| 1 mL Şırınga | B. Braun Medical Inc. | YZB/GER-5474-2014 | |
| 200 μ L PCR tüpü | Sangon Biotech Co., Ltd. Şangay. Çin | F611541-0010 | Aliquote 50 mL santrifüj tüpünün tekrarlanan donmasını ve çözülmesini önlemek için stok çözümleri |
| Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China | CFT011500 | Store Tyrode'un çözümünü 4 &° C'de; Takip kalp izolasyonu için C | |
| 585/40 nm filtre | Chroma Technology | N/A | Kalsiyum sinyali için filtre |
| 630 nm uzun geçiren filtre | Chroma Technology | G15604AJ | Voltaj sinyali için filtre |
| Avertin (2,2,2-tribromoetanol) | Sigma-Aldrich Poole, Dorset, Birleşik Krallık | T48402-100G | Acı ve ağrı refleksini en aza indirmek için |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, Amerika Birleşik Devletleri | SLBV5564 | Haritalama sırasında hareket artefaktını ortadan kaldırmak için uyarma-kasılma unkuplörü |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri | SLBK1794V | Tyrode'un çözümü için |
| Özel yapım termostatik banyo | MappingLab, Birleşik Krallık | TBC-2.1 | Perfüzyon çözeltisinin |
| sıcaklığını korumak içinDimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | (RNBT7442) | Boyalar için çözücü |
| Dumont forseps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Şangay, Çin'in tıbbi ekipman fabrikası | YAF030 | |
| ElectroMap yazılımı | Birmingham Üniversitesi | N/A | Elektriksel parametrelerin ölçülmesi |
| EMCCD kamera | Evolve 512 Delta, Fotometri, Tucson, AZ, Amerika Birleşik Devletleri | A18G150001 | Optik sinyaller için görüntü elde edin |
| ET525/36 püskürtme kaplı filtre | Chroma Technology | 319106 | Uyarma filtresi |
| Glikoz | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri | SLBT4811V | Tyrode çözeltisi için |
| Heparin Sodyum | Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, Çin | (H51021209) | Koroner arterde kan pıhtılarını önlemek için |
| İris forseps | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Şangay, Çin tıbbi ekipman fabrikası | YAA010 | |
| Isoproterenol | MedChemExpress, Carlsbad, CA, Amerika Birleşik Devletleri | HY-B0468 / CS-2582 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri | SLBS5003 | Tyrode'un çözümü için |
| MacroLED | Cairn Research, Faversham, Birleşik Krallık | 7355/7356 | Floresan problarının uyarma ışığı |
| MacroLED ışık kaynağı | Cairn Research, Faversham, Birleşik Krallık | 7352 | LED'leri kontrol edin |
| Mayo makas | Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Şangay, Çin'in tıbbi ekipman fabrikası | YBC010 | |
| MetaMorph | Moleküler Cihazlar | N/A | Optik sinyal örnekleme |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri | BCBS6841V | Tyrode'un çözümü için |
| MICRO3-1401 | Cambridge Electronic Design limited, Birleşik Krallık | M5337 | Elektrik stimülatörünü ve Spike2 yazılımını bağlayın |
| MyoPacer EP alan stimülatörü | Ion Optix Co, Milton, MA, Amerika Birleşik Devletleri | S006152 | Elektrik stimülatörü |
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri | SLBS2340V | Tyrode çözümü için |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri | BCBW9042 | Tyrode'un çözümü için |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Amerika Birleşik Devletleri | SLBX3605 | Tyrode'un çözümü için |
| NeuroLog System Digitimer | NL905-229 | EKG amplifikatörü | |
| için OmapScope5 MappingLab | , Birleşik Krallık | N/A | Kalsiyum alternans ve aritmi analizi |
| Oftalmik makas | Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, Çin | T4-3904 | |
| OptoSplit | Cairn Research, Faversham, Birleşik Krallık | 6970 | Ca2+ ve Vm aynı anda algılamak için emisyon ışığını ayırın |
| Peristalik pompa | Daha Uzun Hassas Pompa Co., Ltd., Baoding, Çin, | BT100-2J | Çözeltiyi pompalamak için |
| Petri kabı | BIOFIL | TCD010060 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Birleşik Devletleri | 1899021 | Rhod2AM |
| RH237 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Amerika Birleşik Devletleri | ile | Gerilime duyarlı boya |
| Rhod-2 | Invitrogen, Carlsbad, CA, Amerika Birleşik Devletleri | 1890519 | Kalsiyum indikatörü |
| Silika jel tüp | Daha Uzun Hassas Pompa Co, Ltd, Baoding, Çin, | 96402-16 | Peristaltik pompa ile bağlanın |
| İpek sütür | Yuankang Medical Instrument Co., Ltd., Yangzhou, Çin | 20172650032 | Aortu düzeltmek için |
| Spike2 | Cambridge Electronic Design limited, Birleşik Krallık | N/A | EKG verilerini kaydetmek ve analiz etmek için |
| Stimülasyon elektrot | MappingLab, Birleşik Krallık | SE1600-35-2020 | |
| T510lpxr | Chroma Technology | 312461 | Işık kaynağı için |
| T565lpxr | Chroma Technology | 321343 | Işık kaynağı için |
Kaynaklar
- Priori, S. G., Chen, S. R. Inherited dysfunction of sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling and arrhythmogenesis. Circulation Research. 108 (7), 871-883 (2011).
- Goddard, C. A., et al. P....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
