Method Article

H9c2 Miyokard Hücrelerinin Crocetin ile Oksidatif Stresten PINK1 / Parkin Yolu Aracılı Mitopaji ile Korunması

DOI:

10.3791/65105

⸱

May 26th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Fangshan Chinese Medicine Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn vitro deneylere dayanarak, bu çalışma, PINK1 / Parkin sinyal yolunun önemli bir rol oynadığı mitopajiyi etkileyerek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarını onarmada krosetinin mekanizmasını ortaya koymuştur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, krosetininH2O2 aracılı H9c2miyokard hücreleri üzerindeki oksidatif stresten koruyucu etkisini in vitro deneylerle araştırmayı ve mekanizmasının mitopajinin etkisiyle ilişkili olup olmadığını araştırmayı amaçlamıştır. Bu çalışmada ayrıca aspir asidinin kardiyomiyositlerde oksidatif stres üzerine terapötik etkisinin gösterilmesi ve mekanizmasının mitopajinin etkisi ile ilişkili olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır. Burada, birH2O2bazlı oksidatif stres modeli oluşturulmuş ve laktat dehidrogenaz (LDH), kreatin kinaz (CK), malondialdehit (MDA), süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve glutatyon peroksidaz (GSH Px) seviyelerini tespit ederek kardiyomiyositlerin oksidatif stres hasarının derecesini değerlendirmiştir. Mitokondriyal hasarı ve apoptozu değerlendirmek için reaktif oksijen türleri (ROS) tespit eden floresan boya DCFH-DA, JC-1 boyası ve TUNEL boyası kullanıldı. Otofajik akı Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirüs transfekte edilerek ölçüldü. Mitopaji ile ilişkili proteinler daha sonra batı lekelenmesi ve immünofloresan yoluyla tespit edildi. Bununla birlikte, krosetin (0.1-10 μM) hücre canlılığını önemli ölçüde artırabilir veH2O2'nin neden olduğu apoptozve oksidatif stres hasarını azaltabilir. Aşırı otofajik aktivasyonu olan hücrelerde, krosetin ayrıca otofaji akışını ve mitopaji ile ilişkili proteinler PINK1 ve Parkin'in ekspresyonunu azaltabilir ve Parkin'in mitokondriye transferini tersine çevirebilir. Krosetin,H2O2aracılı oksidatif stres hasarını ve H9c2 hücrelerinin apoptozunu azaltabilir ve mekanizması mitopaji ile yakından ilişkiliydi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akut miyokard enfarktüsü (), koroner arterlere şiddetli ve inatçı iskemi ve hipoksi sonucu ortaya çıkan, hayatı tehdit eden bir miyokard nekrozudur 1,2. Perkütan koroner girişim (PKG), için birinci basamak terapötik stratejilerden biridir ve genellikle kardiyomiyositleri iskemik hasardan korur 3,4. Distal miyokard, sonrası derhal ve etkili bir şekilde tedavi edilmezse kan ve oksijen kaynağından yoksun kalacaktır, bu da iskemik nekroza ve daha ileri kardiyovasküler komplikasyonlara yol açacaktır 5,6. Kardiyomiyosit iyileşmesini teşvik etmek ve PCI cerrahi fırsatını kaçırdıktan sonra geri dönüşümsüz miyokard hasarını en aza indirmek bir araştırma noktası olmuştur. AMI'den sonra, kardiyomiyositler iskemi ve hipoksi durumundadır, bu da mitokondriyal oksidatif fosforilasyonun inhibisyonu, NAD + 'nın NADPH'ye indirgenmesi ve tek elektron redüksiyonunun artmasıile sonuçlanır 7. Sonuç olarak, oksijenin eksik indirgeme reaksiyonu, aşırı miktarda reaktif oksijen türü (ROS) üretir ve sonuçta kardiyomiyositlerde oksidatif stres hasarına yol açar8. Aşırı ROS birikimi, lipit peroksidasyonunu tetikleyerek mitokondriyal membranların yapısını ve işlevini daha da bozar. Sonuç, mitokondriyal geçirgenlik geçiş gözeneklerinin sürekli açılması ve mitokondriyal membran potansiyelinde bir azalma, apoptoz ve nekrozu indüklemesidir.

Anjiyotensin dönüştürücü enzim (ACE) inhibitörleri, anjiyotensin reseptör blokerleri (ARB'ler), β-adrenoseptörlerin inhibitörleri, aldosteron antagonistleri ve'deki diğer standart ilaçlar, miyokard enfarktüsünden sonra kalp fonksiyonlarını iyileştirmeye yardımcı olabilir ve aritmiler ve sol ventrikül yeniden şekillenmesi gibi malign olayların ortaya çıkmasını önleyebilir9. Bununla birlikte, enfarktüs sonrası sağkalım ve prognoz enfarktüs boyutundan büyük ölçüde etkilenmektedir ve kardiyomiyosit apoptozunu azaltmada tatmin edici sonuçlar elde edilememiştir10,11. Bu nedenle, miyokard enfarktüsünden sonra kardiyomiyosit iyileşmesini teşvik etmek için ilaçların geliştirilmesi acil bir konu haline gelmiştir.

Geleneksel tıp, uzun yıllardır modern farmasötik araştırmalar için bir ilham kaynağı olmuştur12,13,14,15. Geleneksel Çin tıbbı (TCM), tedavisinde uzun bir geçmişe sahiptir ve son yıllarda yapılan bir dizi randomize kontrol çalışması, TCM'nin hastaların prognozunu gerçekten iyileştirebileceğini doğrulamıştır16,17. TCM teorisine göre,'ye kan stazı18,19 neden olur, bu nedenle kan dolaşımını teşvik eden ilaçlar genellikle akut faz20'de tedavisi için kullanılır. Bunlar arasında safranın kan aktivasyonu ve stazı üzerinde güçlü bir etkisi olduğuna inanılmaktadır ve sıklıkla'nin akut tedavisinde kullanılmaktadır. Safranın önemli bir bileşeni olan krosetin, kardiyomiyositlerin korunmasında önemli bir rol oynayabilir21.

Bu çalışmada, H9c2 miyokard hücreleri,'nin kardiyomiyosit hasarına neden olan miyokard iskemisi / reperfüzyonunu simüle etmek için H2O2tarafından indüklendi ve oksidatif strese bağlı miyokard hasarına karşı koruyucu etkisini araştırmak için bir müdahale olarak krosetin kullanıldı. Krosetinin kardiyomiyositleri koruma mekanizması mitopaji ile daha da araştırıldı. Daha da önemlisi, bu makale mitopaji çalışmasına teknik yaklaşım için bir referans sağlar ve tüm deneysel prosedürü ayrıntılı olarak açıklar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneyler, Çin'deki Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi'ndeki Fizyoloji Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi. Tüm çalışma yöntemleri, Pekin Üniversitesi'nin ilgili yönergelerine ve düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Hücre kültürü

  1. DMEM komple ortamını hazırlamak için Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) bazik besiyerine (4.5 g / L D-glikoz, 4.g.g / L L-glutamin ve 110 mg / L sodyum piruvat ile; Malzeme Tablosuna bakınız) %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin / streptomisin ekleyin.
  2. Sıvı azotla dondurulmuş H9c2 miyokard hücrelerini (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de ılık suda, buz eriyene kadar hızlı ve düzgün bir şekilde karıştırarak çözün.
  3. Hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve DMEM tam ortamının hacminin dört katını ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 358 x g'de santrifüj yapın ve süpernatantı bir pipet kullanarak atın.
  4. Elde edilen hücre süspansiyonunu kültür ortamı ile seyreltin, yavaşça üfleyin ve hücreleri bir kültür şişesinde aşılayın. 37 °C'de bir inkübatörde %5 CO2 ile kültür.

2. Hücre canlılığının belirlenmesi

  1. Krosetini (bakınız Malzeme Tablosu) dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 0,05 mM, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM ve 200 mM konsantrasyonlarında çözün.
  2. H9c2 miyokard hücrelerini tripsin ile ayırın, ardından karışımı DMEM tam ortamı ile nötralize edin.
  3. Hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 179 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve hücreleri DMEM komple ortamında hafifçe üfleyerek karıştırın.
  4. Bir kan hücresi sayım plakası22 kullanarak hücreleri sayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve DMEM tam ortamı ile 5 × 104 hücre / mL'ye seyreltin.
  5. Hücreleri dokuz eşit parçaya bölün. Kontrol grubuna DMSO (DMEM tam ortamı ile 1: 1.000 oranında seyreltilmiş) ekleyin ve kalan gruplara 1: 1.000 oranında farklı krosetin konsantrasyonları ekleyin.
  6. Hücreleri 96 delikli plakalarda kuyucuk başına 100 μL'de tohumlayın. Süpernatantı 24 saat inkübasyondan sonra atın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
  7. 100 μL DMEM bazal ortamı ekledikten sonra, hücreleri 4 saat boyunca inkübe edin ve 20 μL MTS ekleyin ( bkz.
  8. Hücreleri 2 saat daha inkübe edin, absorbansı 490 nm dalga boyunda ölçün ve hücre canlılığını hesaplayın.
    NOT: Hücre canlılığı = (OD ile işlenmiş - OD boş) / (OD kontrolü - OD boş) × 100.

3. Laktat dehidrogenaz (LDH), kreatin kinaz (CK), malondialdehit (MDA), süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz (GSH Px) ve katalaz (CAT) tayini

  1. H9c2 hücrelerini 6 delikli bir plakada 1 × 105 hücre yoğunluğunda tohumlayın. Müdahaleden sonra süpernatantı toplayın ve üreticinin talimatlarına göre LDH ve SOD seviyelerini tespit edin (bkz.
  2. Süpernatantı toplayın ve bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Hücre lizatını kültür kabına ekleyin ve 20 dakika boyunca buz üzerinde oturmasına izin verin. Sıvıyı kültür kabından bir santrifüj tüpüne toplayın.
  3. CK, MDA, GSH-Px ve CAT düzeylerini üreticinin talimatları23'e göre tespit edin (bkz. Malzeme Tablosu ve Ek Dosya 1).
  4. CK, MDA, GSH-Px ve CAT24 konsantrasyonunu düzeltmek için lizisin toplam protein konsantrasyonunu bicinchoninic acid (BCA) yöntemiyle tespit edin (bkz.

4. ROS tayini

  1. H9c2 hücrelerini 48 delikli bir plakada 5 × 103 hücre yoğunluğunda tohumlayın. DCFH-DA'yı ( bkz. Malzeme Tablosu) serumsuz ortam ile 1:1.000 oranında seyreltin. Hücre süpernatantını atın ve hücreyi serumsuz bir ortamla iki kez yıkayın.
  2. Her bir oyuğa 150 μL seyreltilmiş DCFH-DA ekleyin ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hücreleri serumsuz bir ortamla üç kez yıkayın ve floresan mikroskobu altında görüntüler yakalayın (bkz.

5. Mitokondriyal membran potansiyelinin tespiti

  1. Bir JC-1 mitokondriyal membran potansiyeli tahlil kiti25 kullanarak mitokondriyal membran potansiyelini tespit edin (bakınız Malzeme Tablosu). Kültür ortamını atın ve serumsuz ortamla bir kez yıkayın.
  2. Her tüpe JC-1 çalışma solüsyonu ekleyin ve iyice karıştırın. 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin ve hücreleri JC-1 boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Her bir kuyucuğa tam bir ortam ekleyin ve floresan mikroskobu altında fotoğraf çekin.

6. TÜNEL boyama testi

  1. Apoptoz oranlarını belirlemek için bir TUNEL apoptoz tahlil kiti kullanın (bakınız Malzeme Tablosu)26. Süpernatantı atın ve peletleri bir kez serumsuz ortamla yıkayın.
  2. Hücre fiksasyon çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe ettikten sonra bir kez PBS ile yıkayın.
  3. Her bir kuyucuğa% 0.3 triton-100 ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. TUNEL algılama çalışma solüsyonunu ekleyin ve karanlıkta 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin.
  4. 4′,6-diamidino-2-fenilindol içeren bir anti-floresan söndürme sızdırmazlık tableti ekleyin (DAPI; Malzeme Tablosuna bakınız) ve floresan mikroskobu altında fotoğraf çekin.

7. mCherry GFP-LC3B adenovirüsünün transfeksiyonu ile otofajik akışın izlenmesi

  1. Her bir kuyucuktaki ortamın yarısını taze ortamla değiştirin. Kültür ortamına Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirüsü (2'nin enfeksiyon çokluğu [MOI]) ekleyin ve enfeksiyon verimliliğini artırmak için 5 μg / mL polibren ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. Taze ortamı 24 saat sonra değiştirin ve floresan proteininin ekspresyonunu konfokal mikroskop altında gözlemleyin.
  3. Başarılı virüs enfeksiyonunu doğruladıktan sonra hücreleri bölüm 1 ile aynı koşullarda kültürleyin ve konfokal mikroskop altında görüntü yakalayın27.
    NOT: Hücrelerin% 20'sinden fazlası, başarılı bir enfeksiyonu gösteren yeşil floresan protein (GFP) floresansı gösterdi.

8. Batı leke analizi

  1. Tüm protein ekstraksiyonu için hücreleri toplayın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde lize edin (RIPA, proteaz inhibitörü ve fosfataz inhibitörü = 100: 1: 1; Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. Protein miktarından sonra protein numunesine 5x protein yükleme tamponu ekleyin ve numuneleri 10 dakika kaynatın.
  3. Elektrofor, eşit miktarda protein içeren numunelerde sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jelleri28. Daha sonra, numuneleri poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına aktarın.
  4. PVDF membranlarını %5 yağsız süt tozu ile 1 saat bloke edin ve gece boyunca 4 °C'de birincil antikor (PINK1, Parkin; bakınız Malzeme Tablosu) ve oda sıcaklığında ikincil antikor ile 1 saat boyunca inkübe edin.
  5. Gelişmiş kemilüminesans (ECL) çözeltisini ve kemilüminesans algılama sistemini kullanarak hedef bantları tespit edin. Dansitometri28 ile bantları ölçmek için Image J yazılımını kullanın.

9. Parkin'in mitokondriyal translokasyonunun immünofloresan ile saptanması

  1. Parkin'in mitokondri ile çift immünofloresan boyama ile kolokalizasyonunu gözlemleyin. Hücre süpernatantını her gruptan atın ve PBS ile üç kez yıkayın.
  2. Hücreleri% 4 paraformaldehit ile oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin ve PBS'de% 0.1 triton-100 ekleyin.
  3. Proteinler ve antikorlar arasında spesifik olmayan bağlanmayı önlemek ve floresan arka planını azaltmak için 1 saat boyunca hayvansız blok çözeltisi ile blok yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Bir gecede 4 ° C'de birincil bir antikor (Parkin ve Tom20; Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
  5. Bir floresan ikincil antikor ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve karanlıkta 1 saat boyunca inkübe edin.
  6. DAPI içeren anti-floresan söndürme tabletlerini ekleyin ve konfokal mikroskop altında görüntüler yakalayın.

10. İstatistiksel analiz

  1. Grafik ve analiz yazılımı kullanarak istatistiksel analiz gerçekleştirin (bkz.
  2. Tek yönlü ANOVA kullanarak gruplar arasındaki sürekli değişkenleri karşılaştırın. p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı bulundu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krosetinin hücre canlılığı üzerine etkileri
0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 50 μM ve 100 μM'deki krosetin, hücreler üzerinde önemli bir proliferatif etkiye sahipken, 200 μM'nin üzerindeki konsantrasyonlarda krosetin, H9c2 hücrelerinin proliferasyonunu önemli ölçüde inhibe etmiştir (Şekil 1A). 400 μM H2O2 ile 4 saatlik tedaviden sonra, hücre canlılığı önemli ölçüde azaldı ve krosetin bu değişikliği belirli bir dereceye kadar tersine çevirebildi (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İleri teknoloji ile doğal ilaçların karmaşık bileşiklerinden etkili bileşenlerin araştırılması, TCM araştırmasının29 sıcak noktası olmuştur ve doğrulamadan sonra gelecekteki ilaç gelişimi için laboratuvar kanıtları sağlayabilir. Aspir, "kan dolaşımını teşvik etmek ve kan durağanlığını en aza indirmek" tedavisinde temsili bir ilaçtır ve miyokard enfarktüsü tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır30,31. Safranın aspir ile benzer etkilere s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (No. 7202119) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82274380) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 0.25 tripsinGibco2323363
% 1 Penisilin-streptomisinSigmaV900929
5x protein yükleme tamponuBeijing Pulilai Gen TeknolojisiB1030-5
Ad-mCherry GFP-LC3B adenovirüsBeyotimeC3011
Alexa Fluor 488-konjuge keçi anti-tavşan IgG (H + L) Zhongshan Altın Köprü Biyoteknoloji Co, LtdZF-0514
Alexa Fluor 594 konjuge keçi anti-fare IgG (H + L)Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZF-0513
Hayvansız engelleme çözümüCST15019s
Anti-Parkin antikoruSanta Cruzsc-32282
Anti-PINK1 antikoruABklonalA11435
Anti-TOM20 antikoruABklonalA19403
Anti-β-aktin  antikoruABklonalAC026
BCA protein tahlil kitiKeyGEN BiotechKGP902
Kan hücresi sayma plakasıServicebioWG607
CAT tahlil kitleriNanjing Jiancheng Biyomühendislik EnstitüsüA007-1-1
Kemilüminesans tespit sistemiŞangay Qinxiang Bilimsel Alet FabrikasıChemiScope 6100
CK tahlil kitleriNanjing Jiancheng Biyomühendislik EnstitüsüA032-1-1
Koenzim Q10 (CoQ 10)MacklinC6129
CrocetinChengdu Ruifensi Biotechnology Co., Ltd.RFS-Z01802006012
DAPI içeren antifloresan söndürme tabletleriZhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.ZLI-9557
DCFH-DABeyotimeS0033S
DMSOSolarbioD8371
Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM)Gibco8122091
Gelişmiş Kemilüminesans (ECL) çözümüNCM BiotechP10100
Fetal sığır serumu (FBS)Corning-Cellgro35-081-CV
GraphPad Prizma 7.0 https://www.graphpad.com/
GSH-Px tahlil kitleriNanjing Jiancheng Biyomühendislik EnstitüsüA005-1-2
H9c2 miyokard hücreleriPekin Dingguochangsheng Biotech Co., Ltd.CS0062
Yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge keçi anti-keçi IgG (H + L)  Zhongshan Altın Köprü Biyoteknoloji Co, LtdZB-2305
Yaban turpu peroksidaz (HRP) konjuge keçi anti-fare IgG (H + L) & nbsp;Zhongshan Altın Köprü Biyoteknoloji Co, LtdZB-2301
JC-1 mitokondriyal membran potansiyel tahlil kitiLABLEADJ22202
LDH tahlil kitleriNanjing Jiancheng Biyomühendislik EnstitüsüA020-2-2
MDA tahlil kitleriNanjing Jiancheng Biyomühendislik EnstitüsüA003-2-2
MetanolAladdinA2114057
MTS tahliliPromegaG3581
PerhidrolG-klonuCS7730
Fosfataz inhibitörüCWBIOCW2383
PolibrenBeyotimeC0351
Poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarıMiliporeISEQ00010
Radyoimmünopresipitasyon deneyi (RIPA) lizis tamponuSolarbioR0010
SDS-PAGE jelleriŞangay Epizyme Biyomedikal TeknolojisiPG112
SDS-PAGE çalışan tampon tozuServicebioG2018-1L
SDS-PAGE transfer tamponu tozuServicebioG2017-1L
SOD test kitleriNanjing Jiancheng Biyomühendislik EnstitüsüA001-2-2
Tris-tamponlu tuzlu su tozuServicebioG0001-2L
Triton X-100SigmaSLCC9172
TUNEL apoptoz test kitiBeyotimeC1086
Tween-20SolarbioT8220

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, J. L., Morrow, D. A. Acute myocardial infarction. The New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).
  2. Samsky, M. D., et al. Cardiogenic shock after acute myocardial infarction: a review. JAMA. 326 (18), 1840-1850 (2021).
  3. Abbate, A., et al. Survival and cardiac remodeling benefits in patients undergoing late percutaneous coronary intervention of the infarct-related artery: evidence from a meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of the American College of Cardiology. 51 (9), 956-964 (2008).
  4. Santoro, G. M., Carrabba, N., Migliorini, A., Parodi, G., Valenti, R. Acute heart failure in patients with acute myocardial infarction treated with primary percutaneous coronary intervention. European Journal of Heart Failure. 10 (8), 780-785 (2008).
  5. Dhruva, S. S., et al. Association of use of an intravascular microaxial left ventricular assist device vs intra-aortic balloon pump with in-hospital mortality and major bleeding among patients with acute myocardial infarction complicated by cardiogenic shock. JAMA. 323 (8), 734-745 (2020).
  6. Wang, Y., et al. Risk factors associated with major cardiovascular events 1 year after acute myocardial infarction. JAMA Network Open. 1 (4), e181079(2018).
  7. Jou, M. J., et al. Melatonin protects against common deletion of mitochondrial DNA-augmented mitochondrial oxidative stress and apoptosis. Journal of Pineal Research. 43 (4), 389-403 (2007).
  8. La Piana, G., Fransvea, E., Marzulli, D., Lofrumento, N. E. Mitochondrial membrane potential supported by exogenous cytochrome c oxidation mimics the early stages of apoptosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 246 (2), 556-561 (1998).
  9. De Filippo, O., et al. Impact of secondary prevention medical therapies on outcomes of patients suffering from Myocardial Infarction with NonObstructive Coronary Artery disease (MINOCA): A meta-analysis. International Journal of Cardiology. 368, 1-9 (2022).
  10. Davidson, S. M., et al. Multitarget strategies to reduce myocardial ischemia/reperfusion injury: JACC review topic of the week. Journal of the American College of Cardiology. 73 (1), 89-99 (2019).
  11. Caricati-Neto, A., Errante, P. R., Menezes-Rodrigues, F. S. Recent advances in pharmacological and non-pharmacological strategies of cardioprotection. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 4002(2019).
  12. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology analysis and experimental validation to investigate the mechanism of total flavonoids of rhizoma drynariae in treating rheumatoid arthritis. Drug Design, Development, and Therapy. 16, 1743-1766 (2022).
  13. Wei, Z., et al. Traditional Chinese medicine has great potential as candidate drugs for lung cancer: A review. Journal of Ethnopharmacology. 300, 115748(2023).
  14. Zhi, W., Liu, Y., Wang, X., Zhang, H. Recent advances of traditional Chinese medicine for the prevention and treatment of atherosclerosis. Journal of Ethnopharmacology. 301, 115749(2023).
  15. Liu, M., et al. Hypertensive heart disease and myocardial fibrosis: How traditional Chinese medicine can help addressing unmet therapeutical needs. Pharmacological Research. 185, 106515(2022).
  16. Zhang, X. X., et al. Traditional Chinese medicine intervenes ventricular remodeling following acute myocardial infarction: evidence from 40 random controlled trials with 3,659 subjects. Frontiers in Pharmacology. 12, 707394(2021).
  17. Hao, P., et al. Traditional Chinese medicine for cardiovascular disease: evidence and potential mechanisms. Journal of the American College of Cardiology. 69 (24), 2952-2966 (2017).
  18. Delgado-Montero, A., et al. Blood stasis imaging predicts cerebral microembolism during acute myocardial infarction. Journal of the American Society of Echocardiography. 33 (3), 389-398 (2020).
  19. Lu, C. Y., Lu, P. C., Chen, P. C. Utilization trends in traditional Chinese medicine for acute myocardial infarction. Journal of Ethnopharmacology. 241, 112010(2019).
  20. Gao, Z. Y., Xu, H., Shi, D. Z., Wen, C., Liu, B. Y. Analysis on outcome of 5284 patients with coronary artery disease: the role of integrative medicine. Journal of Ethnopharmacology. 141 (2), 578-583 (2012).
  21. Huang, Z., et al. Crocetin ester improves myocardial ischemia via Rho/ROCK/NF-kappaB pathway. International Immunopharmacology. 38, 186-193 (2016).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Estimation of cell number by hemocytometry counting. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (11), (2019).
  23. Zeng, Q., et al. Assessing the potential value and mechanism of Kaji-Ichigoside F1 on arsenite-induced skin cell senescence. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022, 9574473(2022).
  24. Chazotte, B. Labeling mitochondria with JC-1. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
  25. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods in Molecular Biology. 887, 41-47 (2012).
  26. Yuan, Y., et al. Palmitate impairs the autophagic flux to induce p62-dependent apoptosis through the upregulation of CYLD in NRCMs. Toxicology. 465, 153032(2022).
  27. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Western blotting. Methods. 38 (4), 283-293 (2006).
  28. Chen, G. Y., et al. Total flavonoids of rhizoma drynariae restore the MMP/TIMP balance in models of osteoarthritis by inhibiting the activation of the NF-κB and PI3K/AKT pathways. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 6634837(2021).
  29. Amin, A., Hamza, A. A., Bajbouj, K., Ashraf, S. S., Daoud, S. Saffron: a potential candidate for a novel anticancer drug against hepatocellular carcinoma. Hepatology. 54 (3), 857-867 (2011).
  30. Kamalipour, M., Akhondzadeh, S. Cardiovascular effects of saffron: an evidence-based review. The Journal of Tehran Heart Center. 6 (2), 59-61 (2011).
  31. Mani, V., Lee, S. K., Yeo, Y., Hahn, B. S. A metabolic perspective and opportunities in pharmacologically important safflower. Metabolites. 10 (6), 253(2020).
  32. Broadhead, G. K., Chang, A., Grigg, J., McCluskey, P. Efficacy and safety of saffron supplementation: current clinical findings. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 56 (16), 2767-2776 (2016).
  33. Gao, H., et al. Insight into the protective effect of salidroside against H2O2-induced injury in H9C2 cells. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 1060271(2021).
  34. Chen, G. Y., et al. Prediction of rhizoma drynariae targets in the treatment of osteoarthritis based on network pharmacology and experimental verification. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 5233462(2021).
  35. Reers, M., et al. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods in Enzymology. 260, 406-417 (1995).
  36. Radovits, T., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibition improves endothelial dysfunction induced by reactive oxidant hydrogen peroxide in vitro. European Journal of Pharmacology. 564 (1-3), 158-166 (2007).
  37. Song, M., et al. Interdependence of parkin-mediated mitophagy and mitochondrial fission in adult mouse hearts. Circulation Research. 117 (4), 346-351 (2015).
  38. Gan, Z. Y., et al. Activation mechanism of PINK1. Nature. 602 (7896), 328-335 (2022).
  39. Nguyen, T. N., Padman, B. S., Lazarou, M. Deciphering the molecular signals of PINK1/Parkin mitophagy. Trends in Cell Biology. 26 (10), 733-744 (2016).
  40. Yamada, T., Dawson, T. M., Yanagawa, T., Iijima, M., Sesaki, H. SQSTM1/p62 promotes mitochondrial ubiquitination independently of PINK1 and PRKN/parkin in mitophagy. Autophagy. 15 (11), 2012-2018 (2019).
  41. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (4th edition). Autophagy. 17 (1), 1(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

H9c2 Myocardial CellsOxidative StressCrocetin TreatmentPINK1 Parkin PathwayMitophagy RegulationMitochondrial Membrane PotentialReactive Oxygen SpeciesAutophagic FluxWestern BlottingConfocal Microscopy

Related Articles