Adipositlerde trigliserit lipoliz, serbest yağ asitlerinin ve gliserolün serbest bırakılmasıyla sonuçlanan önemli bir metabolik süreçtir. Burada, adipositlerde bazal ve uyarılmış lipolizi ve farelerden ex vivo yağ dokusunu ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Lipoliz Oranının Ex Vivo Murin Yağ Dokusu ve İn Vitro Diferansiye Primer Preadipositlerin Ölçülmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Adipositler, lipit damlacıklarında trigliseritler şeklinde enerji depolar. Bu enerji, yağ asidi yan zincirlerinin gliserol omurgasından sırayla ayrıldığı ve serbest yağ asitlerinin ve gliserolün salınmasına neden olan lipoliz yoluyla harekete geçirilebilir. Beyaz adipositlerde gliserol kinazın düşük ekspresyonu nedeniyle, gliserol geri alım oranları ihmal edilebilirken, yağ asidi geri alımı, albümin gibi medya bileşenlerinin yağ asidi bağlama kapasitesi tarafından belirlenir. Hem gliserol hem de yağ asidinin ortama salınımı, lipolitik oranı belirlemek için kolorimetrik testlerle ölçülebilir. Bu faktörleri birden fazla zaman noktasında ölçerek, lipolizin doğrusal oranını yüksek güvenle belirleyebilirsiniz. Burada, farelerden in vitro diferansiye adipositlerin ve ex vivo yağ dokusunun lipoliz ölçümü için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol ayrıca diğer preadiposit hücre hatları veya diğer organizmalardan yağ dokusu için optimize edilebilir; Dikkat edilmesi gereken noktalar ve optimizasyon parametreleri ele alınmıştır. Bu protokol, fare modelleri ve tedavileri arasındaki adiposit lipoliz oranını belirlemede ve karşılaştırmada yararlı olacak şekilde tasarlanmıştır.
Giriş
Fazla besinler, lipit damlacıklarının nötr lipit çekirdeğinde trigliseritler şeklinde beyaz yağ dokusunda depolanır. Trigliserit depoları, yağ asidi yan zincirlerinin yağ dokusu trigliserit lipaz (ATGL), hormona duyarlı lipaz (HSL) ve monogliserit lipaz (MGL) tarafından sırayla bölündüğü ve serbest yağ asitlerinin (FFA'lar) ve gliserol omurgasının 1,2 salınımına neden olan bir süreç olan lipoliz yoluyla mobilize edilir. Lipoliz, yağ dokusunda katekolamin sinyalizasyonu ile aktive edilir. Sempatik sinir terminalleri, adiposit plazma zarındaki β-adrenerjik reseptörlere bağlanan katekolaminleri lokal ola....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvanların kullanımı, Cornell Üniversitesi Weill Cornell Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Tamponların ve toplama plakalarının hazırlanması
- 5 g BSA'yı 100 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) içinde fenol kırmızısı olmadan çözerek% 5 sığır serum albümini (BSA) yapın. BSA'yı çözünmesi için hafifçe karıştırın (sallamak verimsizdir). BSA tamamen çözündükten sonra, ortamı 0,2 μm filtre ile filtreleyerek sterilize edin. BSA ortamını 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
- Kontrol ve stimülasyon ortamının çalışma konsantrasyonlarını yapın....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
İn vitro diferansiye adipositlerin bazal ve uyarılmış lipolitik oranlarını ölçtük. Kasık beyaz yağ dokusundan primer preadipositler, 5 μM deksametazon, 0.5 mM IBMX, 1 μg / mL insülin ve 1 μM troglitazon ile 4 gün boyunca konfluent hücrelerin tedavisi ile adipositlere farklılaştırıldı ve ardından 1 μg / mL insülin ile 3 günlük ek bir tedavi uygulandı. Hücreler lipoliz tahlilinden önce 24 saat boyunca insülinsülsüz ortamda inkübe edildi. Zaman = 0h'de, hücreler bir kez PBS ile yıkandı, daha sonra 10 μM CL-316,243 .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, adipositlerde ve ex vivo yağ dokusunda lipoliz oranını ölçmek için temel bir protokol sunuyoruz. Lipolizi ölçmek için, doğrusal fazda lipolitik hızı ölçmek önemlidir. Ortamın büyük bir kısmının toplandığı ve düzenli aralıklarla taze ortamlarla değiştirildiği seri örnekleme tekniği kullanıyoruz. Bu yarı konservatif yöntem, FFA tamponlama kapasitesine sahip taze BSA'nın eklenmesine izin verir ve lineer lipoliz süresini uzatarak geri besleme inhibisyonunu geciktirir. Bu deneysel tasarım, yağ dokusunun vaskü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından S.M.R.'ye R01DK126944 hibesi ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 24-Kuyucuklu doku kültürü ile tedavi edilmiş plaka | Corning Inc | 3527 | Adiposit farklılaşması için doku kültürü ile tedavi edilmelidir |
| 48-Kapaklı düz tabanlı plaka | Corning Inc | 353078 | Doku kültürü ile tedavi edilebilir |
| 6-Kapaklı düz tabanlı plaka | Corning Inc | 353046 | Doku kültürü ile tedavi edilebilir |
| 96 Kuyulu PCR Plakası | ABD sceintific | 1402-9100 | Herhangi bir konik 0.2 mL PCR plakası uygun olacaktır |
| Sığır Serumu Albümin | Sigma Aldrich | A9418 | FFA içermeyen BSA, örneğin A8806 da yaygın olarak kullanılmaktadır. BSA'nın tespit edilebilir FFA'sı olmamalıdır, ayrıca BSA'daki lottan partiye varyasyonlar gözlemlenen lipoliz oranını etkileyebilir |
| CL-316,243 | Sigma Aldrich | C5976 | CAS #: 138908-40-4 diğer tedarikçilerden temin edilebilir |
| CO2 inkübatörü | PHCBI | MCO-170AICUVH | CO2 ideal olarak yağ dokusu için %10'a ayarlanmalıdır, ancak %5 CO2 de işe yarayacaktır |
| DMEM, düşük glikoz, fenol kırmızısı | Thermofischer | 11054020 | Herhangi bir fenol kırmızısı içermeyen ortam çalışmalı, DMEM / F12, RPMI, ancak uçucu tamponlama kapasitesi, yani biyokarbonat |
| FFA içermeyen Sığır serum albümini | Equitech-Bio, Inc, | BAH66 | |
| Serbest Gliserol Reaktifi | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Gliserol Standart Çözelti | Sigma Aldrich | G7793 | Bu, gliserolün istenen konsantrasyona seyreltilmesiyle de yapılabilir |
| HR Serisi NEFA Standart Çözüm | Fujifilm | 276-76491 | |
| HR Serisi NEFA-HR (2) Renk Reaktifi A | Fujifilm | 999-34691 | |
| HR Serisi NEFA-HR (2) Renk Reaktifi B | Fujifilm | 991-34891 | |
| HR Serisi NEFA-HR (2) Solvent A | Fujifilm | 995-34791 | |
| HR Serisi NEFA-HR (2) Solvent B | Fujifilm | 993-35191 | |
| Mikrobiyolojik İnkübatör | Fischer Scientific | S28668 | 37C'de herhangi bir inkübatör kullanılabilir |
| Nunc MicroWell 96 Kuyulu Plakalar | Thermo Scientific | 269620 | Optik olarak şeffaf, düz tabanlı 96 oyuklu plaka çalışır |
| Silikon Laboratuvar Tezgah Üstü Mat | VWR | 76045-300 | Cam plaka da kullanılabilir. Emici yüzeyler önerilmez |
| Spektrofotometre/Mikroplaka Okuyucu | Moleküler cihazlar | SpectraMax i3x | 540, 550 ve 660 mm'de okuyabilen herhangi bir plaka okuyucu çalışacaktır |
| V Sığır serum albümini | Sigma-Aldrich | 810531 | |
| WypAll X70 Silecekler | Kimberly-Clark | 41200 | Herhangi bir yüksek kaliteli kağıt havlu işe yarayacaktır |
Kaynaklar
- Vaughan, M., Berger, J. E., Steinberg, D. Hormone-sensitive lipase and monoglyceride lipase activities in adipose tissue. The Journal of Biological Chemistry. 239, 401-409 (1964).
- Zimmermann, R., et al. Fat mobilization in adipose tiss....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
