Yöntem makalesi

Ferritinofaji: İnsan Fibroblastlarında Otofaji ile Demirin Seçici Bozunmasının Değerlendirilmesi

2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65110

⸱

23 Şubat 2024

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

Bu makalede

Özet

Bu protokol, birincil, deriden türetilmiş insan fibroblastlarında yüksek verimli, immünofloresan bazlı ferritinofaji değerlendirmeleri yapmak için ayrıntılı talimatlar sağlar.

Özet

Otofaji geni WDR45/WIPI4'teki mutasyonlar, hastaların beyinlerinde demir birikintilerinin varlığına bağlı olarak beyin demir birikimi (NBIA) ile nörodejenerasyon olarak bilinen insan hastalıklarının bir alt tipi olan beta-pervane ile ilişkili nörodejenerasyonun (BPAN) nedenidir. Hücre içi demir seviyeleri, ferritinofajinin kritik mekanizması da dahil olmak üzere bir dizi hücresel mekanizma tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bu makale, birincil, deri kaynaklı insan fibroblastlarında ferritinofajinin nasıl değerlendirilebileceğini açıklamaktadır. Bu protokolde, lizozom fonksiyonunu inhibe etmek için bafilomisin A1'in uygulanması ve demiri aşırı yüklemek veya tüketmek için sırasıyla ferrik amonyum sitrat (FAC) veya deferasioks (DFX) tedavileri gibi hücresel düzeyde ferritinofajiyi indüklemek veya inhibe etmek için demir modüle edici koşullar kullanıyoruz. Bu tür tedavi edilmiş fibroblastlar daha sonra yüksek verimli görüntülemeye ve endojen ferritin ve otofagozomal / lizozomal belirteçlerin CellProfiler tabanlı kantitatif lokalizasyon analizine tabi tutulur, burada LAMP2. Otofagozomal/lizozomal ferritin seviyesine bağlı olarak, ferritinofaji seviyesi ile ilgili sonuçlar çıkarılabilir. Bu protokol, BPAN hastadan türetilen primer fibroblastlarda veya diğer memeli hücrelerinde ferritinofajiyi değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

WIPI (fosfoinositidlerle WD-tekrar etkileşimi) proteinleri, otofaji1'de farklı rollere sahip evrimsel olarak korunmuş PI3P efektörleridir. Dört insan WIPI proteini (WIPI1'den WIPI4'e kadar), homolog ve değişmez amino asitlerin pervanenin zıt bölgelerinde kümelendiği evrimsel olarak korunmuş iki bölgeye sahip yedi kanatlı β pervanelere katlanır. Bir bölge, pervane kanadı 5 ve kanat 6'daki fosfoinositid bağlama bölgesi ile hizalanmıştır. Diğer bölge, WIPI'lerin otofaji mekanizmasının farklı üyeleri veya otofaji düzenleyici faktörler2 ile ilişkili olduğu protein-protein etkileşim bölgesi ile uyumludur.

WIPI4, enerji güdümlü otofaji düzenlemesini kontrol etmede ve büyüyen yeni ortaya çıkan otofagozom3'ün boyutunu kontrol etme düzeyinde işlev görür. WDR45 olarak adlandırılan WIPI4 genindeki bir mutasyon, insan hastalarda beyin demir birikimi (NBIA) alt tipine sahip bir nörodejenerasyon olan ve substantia nigra ve globus pallidus4'te hipointens bir demir halesi ile karakterize edilen beta-pervane ilişkili nörodejenerasyonun (BPAN) nedenidir. BPAN hastalarında anormal demir birikintilerinin varlığı, ensefalopati, küresel gelişimsel gecikme, nöbetler ve nihayetinde parkinsonizm, demans ve spastisiteye dönüşen nöronal hasara neden olur5.

Demir homeostazı, çoklu hücresel mekanizmalar tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir, sitozolik demir konsantrasyonu, demir taşıyıcılarının, demir taşıyıcılarının ve demir depolama proteinlerininekspresyon seviyeleri ve işlevselliği tarafından kontrol edilir 6 . Sitozolik demir konsantrasyonu, sırayla, ferritinofaji7 veya oksitlenmiş ferritin8'in proteazomal klerensi gibi bozunma yollarının dahil olup olmadığını belirler.

Ferritinofaji sırasında, ferritin, kargo reseptörü NCOA4 tarafından seçici olarak otofagozomlara alınır ve düşük hücre içi demir seviyelerine7 yanıt olarak lizozomal bozunma için hedeflenir. WIPI4'ün otofagozomal membranların3 boyutunu düzenlemedeki rolü göz önüne alındığında, bu spesifik fonksiyonun kaybının, otofagozomlarda ferritinin seçici sekestrasyonunu ve dolayısıyla ferritinofajiyi etkileyebileceğini tahmin etmek mantıklıdır. Demir metabolizmasındaki bu önemli adımı incelemek, BPAN hastaları için terapötik seçeneklere kapı açabilir; Bununla birlikte, insan hücrelerinde ferritinofajiyi incelemek için yaygın olarak kullanılan protokoller ancak şu anda geliştirilmektedir.

Bu makale, insan hücrelerinde ferritinofajiyi değerlendirmek için yüksek verimli, floresan tabanlı bir yöntemi açıklamaktadır. Bu testin hastadan türetilen BPAN hücrelerine uygulanması, ferritinofajinin sağlıklı insan hücrelerine kıyasla nasıl farklılaştığına dair değerli bilgiler sağlayabilir ve bu nadir insan hastalığının altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir ölçüt görevi görebilir.

Protokol

1. Birincil hücrelerin kültürlenmesi ve tohumlanması

  1. Sıvı nitrojen tankından donmuş hücrelerin bulunduğu şişeyi getirin ve hücre kültürü odasına ulaşana kadar buz üzerinde tutun. Önceden sterilize edilmiş bir başlıkta, hücre süspansiyonunun çözülmesi için şişeyi elinizde tutun. Hücreleri yeniden süspanse edin ve bunları %10 fetal buzağı serumu (FCS) ve %1 penisilin-streptomisin (P / S) ile 9 mL önceden ısıtılmış DMEM içeren 10 cm'lik bir hücre kültürü plakasına aktarın. Hücrelerin plaka üzerinde eşit olarak dağılması için hafifçe çalkalayın ve gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin
  2. Ertesi sabah, bağlı olduklarını doğrulamak için hücrelere bakın. Ortamı taze DMEM +% 10 FCS +% 1 P / S olarak değiştirin ve hücrelerin% 80 birleşmeye ulaşana kadar büyümesine izin verin.
  3. Kültür ortamını çıkarın, 2x'i DPBS ile yıkayın, plakaya 1 mL tripsin ekleyin ve 37 ° C ve% 5 CO2'de 10 dakika inkübe edin. Plakaya 9 mL DMEM +% 10 FCS ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin.
  4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bir Neubauer odası kullanarak hücre sayısını manuel olarak belirleyin ve 40.000 hücre / mL'lik bir hücre konsantrasyonu elde edilene kadar hücre süspansiyonunu DMEM +% 10 FCS'de seyreltin.
  5. Cam tabanlı 96 oyuklu bir plakada, hücre süspansiyonunun 100 μL/kuyusunu tohumlayın. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 16 saat inkübe edin.

2. Tedaviler

  1. Aşağıdaki işlemleri Malzeme Tablosuna göre hazırlayın: demir şelasyonu için kontrol ortamı, kontrol ortamı artı deferasiox (DFX) veya demir yüklemesi için kontrol ortamı artı ferrik amonyum sitrat (FAC). Ferritinofaji akısının değerlendirilmesi için bir lizozomal inhibitörün (bafilomisin A1) hem varlığında hem de yokluğunda tüm tedavileri hazırlayın.
  2. Kültür ortamını plakadan çıkarın ve karşılık gelen işlemle (100 μL / kuyu) değiştirin.
  3. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 6 saat inkübe edin.

3. Fiksasyon ve boyama

  1. Tedavi ortamını aspire edin ve 2x'i DPBS (Malzeme Tablosu) ile yıkayın.
  2. Kuyucuk başına 100 μL %3.7 paraformaldehit (PFA, Malzeme Tablosu) ekleyin. Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika sabitleyin.
  3. PFA'yı çıkarın ve hücreleri 2x PBS/T (Malzeme Tablosu) ile yıkayın.
  4. 4 ° C'de 1 saat boyunca% 1 sığır serum albümini (BSA) içeren PBS / T'de blok.
  5. Birincil antikoru (Malzeme Tablosu) PBS/T'de (ferritin antikoru 1:50, LAMP2 antikoru 1:50) karıştırın.
  6. Hücreleri 2x PBS / T ile yıkayın ve kuyucuk başına 50 μL antikor karışımı uygulayın. Plakaları parafilm ile sarın ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  7. Ertesi sabah, PBS / T'de ikincil antikor (Malzeme Tablosu) karışımını (1:200) hazırlayın.
  8. Hücreleri 2x PBS / T ile yıkayın ve kuyucuk başına 50 μL ikincil antikor karışımı uygulayın. Karanlıkta 1 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  9. Oda sıcaklığında PBS'de 5 μg / μL 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Malzeme Tablosu) çözeltisi hazırlayın.
  10. Hücreleri 2x PBS / T ile yıkayın ve 100 μL / kuyu DAPI boyası ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  11. Hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın ve her kuyucuğa 50 μL PBS ekleyin. Plakaları parafilm ile sarın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın.

4. Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak otomatik görüntüleme

  1. Plakadaki PBS'yi oda sıcaklığında 50 μL taze PBS ile değiştirin.
  2. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve mikroskopi odasına götürün.
  3. Konfokal lazer tarama mikroskobunu açın, mikroskop tablasına 96 oyuklu plakalar için bir numune tutucu yerleştirin ve uygun bir objektif seçin (burada: 40x). Ayrıntılar için Tablo 1'e bakın.
  4. Görüntüleme ayarlarını yapın (Tablo 1).
    1. Akıllı Kurulum'da, lazerleri ve filtreleri seçin ve optimum görüntü kalitesi ve hızı için bunları parçalara (Parça 1-3) atayın (Tablo 1).
    2. Deney türünü seçerken, plaka üzerinde belirlenen X,Y konumlarını seçme ve kaydetme seçeneğini etkinleştirmek için Döşemeler'e tıklayın.
    3. Görüntüleme Kurulumu modülünde, alım kanallarını, bunlara atanan izleri ve bunların uyarma ve emisyon dalga boylarını görselleştirin (Tablo 1).
    4. Edinme Modu modülünde aşağıdakileri seçin: Tarama Hızı: 6; Yön: çift yönlü; Ortalama: 2x; Piksel başına bit sayısı: 8.
    5. Kanallar modülünde, her kanal için lazer gücünü, iğne deliğini ve ana kazancı ayrı ayrı ayarlayın (Tablo 2). Aşırı doygunluğa maruz kalmadan düzgün pozlanmış görüntüler elde etmek için bu parametrelere ince ayar yapın.
    6. Odak strateji modülüne tıklayın.
      1. Yazılım Otomatik Odaklama ve Kesin Odağı Birleştir'i seçin.
      2. Referans Kanalı ve Ofsetler altında, referans olarak en kararlı/en parlak kanalı seçin (normalde DAPI veya 488 nm).
      3. Stabilizasyon Olayı Tekrarları ve Sıklığı altında, Standart'ı seçin.
    7. Yazılım Otofokus modülünde aşağıdakileri seçin: Mod | Yoğunluk; Arama | Akıllı; Örnekleme | İyi; Göreceli Aralık.
    8. Fayanslar modülüne tıklayın.
      1. Pozisyonları Seçin | tek pozisyonlar.
      2. Gelişmiş Kurulum altında, plakada gezinin, görüntüleme için bir konum belirleyin ve Konum Ayarı sekmesinin altındaki + düğmesine tıklayın.
      3. Her konumu, görüntü meta verilerine kaydedilecek ek bilgilerle etiketleyin. Bunu yapmak için, Özellikler sekmesini açın, Kategori açılır menüsünün yanındaki tekerlek simgesine tıklayın ve yeni kategori adının girileceği yeni bir iletişim kutusu açmak için Yeni'ye tıklayın. Belirli bir konuma bir kategori atamak için konumu seçin, Özellikler sekmesine tıklayın, Kategoriler açılır menüsüne gidin ve ilgili etiketi seçin.
        NOT: Hücrelerin tabi tutulduğu tedavi ile her pozisyonu etiketlemek için her tedavi için bir kategori oluşturulması önerilir.
      4. Sample Carrier (Numune Taşıyıcı) altında, Multiwell 96-Cellvis glass bottom #0'ı seçin. Mikroskobu plaka yüzeyine kalibre etmek için Kalibre Et'e tıklayın. Sistemin özelliklerine bağlı olarak 1 nokta veya 7 nokta kalibrasyonu arasında seçim yapın.
      5. Seçenekler'in altında, %10'luk bir kutucuk çakışması seçin. Döşeme Bölgelerinde Seyahat'in altında Tara'yı seçin. Aşağıdakileri işaretleyin: sahne kontrolünden sahne hızını kullanın, sahne kontrolünden aşama hızlandırmayı kullanın ve alım sırasında görüntü piramidini kullanın.
  5. Görüntü alımını çalıştırın ve görüntü sonuçlarını (czi dosyaları) ve görüntü meta verilerini (csv dosyaları) taşınabilir bir sabit sürücüye kaydedin.
  6. Görüntüleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarın.

5. Yüksek verimli görüntü analizi

  1. Aşağıdaki sütunlarla ayrı bir meta veri elektronik tablo dosyası oluşturun: Konum, Kuyu, Durum, Seri ve Küme. Bu sütunları doldurmak için uygun veriler, konfokal lazer tarama mikroskobundan gelen orijinal meta veri dosyasından alınır.
  2. Açık kaynaklı yazılım CellProfiler 4.2.4'ü (https://cellprofiler.org/previous-releases) indirin.
  3. Çift tıklayarak CellProfiler 4.2.4'ü başlatın ve CellProfiler işlem hattını (Ek Dosya 1) sürükleyip bırakarak içe aktarın.
    NOT: DAPI boyama (Modül 1, çekirdek tanıma, bkz. Tablo 2) ve AF488'den türetilen tek hücrelerde arka plan floresansı (Modül 2, hücre tanıma, bkz. Tablo 2) kullanılarak fibroblastların otomatik olarak tanınması için CellProfiler boru hattını (Ek Dosya 1) derleme adımlarını aşağıda bulabilirsiniz. Puncta (terimli nesneler) tanıma, puncta boyutu ve arka plan üzerindeki puncta floresan yoğunluğu ile belirlenir (Modül 3, puncta tanıma, bkz. Tablo 2). Son olarak, hücre sınırlarına göre, yazılım tarafından tanınan puncta karşılık gelen hücrelere atanır (İlişkileri ata). Otofaji çalışmaları için bir CellProfiler boru hattının nasıl uygulanacağına dair ayrıntılı bir açıklama daha önce yayınlanmıştır9. Ek olarak, Tablo 2 bu çalışmada kullanılan CellProfiler ayarlarını içerir. Ayrıca, Ek Dosya 2, CellProfiler boru hattını (Ek Dosya 1) ardışık sırayla alınan ekran görüntüleriyle ve Tablo 2'de ayrıntılı olarak açıklanan modüllere atıfta bulunarak görüntüler.
  4. CellProfiler işlem hattını (Ek Dosya 1) uyarlamadan önce, tek tek .czi görüntü dosyalarını veya birden çok .czi görüntü dosyası içeren bir klasörü Görüntü modülüne sürükleyip bırakın.
  5. Görüntü tanıma işlem hattını özelleştirin. İsimler ve Türler modülünde, c1-c3 kodunu , yazılımın analiz edilecek tek kanallı görüntüleri tanımlamasına ve sıralamasına izin veren bir kodla değiştirin.
  6. Modüllerdeki sayısal girişleri iyileştirerek IdentifyPrimaryObjects ve IdentifySecondaryObjects modülleri için işlem hattı ayarlarını ayarlayın. Bu çalışmada kullanılan değerler Tablo 2'de sunulmuştur.
  7. Ayarlamaları takip etmek için, Test Modunu Başlat düğmesine tıklayarak Test Modu seçeneğini seçin. Ardından modüller arasındaki Adım butonuna tıklayınız. Bir görüntünün yeni girilen ayarlarla nasıl analiz edileceğini gösteren açılır pencereleri (orijinal giriş görüntüsü, orijinal görüntünün üzerine çizilen tanıma ana hatları ve analiz sonucu) bekleyin.
  8. İşlem hattı optimize edildikten sonra test modunu sonlandırın. Test Modundan Çık'ı etkinleştirerek ve ardından Görüntüleri Analiz Et düğmesine tıklayarak analizi gerçekleştirin.
  9. Analiz tamamlandıktan sonra, giriş görüntülerini CellProfiler tarafından oluşturulan bindirme çıktılarıyla (hücre sınırları, puncta) karşılaştırarak hücre ve puncta algılamanın doğruluğunu doğrulayın. Tatmin edici değilse, analiz sonucu yeterince doğru olana kadar farklı modüllerdeki (Tablo 2) sayısal değerleri ayarlayın.

6. Veri analizi

  1. Analizi çalıştırdıktan sonra, yazılımın sonuçlarla birlikte bir dizi tablo metin dosyası oluşturmasını bekleyin. Sağlanan CellProfiler işlem hattını (Ek Dosya 1) kullanıyorsanız, aşağıdaki çıktı dosyalarını arayın:
    1. Yazılım tarafından atanan görüntü numarasını, tek hücrelere atanan hücre numarasını, orijinal dosya adını ve dosyaların nerede depolandığını gösteren yolu, hücre başına puncta sayısını (ferritin, LAMP2) ve hücre başına ortalama puncta alanını (ferritin, LAMP2) listeleyen CellProfilerOutputCells dosyası.
    2. Deneyle ilgili teknik ayrıntılar (ör. yazılım sürümü, görüntü kanalları, meta veri etiketleri) hakkında bilgi sağlayan CellProfilerOutputExperiment dosyası.
  2. Bu dosyaları elektronik tablolar olarak açın.
  3. Tercih edilen istatistik yazılımını (Malzeme Tablosu) kullanarak puncta sayılarının ve puncta ortak yerelleştirme sayılarının istatistiksel analizini yapmaya devam edin.

Sonuçlar

Sağlıklı donörlerden (Şekil 1A) insan derisinden elde edilen primer fibroblastlar (F-CO-60), baflomisin A1 tedavisi kullanılarak ferritinofaji değerlendirmeleri için hazırlandı, ardından endojen ferritin ve LAMP2'nin immün boyama, otomatik görüntü analizi ve CellProfiler tabanlı analiz yapıldı (Şekil 1B).

Endojen ferritin ve LAMP2'nin kolokalizasyonu, ferritinin lizozomal bozunması, lizozomal V-ATPaz enzimlerini inhibe etme ve dolayısıyla ferritinofaji7'yi bloke etme kabiliyeti ile tutarlı olarak bafilomisin A1 ilavesiyle bloke edildikten sonra artmıştır (Şekil 2). Ek olarak, yazılım tabanlı hücre tanımanın yanı sıra ferritin ve LAMP2 tanıma da örnek olarak gösterilmiştir (Şekil 2).

Bu bağlamda, burada özetlenen CellProfiler boru hattının son derece çok yönlü olduğu ve belirli BPAN mutasyonlarının hücre büyümesi, mitokondri veya fonksiyonel tek hücreli marker sistemleri bağlamında diğer organeller üzerindeki etkilerini değerlendirmek gibi ek ve/veya alternatif okumalara uyarlanabileceği belirtilmelidir.

figure-results-1
Şekil 1: Deneysel genel bakış. Bu protokolde açıklandığı gibi, (A) ferritinofaji sürecinin ve (B) birincil deri kaynaklı insan fibroblastlarında ferritinofajiyi değerlendirmek için deneysel iş akışının grafiksel gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Temsili resimler. Bafilomisin A1'in (A) yokluğunda veya (B) varlığında kontrol ortamında (beslenen koşullarda) birincil deri kaynaklı insan fibroblastları, anti-ferritin ve anti-LAMP2 antikorları kullanılarak dolaylı bir immünofloresan analizine tabi tutulurken, hücre çekirdekleri DAPI ile boyandı. Konfokal lazer taramalı mikroskopi otomasyonu ile elde edilen örnek floresan görüntüler sunulmaktadır (ölçek çubukları: 10 μm). Bafilomisin A1 uygulaması üzerine lizozomal inhibisyon üzerine ferritin ve LAMP2 bolluğu ve kolokalizasyonunda değişiklikler gözlenebilir. Hücre tanıma (mor), çekirdek (mavi), ferritin (yeşil), LAMP2 (kırmızı) ve ferritin/LAMP2 (sarı) punkta'nın yazılımdan türetilmiş görüntü katmanlarını gösteren CellProfiler tabanlı analiz de görüntülenir. (C) Büyütülmüş görüntü bölümleri (ölçek çubuğu = 10 μm). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan konfokal lazer taramalı mikroskopi ayarları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan sayısal CellProfiler ayarları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Bu çalışmada kullanılan CellProfiler işlem hattı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: CellProfiler işlem hattının ardışık sırayla alınan ekran görüntüleriyle görüntülenmesi (bkz. Ek Dosya 1) (bkz. Tablo 2). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Anahtar ferritinofaji faktörlerinin hücre içi lokalizasyonunu değerlendirmek için açık erişimli CellProfiler tabanlı görüntü analizi9 ile birlikte otomatik floresan mikroskobu kullanan bu yöntem, ferritinofaji7 olarak adlandırılan seçici otofaji yoluyla lizozomal ferritin klerensinin etkinliği hakkında değerli bilgiler sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu protokol, aynı anda birden fazla hücre hattı ve muamelesi olan büyük numune setlerinin işlenmesini ve ferritinofaji akısını değerlendirmek için tipik bir lizozomal belirteç olan LAMP2 ile birlikte lokalize olan ferritin punkta sayıları ve ferritin punkta sayıları gibi istenen okumaların değerlendirilmesini sağlar. Bununla birlikte, burada, doğru, otomatik görüntü analizinin görüntü kalitesine bağlı olduğu ve bunun da antikor özgüllüğüne ve optimal görüntülemeye bağlı olduğu vurgulanmalıdır. Bu nedenle, yazılım tabanlı görüntü analizi yalnızca yüksek kaliteli görüntülerle yapılmalıdır.

Hücrelerdeki demir seviyelerinin modülasyonu, hastalık bağlamında demir homeostazını düzenlemek için aktive edilen mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Bu makale, demir yükleme ve demir şelatlama ajanları ile tedavi edilen hasta kaynaklı hücrelerde BPAN hastalıklarını incelemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Deferasiox (DFX),10 alanında yaygın olarak kullanılan bilinen bir demir şelatörüdür. Uygulandığında, serbest demiri sitoplazmada hapseder ve demir açlığına hücresel bir yanıtı tetikler. Bu çalışmanın amacı ferritinofajiyi değerlendirmek olduğundan, demir hücrelerini mahrum bırakmak, hücresel demir havuzunu yenilemek için bir kompanzasyon mekanizması olarak otofaji yoluyla ferritin bozulmasını teşvik etmenin basit bir yoluydu. Ferrik amonyum sitrat (FAC), aksine, hücreleri demir ile yüklemek için kullanılır. Hücreler, aşırı ve dolayısıyla toksik sitozolik demir konsantrasyonlarına bir yanıt olarak ferritin sentezini aktive eder11. Ferrik amonyum sitrat, bu nedenle, ferritin sentezini ve demirin ferritin heteropolimerleri içinde sıkışmasını teşvik eder ve bu da ferritinofajiyi aktive edebilir.

Ferritinofajik akıyı incelemek için, bu protokolde, süreçteki anahtar oyuncuları - ferritin ve lizozomları (burada LAMP2 ile işaretlenmiştir) seçici olarak boyayız ve bunların kolokalizasyonunu değerlendiriyoruz. Yüksek bir kolokalize punkta yüzdesi, ferritinin etkili lizozomal bozunmasının göstergesidir. Bu tür deneylerden elde edilen bilgileri en üst düzeye çıkarmak için ek boyalar veya işaretleyici antikorlar kullanılabilir.

Dikkat çekici bir şekilde, bu yöntemin doğasında teknik zorluklar vardır. Farklı insan donörlerinden türetilen primer fibroblastlar in vitro olarak çoğalabilir ve farklı şekilde büyüyebilir. Bu nedenle, karşılaştırılabilir sonuçlar için, aynı geçitte farklı hücreler tohumlanmalıdır. Bu nedenle, kullanılacak hücrelerin veya hücre hatlarının iki katına çıkma sürelerini incelemek için bu protokole devam etmeden önce bir test deneyi yapılması tavsiye edilir.

Bu yöntem ferritinofaji çalışması ile sınırlı değildir; Kullanılan tedavileri ve antikorları basitçe değiştirerek, diğer çeşitli seçici otofaji yollarını değerlendirmek için yeniden kullanılabilir; örneğin, mitofaji, mitokondriyal stres indükleyicisi olarak CCCP ve boyama12 için optineurin, LC3 ve LAMP2 antikorları kullanılarak incelenebilir.

Genel olarak, otomatik görüntü toplama ve CellProfiler analizinin kombinasyonu, tek insan fibroblastlarının yüksek verimli fonksiyonel değerlendirmesi için güçlü bir araç oluşturur. Bu, özellikle hastadan türetilmiş hücrelerin ve sağlıklı donörden türetilmiş hücrelerin büyük kohortlarının analizi ve karşılaştırılmasının büyük ilgi gördüğü insan hastalıklarının incelenmesi ile ilgilidir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) Projesi-ID 259130777 - SFB 1177 (proje E03) tarafından finanse edilmiştir. Şekil 1 , BioRender kullanılarak oluşturulmuştur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Hücre hatları
Birincil cilt kaynaklı insan fibroblastları Deri biyopsisi, sağlıklı insan verici, Biobank Üniversitesi Kliniği Tü bingen, Etik onay 389/2019BO2F-CO-60, geçit 9
Hücre kültürü tedavileriNihai konsantrasyon (bileşik)
Kontrol ortamıDMEM %10 FCS(yalnızca DMSO)
Kontrol ortamı + bafilomisinA1DMEM %10 FCS100 nM bafilomisin A1
Kontrol ortamı + deferasiox (DFX)DMEM% 10 FCS30 ve mikro; M DFX
Kontrol ortamı + DFX + bafilomisinA1DMEM% 10 FCS30 ve mikro; M DFX, 100 nM bafilomisin A1
Kontrol ortamı + ferrik amonyum sitrat (FAC)DMEM% 10 FCS0.05 mg / mL FAC
Kontrol ortamı + FAC + bafilomisinA1DMEM% 10 FCS0.05 mg / mL FAC, 100 nM bafilomisin A1
< güçlü > Malzeme< / güçlü >
Albümin [BSA] Fraksiyon VAppliChemA1391
Alexa 488 keçi tavşanıYaşam TeknolojileriA-11008
Alexa 546 keçi a-fareYaşam TeknolojileriA-11003
Bafilomisin A1Sigma Aldrich196000
BioLite Hücre Kültürü ile işlenmiş 10 cm'lik tabaklarThermo Scientific130182
DAPIAppliChemA4099
Deferasiox (ICL-670)SelleckchemS1712
DMEM GlutamaxGibco31966
DMSO AppliChemA3672
DPBS kalsiyum veya magnezyum içermezGibco14190094
Fetal sığır serumu (FCS)Gibco10437-028
Ferrik amonyum sitrat (FAC)MerckF5879
Anti-FERRITIN (İnsan Dalağı)Rockland200-401-090-0100
LAMP2 (H4B4)Santa CruzSc-18822
Paraformaldehit (PFA)Sigma-Aldrich441244
PBS 10x Dulbecco' sAppliChemA0965
PenStrep (1,00U/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisin)Yaşam Teknolojileri15140-122
Tripsin-EDTA (%0.05) fenol kırmızısıGibco25300
ile Tween20AppliChemA4974
96 kuyulu cam tabanlı # 0 plakaCellvisP96-0-N
Solution
% 3.7 paraformaldehit (PFA)PBS, pH 7.5 
Bafilomisin A1 100 mM stoğuiçinde seyreltilmiş Bafilomisin A1
100 mg / mL stokFAC otoklavlanmış çift damıtılmış su
PBS / TPBS,% 10 Tween20 ile desteklenmiştir;
PBS/T + BSAPBS, %10 Tween20, %1 BSA  ile desteklenmiş;
Software
CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
GraphPadPrism Dotmatics
Microsoft Excel Sürüm 16.50Microsoft Office Plus 365
DMSO Ferrik amonyum sitrat (FAC)

Kaynaklar

  1. Proikas-Cezanne, T., Takacs, Z., Dönnes, P., Kohlbacher, O. WIPI proteins: Essential PtdIns3P effectors at the nascent autophagosome. Journal of Cell Science. 128 (2), 207-217 (2015).
  2. Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
  3. Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).
  4. Hayflick, S. J., et al. β-Propeller protein-associated neurodegeneration: A new X-linked dominant disorder with brain iron accumulation. Brain. 36, 1708-1717 (2013).
  5. Wilson, J. A. -O., et al. Consensus clinical management guideline for beta-propeller protein-associated neurodegeneration. Developmental Medicine and Child Neurology. 63 (12), 1402-1409 (2021).
  6. Gao, G., Li, J., Zhang, Y., Chang, Y. Z. Cellular iron metabolism and regulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1173, 21-32 (2019).
  7. Mancias, J. D., Wang, X., Gygi, S. P., Harper, J. W., Kimmelman, A. C. Quantitative proteomics identifies NCOA4 as the cargo receptor mediating ferritinophagy. Nature. 509 (7498), 105-109 (2014).
  8. Voss, P., Horakova, L., Jakstadt, M., Kiekebusch, D., Grune, T. Ferritin oxidation and proteasomal degradation: Protection by antioxidants. Free Radical Research. 40 (7), 673-683 (2006).
  9. Schüssele, D. S., et al. Autophagy profiling in single cells with open source CellProfiler-based image analysis. Autophagy. 19 (1), 338-351 (2023).
  10. Goodwin, J. M., et al. Autophagy-independent lysosomal targeting regulated by ULK1/2-FIP200 and ATG9. Cell Reports. 20 (10), 2341-2356 (2017).
  11. Quiles del Rey, M., Mancias, J. D. NCOA4-mediated ferritinophagy: A potential link to neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 13, 238(2019).
  12. Zachari, M., et al. Selective autophagy of mitochondria on a ubiquitin-endoplasmic-reticulum platform. Developmental Cell. 50 (5), 627-643 (2019).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Demir HomeostazLizozomal Ferritin DegradasyonuOtofaji Gen MutasyonuY ksek z n rl kl G r nt lemeKonfokal MikroskopiCellProfiler Analizimm n boyamaLAMP2 Mark r
Ferritinofaji: İnsan Fibroblastlarında Otofaji ile Demirin Seçici Bozunmasının Değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.