İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC'lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Koroner arter baypas greft (KABG) cerrahisi iskemik miyokardın revaskülarize edilmesi için yapılan bir prosedürdür. Safen ven, arteriyel kanallara kıyasla azalmış uzun süreli açıklığa rağmen CABG kanalı olarak kullanılmaya devam etmektedir. Greft arteriyelizasyonu ile ilişkili hemodinamik stresin ani artışı, safen ven greftinin (SVG) düşük açıklığını etkileyebilecek vasküler hasara, özellikle de endotelle sonuçlanır. Burada, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) izolasyonu, karakterizasyonu ve genişlemesi anlatılmaktadır. Kollajenaz sindirimi ile izole edilen hücreler tipik parke taşı morfolojisini gösterir ve endotel hücre belirteçleri CD31 ve VE-kadherini eksprese eder. Mekanik stres etkisini değerlendirmek için, bu çalışmada, arteriyalize SVG'ler üzerindeki iki ana fiziksel uyaranı, kayma stresini ve gerilmeyi araştırmak için protokoller kullanılmıştır. hSVEC'ler, kayma gerilmesi üretmek için paralel bir plaka akış odasında kültürlenir, akış yönünde hizalama ve KLF2, KLF4 ve NOS3'ün artan ekspresyonunu gösterir. hSVEC'ler ayrıca venöz (düşük) ve arteriyel (yüksek) gerilmeyi taklit eden kontrollü hücresel gerilmeye izin veren bir silikon membranda kültürlenebilir. Endotel hücrelerinin F-aktin paterni ve nitrik oksit (NO) sekresyonu buna göre arteriyel gerilme ile modüle edilir. Özetle, hemodinamik mekanik stresin endotel fenotipi üzerindeki etkisini incelemek için hSVEC'leri izole etmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.
Giriş
Endotel hücre (EC) disfonksiyonu safen ven greft yetmezliğinde anahtar rol oynar1,2,3,4. Kayma stresinin ve siklik gerilmenin sürekli artışı, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) proinflamatuar fenotipini indükler3,4,5,6. Altta yatan moleküler yollar hala tam olarak anlaşılamamıştır ve in vitro çalışmalar için standartlaştırılmış protokoller, bölgedeki yeni anlayışlar için çabalardan yararlanab....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Safen venlerin kullanılmayan segmentleri, São Paulo Üniversitesi Tıp Fakültesi Kalp Enstitüsü'nde (InCor) aortokoroner bypass ameliyatı geçiren hastalardan elde edildi. Tüm bireyler, yerel etik kurul tarafından gözden geçirilen ve onaylanan çalışmaya katılmak için bilgilendirilmiş onam vermiştir.
1. Primer insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) izolasyonu, kültürü ve karakterizasyonu
- Hazırlık
- Bir çift düz veya kavisli forseps ve doku makası (7-8 cm) otoklavlayın.
- Steril jelatin hazırlayın. 0,1 g (%0,1 w/v) veya 3 g (%3 w/v) domuz derisi jelatinini 100 mL ultra saf su ile karıştırın, 15 ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tipik olarak, yapışmış EC'ler ekstraksiyondan 3-4 gün sonra gözlenebilir. hSVEC'ler başlangıçta hücre kümeleri oluşturur ve tipik bir "parke taşı" morfolojisi gösterir (Şekil 1B). EC belirteçleri CD31 (Şekil 1C,D) ve VE-kadherini (Şekil 1D) ifade ederler. hSVEC'ler, kaplanmamış tedavi edilmiş bir hücre kültürü kabında kolayca çoğaltılabilir ve kültürdeki endotel fenotipini sekiz pasaja kadar korurlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
hSVEC'leri başarılı bir şekilde izole etmek için safen ven segmenti en az 2 cm olmalıdır. Küçük segmentlerin, hücreleri izole etmek için kollajenaz çözeltisini korumak için damarın uçlarını tutması ve bağlaması zordur. Azaltılmış luminal yüzey alanı, kültürü genişletmek için yeterli hücre vermez. ECs olmayanlarla kontaminasyon riskini en aza indirmek için, safen ven segmentinin manipülasyonu tüm prosedür boyunca çok nazik olmalıdır. Kanı çıkarmak için pipet uçlarını luminal yüzeylere sokarken ve kollajenaz çözeltisinin u.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
JEK, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ve 2013/17368-0] ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ve 309179/2013-0) hibeleriyle desteklenmektedir. AAM, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9) hibeleriyle desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.25 Tripsin-% 0.02 EDTA çözeltisi | Gibco | 25200072 | |
| 15 & mikro slayt I 0.4 Luer & nbsp; | Ibidi | 80176 | |
| 4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dilaktat (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| 25 mm & nbsp'lik 6 kuyulu eş eksenli yükleme istasyonu; | Flexcell Uluslararası Şirketi | LS-3000B25. Çıkarılabilir kuyulu VJW | |
| 8 kuyulu oda kaydırağı | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Asetik Asit (Buzul) | Millipore | 100063 | |
| 1 cm kalınlığında akrilik levha | Pleksiglas | ||
| Anti-CD31 antikoru | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, FITC antikoru | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anti-VE-kaderin antikoru | Hücre Sinyali | 2500 | |
| Bioflex plakalar kollajen I | Flexcell International Corporation | BF3001C | |
| Sığır serum albümin çözeltisi | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Pamuk sütür EP 3.5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Siklofilin ileri astar | Thermo Fisher Bilimsel | Özel tasarlanmış | |
| Siklofilin ters astar | Thermo Fisher Scientific Özel | tasarlanmış | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| EBM-2 bazal ortam | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots takviyeleri | Lonza | CC4176 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Flexcell FX-5000 gergi sistemi | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Fluoromount sulu montaj ortamı | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Domuz derisinden elde edilen jelatin | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Gliserol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Keçi anti-Fare IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Keçi anti-Tavşan IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum 5000 IU / mL | Blau Farmac & ecirc; utica | SKU 68027 | |
| Ibidi pompa sistemi (Pompa + Akışkan Ünitesi) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 ileri astar | Thermo Fisher Scientific | Özel tasarlanmış | |
| KLF2 ters astar | Thermo Fisher Scientific | Özel tasarlanmış | |
| KLF4 ileri astar | Thermo Fisher Scientific | Özel tasarlanmış | |
| ters astar | Thermo Fisher Scientific | Özel tasarlanmış | |
| NOA 280 nitrik oksit analizörü | Sievers Instruments | NOA-280i-1 | |
| NOS3 ileri astar | Thermo Fisher Scientific | Özel tasarlanmış | |
| NOS3 ters astar | Thermo Fisher Scientific | Özel tasarlanmış | |
| Paraformaldehit (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Perfüzyon seti 15 cm, ID 1.6 mm, kırmızı, 10 mL rezervuarlar | Ibidi | 10962 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Phalloidin - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Potasyum İyodür | Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR yeşil PCR kiti | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K esnek platform | Uygulamalı Biyosistemler | 4471087 | |
| RNeasy mikro kiti | Quiagen | 74004 | |
| Sürgülü cam (24 mm x 60 mm) | Knittel Glass | VD12460Y1D.01 | |
| Sodyum nitrit | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| SuperScript IV birinci iplikli sentez sistemi | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tripan mavisi leke %0.4 | Gibco | 15250-061 | |
| Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885'ten |
Kaynaklar
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechani....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
