Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma

1.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65122

⸱

21 Nisan 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto do Coraçao (InCor), Hospital das Clinicas HCFMUSP, Faculdade de Medicina, Universidade de Sao Paulo, 2Cardiology Research Group, Faculty VI Medicine and Health Sciences, Carl von Ossietzky University of Oldenburg

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

İnsan safen ven endotel hücrelerini (hSVEC'ler) izole etmek ve kültürlemek için bir protokol tanımladık. Ayrıca, hSVEC'lerde mekanik gerilimi incelemek için kesme gerilmesi ve gerilme üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz.

Özet

Koroner arter baypas greft (KABG) cerrahisi iskemik miyokardın revaskülarize edilmesi için yapılan bir prosedürdür. Safen ven, arteriyel kanallara kıyasla azalmış uzun süreli açıklığa rağmen CABG kanalı olarak kullanılmaya devam etmektedir. Greft arteriyelizasyonu ile ilişkili hemodinamik stresin ani artışı, safen ven greftinin (SVG) düşük açıklığını etkileyebilecek vasküler hasara, özellikle de endotelle sonuçlanır. Burada, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) izolasyonu, karakterizasyonu ve genişlemesi anlatılmaktadır. Kollajenaz sindirimi ile izole edilen hücreler tipik parke taşı morfolojisini gösterir ve endotel hücre belirteçleri CD31 ve VE-kadherini eksprese eder. Mekanik stres etkisini değerlendirmek için, bu çalışmada, arteriyalize SVG'ler üzerindeki iki ana fiziksel uyaranı, kayma stresini ve gerilmeyi araştırmak için protokoller kullanılmıştır. hSVEC'ler, kayma gerilmesi üretmek için paralel bir plaka akış odasında kültürlenir, akış yönünde hizalama ve KLF2, KLF4 ve NOS3'ün artan ekspresyonunu gösterir. hSVEC'ler ayrıca venöz (düşük) ve arteriyel (yüksek) gerilmeyi taklit eden kontrollü hücresel gerilmeye izin veren bir silikon membranda kültürlenebilir. Endotel hücrelerinin F-aktin paterni ve nitrik oksit (NO) sekresyonu buna göre arteriyel gerilme ile modüle edilir. Özetle, hemodinamik mekanik stresin endotel fenotipi üzerindeki etkisini incelemek için hSVEC'leri izole etmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Giriş

Endotel hücre (EC) disfonksiyonu safen ven greft yetmezliğinde anahtar rol oynar1,2,3,4. Kayma stresinin ve siklik gerilmenin sürekli artışı, insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) proinflamatuar fenotipini indükler3,4,5,6. Altta yatan moleküler yollar hala tam olarak anlaşılamamıştır ve in vitro çalışmalar için standartlaştırılmış protokoller, bölgedeki yeni anlayışlar için çabalardan yararlanabilir. Burada, hSVEC'leri izole etmek, karakterize etmek ve genişletmek için basit bir protokolü ve bunların venöz ve arteriyel hemodinamik koşulları taklit ederek değişken seviyelerde kayma stresi ve siklik gerilmeye nasıl maruz bırakılacağını açıklıyoruz.

hSVEC'ler kollajenaz inkübasyonu ile izole edilir ve 8. pasaja kadar kullanılabilir. Bu protokol, mevcut diğer protokollere kıyasla damarın daha az manipülasyonunu gerektirir7, bu da düz kas hücreleri ve fibroblastlarla kontaminasyonu azaltır. Öte yandan, verimli EC ekstraksiyonuna sahip olmak için en az 2 cm'lik daha büyük bir kap segmenti gerektirir. Literatürde, büyük damarlardan alınan ECs'lerin mekanik uzaklaştırma ile de elde edilebileceği bildirilmiştir 7,8. Etkili olmasına rağmen, fiziksel yaklaşım düşük EC verimi ve daha yüksek fibroblast kontaminasyonu gibi dezavantajlara sahiptir. Saflığı arttırmak için, manyetik boncuklar veya hücre sıralama kullanarak ekstra adımlara ihtiyaç vardır, bu da boncukların ve antikorların elde edilmesi nedeniyle protokolün maliyetini arttırır7,8. Enzimatik yöntem, EC saflığı ve canlılığı ile ilgili daha hızlı ve daha iyi sonuçlara sahiptir 7,8.

Endotel disfonksiyonunu incelemek için en sık kullanılan EC'ler insan umbilikal ven endotel hücreleridir (HUVEC'ler). EC fenotipinin farklı damar yataklarında değiştiği bilinmektedir ve incelenen damarı temsil eden yöntemlerin geliştirilmesi esastır 9,10. Bu bakımdan, bir hSVEC'in izole edilmesi ve mekanik stres altında kültürlenmesi için bir protokol oluşturulması, ven grefti hastalığında hSVEC disfonksiyonunun katkısını anlamak için değerli bir araçtır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Safen venlerin kullanılmayan segmentleri, São Paulo Üniversitesi Tıp Fakültesi Kalp Enstitüsü'nde (InCor) aortokoroner bypass ameliyatı geçiren hastalardan elde edildi. Tüm bireyler, yerel etik kurul tarafından gözden geçirilen ve onaylanan çalışmaya katılmak için bilgilendirilmiş onam vermiştir.

1. Primer insan safen ven endotel hücrelerinin (hSVEC'ler) izolasyonu, kültürü ve karakterizasyonu

  1. Hazırlık
    1. Bir çift düz veya kavisli forseps ve doku makası (7-8 cm) otoklavlayın.
    2. Steril jelatin hazırlayın. 0,1 g (%0,1 w/v) veya 3 g (%3 w/v) domuz derisi jelatinini 100 mL ultra saf su ile karıştırın, 15 dakika otoklavlayın ve 4 °C'de saklayın. Hücre kültürü bulaşıklarını ve slaytlarını kaplamadan önce sıvılaştırmak için 37 ° C'ye kadar ısıtın.
    3. Laminer akış davlumbazının içinde steril kollajenaz (1 mg / mL) hazırlayın. Kollajenazı PBS'de seyreltin ve 0,2 μm'lik bir filtre ile sterilize edin.
    4. 60 mm'lik bir hücre kültürü kabını ve 8 delikli bir odacık sürgüsünü 37 ° C'de en az 30 dakika boyunca %0,1 w/v jelatin ile kaplayın. Hücreleri tohumlamadan önce fazla jelatini çıkarın.
    5. Tam endotel hücre ortamı hazırlayın: EGM2 büyüme faktörleri ile desteklenmiş endotel hücre büyümesi bazal ortamı (EBM-2).
      NOT: EGM2 büyüme faktörleri, Malzeme Tablosunda listelenen bir şirket tarafından kit olarak tedarik edilmektedir. Faktörlerin konsantrasyonu şirket tarafından açıklanmaz.
    6. Hepsi fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 2 ve% 5 sığır serum albümini (BSA),% 4 paraformaldehit (PFA) ve% 0.1 Triton X-100 çözeltileri yapın.
  2. hSVEC'lerin izolasyonu ve kültürü
    1. Bu prosedür için en az 2-3 cm uzunluğunda safen damar segmenti toplayın.
      NOT. Tüm hücre kültürü prosedürleri steril koşullar altında ve laminer bir akış davlumbazının içinde gerçekleştirilmelidir.
    2. Damar segmentini önceden ısıtılmış PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Damarın bir ucuna bir pipet ucu yerleştirin ve lümenin içindeki tüm kanı çıkarmak için PBS ile hafifçe yıkayın. Yıkama akışı tamamen netleşene kadar yıkayın.
    3. Damarın uçlarından birini steril bir pamuk sütü ile kapatın. Kabı dikkatlice 1 mg / mL kollajenaz tip II çözeltisi ile doldurun. Kabın diğer ucunu pamuklu bir sütür ile kapatın (Şekil 1A). Kabı kollajenaz çözeltisi ile 1 saat boyunca 37 ° C'de% 5 CO2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin.
    4. Bundan sonra, kabın uçlarından birini 15 mL'lik bir tüp içinde kesin ve kollajenaz çözeltisini toplayın. Diğer ucu kesin ve tüm ayrılmış EC'leri toplamak için luminal yüzeyi 1-2 mL PBS ile yıkayın. Tüm PBS'yi aynı tüpün içine kollajenaz çözeltisi ile bir araya getirin.
    5. Hücreleri pelet haline getirmek için tüpü oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
      NOT. Hücre peleti çok küçüktür ve görselleştirilmesi zordur. Kollajenaz tedavisinden önce kan tamamen çıkarılmazsa (adım 1.2.2.), kan hücreleri de çökelir ve pelet kırmızımsı olur.
    6. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 3-4 mL tam endotel hücre ortamında (EGM2 büyüme faktörleri ile desteklenmiş EBM-2) ve ek bir heparin çözeltisinde (5 U / mL, nihai konsantrasyon) yeniden askıya alın. Hücreleri, %3 w/v jelatin ile önceden kaplanmış 60 mm'lik bir hücre kültürü kabında kaplayın.
      NOT: Jelatin, erişilebilirlik kolaylığı ve düşük maliyeti nedeniyle ilk tercihtir. Jelatinli kaplama EC fenotipini başarıyla koruduğundan, başka hiçbir kaplama maddesi test edilmemiştir. Kollajenler ve fibronektin, farklı hücre dışı matriks bileşenlerinin EC adezyonu ve fenotip üzerindeki etkisini araştırmayı amaçlayan çalışmalarda test edilebilir.
    7. Hücreleri 37 ° C'de, ortamı değiştirmeden 4 gün boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. Bundan sonra, medyayı her geçen gün değiştirin. Bu andan itibaren, heparin ile ek hücre ortamı takviyesi artık gerekli değildir. Kırmızı kan hücrelerinin çıkarıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında inceleyin.
    8. Ekstraksiyondan 3-10 gün sonra, damar segmentinin boyutuna ve çapına bağlı olarak, hSVEC'leri faz-kontrast mikroskobu ile görselleştirin.
    9. Faz-kontrast mikroskobunda birleşim derecesini ve parke taşı morfolojisini değerlendirir.
    10. Hücreler% 70-80 akıcılığa ulaşana kadar her 2 günde bir ortamı değiştirmeye devam edin.
    11. HSVEC'leri% 0.25 tripsin-% 0.02 etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile geçirin.
      1. Hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın.
      2. 60 mm'lik hücre kültürü kabına 1 mL tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. 37 ° C'de 2 dakika boyunca veya tüm hücreler ayrılana kadar inkübe edin.
      3. Tripsini inaktive etmek için 2 mL tam endotel hücre ortamı ekleyin.
      4. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
      5. Süpernatantı atın ve hücreleri 1 mL kültür ortamında yeniden askıya alın.
      6. Canlı hücreleri plakalamak için hücre süspansiyonunu 1: 1 tripan mavisinde (% 0.4) sayın.
      7. Kültürü genişletmek için, hücreleri 100 mm'lik bir hücre kültürü kabında 10 mL önceden ısıtılmış tam endotel hücre ortamı ile kaplayın ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de kültürleyin.
        NOT. Ortalama olarak, 4 x 104 hSVEC /cm2'nin tohumlaması 48 saat sonra% 100 akıcı olacaktır.
    12. Hücreleri kriyoproteksiyona tabi tutmak için, pelet adım 1.2.11.5'ten itibaren fetal sığır serumunda (FBS) %5 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde yeniden askıya alın ve sıvı azotta depolayın.
  3. hSVEC'lerin karakterizasyonu: CD31 için akım sitometri boyama
    1. 1 x 10 5 hSVEC'leri bir1,5 mL tüpe aktarın ve RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın. süpernatantı atın ve peleti% 2 BSA ve CD31-FITC monoklonal antikoru (1:100) içeren 100 μL PBS'de yeniden askıya alın.
    2. Karanlıkta RT'de hücreleri 30 dakika boyunca lekeleyin.
    3. Lekeli hücreleri 0.5 mL PBS ekleyerek yıkayın ve RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. süpernatantı atın ve hücre peletini% 2 BSA ile 400 μL PBS'de yeniden askıya alın.
    4. Negatif kontrol olarak CD31 antikoru olmayan etiketsiz hSVEC'leri kullanın.
    5. Mavi bir lazer ve FITC kanalı (498/517 nm'lik uyarma/emisyon maksimumu [Ex/Em]) kullanarak akış sitometresi edinme analizine devam edin. Başka florokromlar kullanılıyorsa, sitometrenin algılamaları için uygun filtre setlerine sahip olup olmadığını kontrol edin. Hücreleri büyüklükleri ve tanecikleri işlevinde enkazdan ayırın, ardından tek hücreleri ileri saçılma ve yan saçılma ile değiştirin.
  4. hSVEC'lerin karakterizasyonu: CD31 ve VE-kadherin için floresan boyama
    1. Plaka 0.1 x 105 hücreli jelatin kaplı 8 kuyucuklu odacıklı kızaktadır. Hücrelerin kültür yüzeyine yapışmasını sağlamak için hücreleri gece boyunca 37 ° C, % 5 CO2'de inkübe edin.
    2. Ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın.
    3. Hücreleri sabitlemek için 0.3 mL / kuyu% 4 PFA ekleyin. RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    4. PBS ile üç kez yıkayın.
    5. Hücreleri geçirgenleştirmek için 0.3 mL/kuyu %0.1 Triton X-100 çözeltisi ekleyin. RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    6. PBS ile üç kez yıkayın.
    7. Spesifik olmayan antikor bağlanma bölgelerini bloke etmek için, hücrelere 0.3 mL/kuyu% 5 BSA çözeltisi ekleyin. RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    8. PBS ile üç kez yıkayın.
    9. PBS'de seyreltilmiş birincil antikorlarla (CD31 ve VE-kadherin, 1:100) hücreleri gece boyunca %2 BSA ile 4 °C'de hafifçe sallanarak inkübe edin. Negatif kontrol olarak% 2 BSA (birincil antikor yok) ile PBS ile inkübe edilen bir kuyu bırakın.
    10. PBS ile üç kez yıkayın.
    11. RT'de 1 saat boyunca PBS'de seyreltilmiş (1:500) floresan olarak etiketlenmiş ikincil antikorlarla hücreleri inkübe edin. nükleer boyama için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ekleyin 1 mg / mL'lik nihai konsantrasyona.
    12. PBS ile üç kez yıkayın.
    13. Ortam odasını ayırıcı ile çıkarın. Montaj ortamı reaktifinin bir damlasını (PBS'de% 50 gliserol) yerleştirin ve kabarcıkları yakalamaktan kaçınırken bir cam slayt (24 mm x 60 mm) yerleştirin.
    14. Hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
      NOT: DAPI, bir DAPI ışık küpüyle algılanır (Ör: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) ve CD31/VE-kadherin, yeşil floresan protein (GFP) ışık küpü (Ör: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Benzer uyarma/emisyon dalga boyu aralığına sahip ışık küpleri de bu florokromlar için yeterlidir. Başka florokromlar kullanılıyorsa, kullanılan mikroskopun algılamaları için uygun filtre setlerine sahip olup olmadığını kontrol edin.

2. hSVEC'lerde kayma gerilmesi

  1. Hazırlık
    1. Akış odası sürgüsünü 37 °C'de en az 30 dakika boyunca jelatinle %0,1 oranında kaplayın. Hücreleri tohumlamadan önce fazla jelatini çıkarın.
    2. Akışkan üniteyi ve steril perfüzyon setini, inkübatörün içinde gece boyunca 10 mL rezervuarlarla 37 ° C'de% 5 CO2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde dengeleyin.
  2. Kesme gerilmesi deneyi
    1. Tohum 2 x 105 ECs, jelatin kaplı akış odası sürgüsüne 100 μL EC ortamında askıya alınır. Hücrelerin kültür yüzeyine yapışmasını sağlamak için hücreleri 37 ° C'de 4 saat ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    2. Perfüzyon setini, üreticinin talimatlarında açıklandığı gibi akışkan üniteye yerleştirin. Rezervuarları ve perfüzyonu yaklaşık 12 mL önceden ısıtılmış tam endotel hücre ortamında doldurun. Her iki rezervuarın seviyesini 5 mL'de dengelemek için perfüzyon setinden manuel olarak hava kabarcıklarını çıkarın.
    3. Akışkan üniteyi, monte edilmiş perfüzyon seti ile, oda sürgüsü olmadan, inkübatöre yerleştirin ve elektrik kablosunu bilgisayar tarafından düzenlenen pompaya bağlayın. Pompa kontrol yazılımında önceden tanımlanmış bir protokol çalıştırarak rezervuarlardan ve perfüzyon setinden tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
      NOT. Sistemin düzgün çalışması için hava kabarcıklarının giderilmesi çok önemlidir.
    4. Akışkan üniteyi, laminer akış başlığına monte edilmiş perfüzyon seti ile alın ve slaytları bir konfluent hücre tek katmanı ile takın.
    5. Akışkan üniteyi monte edilmiş perfüzyon ve kızaklarla inkübatördeki hücrelerle yerleştirin ve elektrik kablosunu pompaya bağlayın.
    6. Pompa kontrol yazılımında, aşağıdaki parametreleri ayarlayın: ortamın viskozitesi (0,0072), kızak tipi, perfüzyon seti kalibrasyon faktörü, kayma gerilmesi oranı (20 dyn/cm2), akış tipi (tek yönlü) ve zaman (72 saat) ve akışı başlatın (daha fazla ayrıntı için ekipman talimatlarına bakın). Aynı ortamla muamele edilen hücreleri statik kontroller olarak akışa maruz kalmadan toplayın.
    7. Uyaran tamamlandıktan sonra, hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve numuneleri gerekli tahlile göre toplamaya devam edin. Floresan boyama için adım 2.3.1'e ve RNA ekstraksiyonu için adım 2.3.2'ye bakın.
  3. Kesme gerilmesi protokolünün etkinliğinin gösterilmesi
    1. Aktin filamentlerinin floresan boyaması (F-aktin)
      1. Hücreleri 1.4.2-1.4.6 adımlarında belirtildiği gibi sabitleyin ve geçirgenleştirin. μ slaytta 100 μL'lik bir hacim kullanın.
      2. F-aktinini floresan etiketli falloidin (PBS'de 1:200'de seyreltilir) ile lekeleyin ve çekirdeği RT'de ışıktan korunmuş 2 saat boyunca DAPI (PBS'de 1 mg / mL'lik son konsantrasyon) ile karşı karşıya getirin.
      3. PBS ile üç kez yıkayın.
      4. Hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
        NOT: DAPI, bir DAPI ışık küpüyle algılanır (Ör: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) ve falloidin bir GFP ışık küpü ile tespit edilir (Ör: 459-481 nm; Em: 500-550 nm). Benzer bir uyarma / emisyon dalga boyu aralığına sahip ışık küpleri de bu florokromlar için yeterlidir. Başka florokromlar kullanılıyorsa, kullanılan mikroskopun algılamaları için uygun filtre setlerine sahip olup olmadığını kontrol edin.
    2. Gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon (RT-qPCR) ile gen ekspresyonu
      1. Hücreleri 350 μL ticari guanidin-tiyosiyanat içeren lizis tamponu ile μ slayttan toplayın. Toplam RNA'yı, üreticinin talimatlarına göre kolon tabanlı ekstraksiyon kitleri ile izole edin.
        NOT: μ-slaytta kültürlenen sınırlı sayıda hücre nedeniyle, RNA'nın sütun bazlı ekstraksiyonunun kullanılması önerilir.
      2. Üreticinin talimatlarına göre, transkriptaz ters enzimli bir cDNA sentez kiti kullanarak cDNA'yı hazırlayın.
      3. Kesme gerilimi tarafından düzenlenen genlerin ekspresyonunu doğrulayın: KLF2, KLF4 ve NOS3. Sonuçları normalleştirmek için kahya geni PPIA / siklofilin kullanın. Reaksiyon için spesifik primerler Tablo 1'de listelenmiştir.
      4. RT-qPCR'yi aşağıdaki reaksiyon koşulları altında bir SYBR yeşil floresan DNA boyama kiti kullanarak gerçekleştirin: i) 2 dakika boyunca 50 °C, ii) 15 dakika boyunca 95 °C, iii) 15 s için 94 °C, iv) 30 s için 60 °C, v) 30 s için 72 °C. 40 döngü boyunca iii ile v arasındaki adımları tekrarlayın. Astarın özgüllüğünü doğrulamak için reaksiyonun sonuna bir eritme adımı ekleyin.

3. hSVEC'lerde döngüsel gerilme

  1. Hazırlık
    1. 25 mm'lik 6 delikli eşeksenli yükleme istasyonunun üst kısımlarına ve yanlarına silikon bazlı yağlayıcı uygulayın.
      NOT: Bu, kültür plakası membranı ile istasyon arasındaki sürtünmeyi azaltarak döngüsel gerinimin daha iyi dağıtılmasını sağlar. Bu adım her denemeden önce yapılmalıdır.
  2. Döngüsel esneme deneyi
    1. Tohum 4 x 10Kollajen I ile kaplanmış 6 kuyucuklu esnek tabanlı kültür plakalarının her bir kuyucuğuna 3 mL olarak asılı 5 hücre (Malzeme Tablosu). Kontrol grubu olarak statik durumda bir plaka (lar) a sahip olmayı planlayın. Hücreleri inkübatörde (% 5 CO2 ile nemlendirilmiş havada 37 ° C) % 100 akıcılığa ulaşana kadar (genellikle tohumlamadan 48 saat sonra) tutun. Germe protokolünün başlamasından önce, hücreleri önceden ısıtılmış PBS ile bir kez yıkayın ve kuyucuk başına 3 mL taze kültür ortamı ekleyin.
    2. Taban plakasını inkübatördeki tüm yağlanmış yükleme istasyonlarıyla birlikte yerleştirin ve boruyu gerilim hücresi germe biyoreaktör sisteminin kontrolör ekipmanına uygun şekilde bağlayın (daha fazla ayrıntı için ekipman talimatlarına bakın).
    3. Her kültür plakasını, gerilim hücresi germe biyoreaktör sistemi tarafından sağlanan bir kırmızı contaya takın. Ardından, bunları inkübatörün içindeki taban plakasına yerleştirin.
      1. Vakum pompalama sırasında hava sızıntısını önlemek için plakaların taban plakasına tam olarak oturduğundan, preslendiğinden ve kapatıldığından emin olun. Uygun vakum ve germe yüklemesine sahip olmak için taban plakasında dört kültür plakasının hepsinin bulunması önemlidir.
      2. Daha az deney plakasına sahip olmanız durumunda, taban plakasındaki dört konumu tamamlamak için boş bir tane (ler) kullanın. Taban plakası sızdırmazlığını iyileştirmek için akrilik levhayı (ekipmanla birlikte verilir) kültür plakalarının üzerine ekleyin. Statik plakaları aynı inkübatöre yerleştirin.
    4. Oyun kumandası ekipmanını ve bilgisayar sistemini açın. Yazılım simgesini açın ve istediğiniz rejimi yapılandırın: kullanılacak yükleme istasyonunun boyutu, gerinim tipi, uzama yüzdesi, dalga formu şekli, frekans ve zaman. Ayrıntılı bilgi için üreticinin yönergelerine bakın. Rejimi seçin ve indirin. Burada, aşağıdaki rejim kullanılmıştır: 1/2 sinüs dalga formu şekli, 1 Hz frekans, uzamanın% 5'i (venöz gerilmeyi taklit etmek için) ve uzamanın% 15'i (arteriyel gerilmeyi taklit etmek için) 72 saate kadar.
    5. Vakum sistemini açın ve germe işlemini çalıştırmak için bilgisayar ekranında Başlat'a tıklayın. Silikon membranın hareket edip etmediğini ve hücreleri gerip germediğini kontrol edin.
    6. Uyaran tamamlandıktan sonra, hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve numuneleri gerekli tahlile göre toplamaya devam edin. Burada, siklik gerilmenin etkinliğini göstermek için, hSVEC kültür ortamını toplayın, daha fazla nitrik oksit (NO) ölçümü için -80 ° C'de tutun ve floresan boyama için hücreleri sabitleyin.
      NOT. Taban plakası, kullanılmadığında inkübatörün içinde saklanamaz; Aksi takdirde, sıcaklık düz şekli değiştirebilir ve işe yaramaz hale getirebilir.
  3. Döngüsel gerilme protokolünün etkinliğinin gösterilmesi
    1. F-aktinin floresan boyaması
      1. Hücreleri adım 1.4.3'te gösterildiği gibi düzeltin. Kuyu başına 1 mL'lik bir hacim kullanın.
      2. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri PBS'de tutun, böylece silikon membranı sonraki adımlar için hazırlarken kurumazlar.
      3. Fazla silikon bazlı yağlayıcıyı membranın tabanından çıkarmak için pamuklu çubuk kullanın. Ardından, yeni bir pamuklu çubukla yavaşça pencere temizleyicisi veya el sabunu uygulayın. Tüm yağlayıcı membrandan çıkarılana kadar işlemi tekrarlayın. Ardından, deiyonize su ile temizleyin.
        NOT. İyi kalitede mikroskopi görüntülerine sahip olmak için yağlayıcıyı silikon membrandan tamamen çıkarmak önemlidir.
      4. Silikon membranları, boyama için 8 delikli odacıklı slaytlara sığacak şekilde dikkatlice küçük parçalara ayırın. Hücreleri adım 1.4.5'te belirtildiği gibi geçirgenleştirin.
      5. Yıkama adımlarından sonra, F-aktin'i faloidin kullanarak ve çekirdeği DAPI ile lekeleyin. 2.3.1.2 ve 2.3.1.3 adımlarında belirtildiği gibi analize devam edin. Oda başına 0,3 mL'lik bir hacim kullanın.
      6. Ortam odasını ayırıcı ile çıkarın. Bir damla montaj ortamı reaktifi (PBS'de% 50 gliserol) yerleştirin ve bir cam slayt (24 mm x 60 mm) yerleştirin.
      7. Hücreleri floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
        NOT: DAPI, bir DAPI ışık küpüyle algılanır (Ör: 335-379 nm; Em: 417-477 nm) ve faloidin kırmızı floresan protein (RFP) ışık küpü (Ör: 511-551 nm; Em: 573-613 nm). Benzer bir uyarma / emisyon dalga boyu aralığına sahip ışık küpleri de bu florokromlar için yeterlidir. Başka florokromlar kullanılıyorsa, kullanılan mikroskopun algılamaları için uygun filtre setlerine sahip olup olmadığını kontrol edin.
    2. NO ölçümü-potasyum iyodür bazlı indirgeyici kemilüminesans testi kullanılarak hSVEC şartlandırılmış ortamdaki nitrit (NO2) birikimi ile tahmin edilir
      1. Hazırlık
        1. 0.01-10 mM sodyum nitrit (ultra saf sudaNaNO2 ) çözeltisinden standart bir eğri hazırlayın.
        2. Nitrik oksit analizörünün temizleme kabına 5 mL asetik asit ve 1 mL potasyum iyodür (1 mL ultra saf suda 50 mg) ekleyin.
      2. Ölçüm YOK
        1. Nitrik oksit analizörünün temizleme kabınaNaNO2 standart eğrisinin 20 μL'sini ekleyin. Üreticinin protokolüne göre ölçün.
    3. Nitrik oksit analizörünün temizleme kabına 20 μL şartlandırılmış ortam ekleyin. Üreticinin protokolüne göre ölçün.
    4. Standart eğri kalibrasyonuna göreNO2 konsantrasyonlarını hesaplayın. Analiz edilen şartlandırılmış ortamın toplam hacmi ile elde edilen değerleri ayarlayın 6,11.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tipik olarak, yapışmış EC'ler ekstraksiyondan 3-4 gün sonra gözlenebilir. hSVEC'ler başlangıçta hücre kümeleri oluşturur ve tipik bir "parke taşı" morfolojisi gösterir (Şekil 1B). EC belirteçleri CD31 (Şekil 1C,D) ve VE-kadherini (Şekil 1D) ifade ederler. hSVEC'ler, kaplanmamış tedavi edilmiş bir hücre kültürü kabında kolayca çoğaltılabilir ve kültürdeki endotel fenotipini sekiz pasaja kadar korurlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

hSVEC'leri başarılı bir şekilde izole etmek için safen ven segmenti en az 2 cm olmalıdır. Küçük segmentlerin, hücreleri izole etmek için kollajenaz çözeltisini korumak için damarın uçlarını tutması ve bağlaması zordur. Azaltılmış luminal yüzey alanı, kültürü genişletmek için yeterli hücre vermez. ECs olmayanlarla kontaminasyon riskini en aza indirmek için, safen ven segmentinin manipülasyonu tüm prosedür boyunca çok nazik olmalıdır. Kanı çıkarmak için pipet uçlarını luminal yüzeylere sokarken ve kollajenaz çözeltisinin u...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

JEK, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 ve 2013/17368-0] ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 ve 309179/2013-0) hibeleriyle desteklenmektedir. AAM, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) ve Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9) hibeleriyle desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 Tripsin-% 0.02 EDTA çözeltisiGibco25200072
15 & mikro slayt I 0.4 Luer & nbsp;Ibidi80176
4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dilaktat (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571
25 mm & nbsp'lik 6 kuyulu eş eksenli yükleme istasyonu;Flexcell Uluslararası ŞirketiLS-3000B25. Çıkarılabilir kuyulu VJW
8 kuyulu oda kaydırağıThermo Fisher Scientific154453
Asetik Asit (Buzul)Millipore100063
1 cm kalınlığında akrilik levhaPleksiglas
Anti-CD31 antikoruAbcamab24590
Anti-CD31, FITC antikoruThermo Fisher ScientificMHCD3101
Anti-VE-kaderin antikoruHücre Sinyali2500
Bioflex plakalar kollajen IFlexcell International CorporationBF3001C
Sığır serum albümin çözeltisiSigma-AldrichA8412
Pamuk sütür EP 3.5 15 x 45 cmBrasutureAP524
Siklofilin ileri astarThermo Fisher BilimselÖzel tasarlanmış
Siklofilin ters astarThermo Fisher Scientific Özeltasarlanmış
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD4540
EBM-2 bazal ortamLonzaCC3156
EGM-2 SingleQuots takviyeleriLonzaCC4176
Fetal sığır serumu (FBS)Thermo Fisher Scientific2657-029
Flexcell FX-5000 gergi sistemiFlexcell International CorporationFX-5000T
Fluoromount sulu montaj ortamıSigma-AldrichF4680
Domuz derisinden elde edilen jelatinSigma-AldrichG2500
GliserolSigma-AldrichG5516
Keçi anti-Fare IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11001
Keçi anti-Tavşan IgG Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA11008
Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum 5000 IU / mLBlau Farmac & ecirc; uticaSKU 68027
Ibidi pompa sistemi (Pompa + Akışkan Ünitesi)Ibidi10902
KLF2 ileri astarThermo Fisher ScientificÖzel tasarlanmış
KLF2 ters astarThermo Fisher ScientificÖzel tasarlanmış
KLF4 ileri astarThermo Fisher ScientificÖzel tasarlanmış
ters astarThermo Fisher ScientificÖzel tasarlanmış
NOA 280 nitrik oksit analizörüSievers InstrumentsNOA-280i-1
NOS3 ileri astarThermo Fisher ScientificÖzel tasarlanmış
NOS3 ters astarThermo Fisher ScientificÖzel tasarlanmış
Paraformaldehit (PFA)Sigma-Aldrich158127
Perfüzyon seti 15 cm, ID 1.6 mm, kırmızı, 10 mL rezervuarlarIbidi10962
Phalloidin - Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA12379
Phalloidin - Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA12380
Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010031
Potasyum İyodürSigma-Aldrich221945
QuanTitec SYBR yeşil PCR kitiQiagen204143
QuantStudio 12K esnek platform Uygulamalı Biyosistemler4471087
RNeasy mikro kiti Quiagen74004
Sürgülü cam (24 mm x 60 mm)Knittel GlassVD12460Y1D.01
Sodyum nitritSigma-Aldrich31443
SuperScript IV birinci iplikli sentez sistemiThermo Fisher Scientific18091200
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tripan mavisi leke %0.4Gibco15250-061
Clostridium histolyticumSigma-AldrichC6885'ten
KLF4 Tip II kollajenaz

Kaynaklar

  1. Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
  2. Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechanical stress: where is the mechanosensor. Critical Care Medicine. 30 (5), S198-S206 (2002).
  3. Ward, A. O., Caputo, M., Angelini, G. D., George, S. J., Zakkar, M. Activation and inflammation of the venous endothelium in vein graft disease. Atherosclerosis. 265, 266-274 (2017).
  4. Ward, A. O., et al. NF-κB inhibition prevents acute shear stress-induced inflammation in the saphenous vein graft endothelium. Scientific Reports. 10 (1), 15133(2020).
  5. Golledge, J., Turner, R. J., Harley, S. L., Springall, D. R., Powell, J. T. Circumferential deformation and shear stress induce differential responses in saphenous vein endothelium exposed to arterial flow. The Journal of Clinical Investigation. 99 (11), 2719-2726 (1997).
  6. Girão-Silva, T., et al. High stretch induces endothelial dysfunction accompanied by oxidative stress and actin remodeling in human saphenous vein endothelial cells. Scientific Reports. 11 (1), 13493(2021).
  7. Ataollahi, F., et al. New method for the isolation of endothelial cells from large vessels. Cytotherapy. 16 (8), 1145-1152 (2014).
  8. Torres, C., Machado, R., Lima, M. Flow cytometric characterization of the saphenous veins endothelial cells in patients with chronic venous disease and in patients undergoing bypass surgery: an exploratory study. Heart and Vessels. 35 (1), 1-13 (2020).
  9. Aird, W. C. Phenotypic heterogeneity of the endothelium: II. Representative vascular beds. Circulation Research. 100 (2), 174-190 (2007).
  10. Jambusaria, A., et al. Endothelial heterogeneity across distinct vascular beds during homeostasis and inflammation. eLife. 9, e51413(2020).
  11. Carneiro, A. P., Fonseca-Alaniz, M. H., Dallan, L. A. O., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. β-arrestin is critical for early shear stress-induced Akt/eNOS activation in human vascular endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 75-81 (2017).
  12. Davis, M. E., Cai, H., Drummond, G. R., Harrison, D. G. Stress regulates endothelial nitric oxide synthase expression through c-Src by divergent signaling pathways. Circulation Research. 89 (11), 1073-1080 (2001).
  13. Dekker, R. J., et al. Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes, most specifically lung Kruppel-like factor (KLF2). Blood. 100 (5), 1689-1698 (2002).
  14. Hamik, A., et al. Kruppel-like factor 4 regulates endothelial inflammation. The Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13769-13779 (2007).
  15. Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (5), 467-491 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Siklik GerilmeKollajenaz SindirimiAk OdasH cre K lt rEndotelyal MarkerlarAktin SitoskeletiNitrik Oksit Sal n m
İnsan safen ven endotel hücre izolasyonu ve kontrollü kayma stresi ve gerilme seviyelerine maruz kalma
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.