Yöntem makalesi

Yumurta sarısı antikorlarına dayalı sitometrik boncuk testinin standardizasyonu

DOI:

10.3791/65123

⸱

19 Mayıs 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal do Amazonas - UFAM, 2Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 3Programa de Pós-Graduação em Biologia da Interação Patógeno-Hospedeiro do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD), Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), 4Programa de Pós-graduação em Ciências Aplicadas à Hematologia – Universidade Estadual do Amazonas/Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, 5Programa de Pós-Graduação em Imunologia Básica e Aplicada, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, antijen tespiti için IgY antikorları kullanan tahliller için lateks boncukların hazırlanması için bir metodolojiyi açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünoanalizler, çok sayıda moleküler hedefin tespiti için önemli testlerdir. Şu anda mevcut olan yöntemler arasında, sitometrik boncuk testi son yıllarda önem kazanmıştır. Ekipman tarafından okunan her mikroküre, test edilen moleküller arasındaki etkileşim kapasitesinin bir analiz olayını temsil eder. Bu olayların binlercesi tek bir tahlilde okunur, böylece yüksek tahlil doğruluğu ve tekrarlanabilirlik sağlanır. Bu metodoloji, hastalıkların teşhisi için IgY antikorları gibi yeni girdilerin doğrulanmasında da kullanılabilir. Bu antikorlar, tavukların ilgilenilen antijen ile aşılanması ve daha sonra hayvanların yumurta sarısından immünoglobulinin çıkarılmasıyla elde edilir; Bu nedenle, bu, antikorları elde etmek için ağrısız ve oldukça verimli bir yöntemdir. Bu testin antikor tanıma kapasitesinin yüksek hassasiyetli doğrulanması için bir metodolojiye ek olarak, bu makale ayrıca bu antikorların ekstrakte edilmesi, antikorlar ve lateks boncuklar için en iyi bağlanma koşullarının belirlenmesi ve testin duyarlılığının belirlenmesi için bir yöntem sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hastalıkların teşhisine yönelik immünoassay teknikleri arasında sitometrik boncuk testi, tek bir tahlilde binlerce partikülün analizine izin verdiği için oldukça hassas ve güvenilir bir yaklaşım olarak ortaya çıkmıştır1. Bu teknik, yüksek üretkenliğe sahip olmasının ve daha küçük hacimli numunelerin kullanımına izin vermesinin yanı sıra, sitokinler, adezyon molekülleri, antikor izotipleri ve proteinler gibi çeşitli moleküllerin saptanmasına izin verdiği için büyük esneklik de sunar 2,3.

Bu tahlillerin geliştirilmesi için farklı partiküller kullanılır, bunların arasında etkili ve düşük maliyetli bir girdi olan lateks boncuklar da vardır. Bunlar, belirli moleküllerin 3,4,5 kovalent veya kovalent olmayan bağlanmasına izin veren fonksiyonel grupların veya proteinlerin varlığı gibi yüzeylerinde değişiklikler sunabilir.

Bu immünolojik testler, hastalık belirteçlerinin tespitini gerçekleştirmek için antijenler ve antikorlar gibi bileşenleri kullanır ve genellikle fareler, tavşanlar ve keçiler gibi memelilerden antikorlar gerektirir. Bu, etik konularla ilgili sorunlar yaratır, çünkü memelilerin aşılanması genellikle birçok hayvanın iyi bir verim elde etmesini ve hayvanların acı çekmesine yol açan prosedürlerin sık sık uygulanmasını gerektirir 6,7. Buna bir alternatif, aşılanmış tavukların yumurta sarısından izole edilen IgY antikorlarının kullanılmasıdır, çünkü aşılanmış antijenlere karşı spesifik antikorların yüksek konsantrasyonları yumurta sarısında bulunabilir; Bir tavuğun üretimi, bir yıl boyunca 4.3 tavşan üretimineeşdeğerdir 6,7.

Bu nedenle, bu protokolün amacı, lateks boncuklu akış sitometrisi kullanılarak tavuk yumurtası sarısından elde edilen IgY antikorlarının değerlendirilmesi için bir yöntem sağlamaktır. Bunun için, lateks boncuklar kullanılarak sandviç formatında bir sitometrik boncuk immünolojik testi için bir standardizasyon yöntemi öneriyoruz. Model olarak, Plasmodium falciparum histidin açısından zengin protein II antijenine (IgY-PfHRP2) yönlendirilmiş IgY antikorları kullanıldı. Antikorların ekstraksiyonu için bir yöntem açıklıyoruz, bunların lateks boncuklara bağlanma konsantrasyonunu tanımlamak için kritik adımları tartışıyoruz ve antijenin tespit sınırının bir değerlendirmesini sunuyoruz. Akış sitometrisinin yüksek doğruluğu, lateks boncukların düşük maliyeti ile birleştiğinde, bu tekniği antikorlar ve antijenler gibi immünoassay araçlarının analizi için uygulanabilir kılar. Bu yöntem, çeşitli hedeflerin tespiti için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Yumurta sarısından IgY ekstraksiyonu

  1. Yumurtaların hijyenizasyonu
    1. Yumurtaları (taze bırakılmış veya yumurtlamadan 4 gün sonrasına kadar, Gallus gallus Dekalb White soyundan gelene kadar) %0.2 seyreltilmiş sodyum hipoklorit çözeltisine daldırın, akan su altında hızlıca durulayın ve daha sonra veya hemen kullanmak üzere hafifçe silin.
      NOT: Hemen kullanılmayacaksa, 4 °C'de 15 güne kadar saklayın.
  2. Sarıların ayrılması
    1. Yumurtayı dikkatlice kırın ve bir yumurta sarısı ayırıcı yardımıyla sarısını beyazından ayırın.
    2. Fazla beyazı filtre kağıdı yardımıyla alın. Yumurta sarısını delin ve içini 50 mL'lik konik bir tüpe toplayın. Yumurta sarısını kullanmadan önce en az 24 saat −20 °C'de saklayın.
      NOT: Bu deneyler sırasında (veriler gösterilmemiştir), daha önce dondurulmamış yumurta sarılarının kullanımının, sarıların lipit kısmından immünoglobulinlerin izolasyonunu engellediği gözlemlenmiştir.
  3. Yumurta sarısının asitlenmesi
    1. Saklanan yumurta sarısını çözdürün ve 1 mM PBS'de 1:10 oranında seyreltin. Çözeltinin pH'ını 1 N HCl ile 5'e ayarlayın ve çözeltiyi 4 °C'de 6-24 saat inkübe edin.
    2. Çözeltiyi 40 dakika boyunca 3.000 × g'da santrifüjleyin, süpernatanı geri kazanın ve 0,7 mm'lik bir selüloz filtre kullanarak süzün.
  4. Lipitlerin kaprilik asit ile çökelmesi
    1. Süpernatantların pH'ını 5'e yeniden ayarlayın ve kaprilik asidi (% ≥98% başlangıç konsantrasyonu) 4 ° C'de 30 dakika boyunca sürekli karıştırma altında% 8.7'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
      NOT: Süpernatantın hacmi, adım 1.3.2'de çökeltilen lipit kütlesine bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, örneğin, filtrasyondan sonra elde edilen 35 mL süpernatana 3.107 mL kaprilik asit eklenmelidir.
    2. Numuneleri 18.600 × g'da 15 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çökeltilmiş malzemeden ayırın.
    3. 1 M NaOH kullanarak çözeltinin pH'ını 7.4'e yeniden ayarlayın, Bradford testi8'i kullanarak antikorları ölçün ve antikorları kullanım zamanına kadar −20 ° C'de saklayın.
      NOT: Antikorlar, 'lik bir SDS-PAGE jeli ile doğrulanan 1 μg/μL konsantrasyonda elde edildi.

2. Lateks boncuklara karşı IgY antikorlarının doygunluk eğrisi

  1. Boncukların IgY antikorlarına bağlanması
    1. 21 μL 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC, başlangıç konsantrasyonu 367 mM) ve 21 μL N-hidroksisüksinimid (NHS, başlangıç konsantrasyonu 50 mM) ila 21 μL lateks boncuk ekleyin (% 4 w / v) ve filtrelenmiş 10 mM PBS ile 2.1 mL'lik bir nihai hacme ayarlayın.
      NOT: PBS çözeltisinin pH aralığı 7.2 ile 7.4 arasında olmalıdır, çünkü bu çalışmada, bu aralığın dışında bir çözelti kullanıldığında kuplaj ve diğer adımlarda negatif bir değişiklik gözlenmiştir.
    2. 22 °C'de hızlı çalkalayarak 3 saat inkübe edin.
    3. 4 μg, 2 μg, 1 μg, 0.5 μg, 0.25 μg, 0.125 μg ve 0 μg önceden ekstrakte edilmiş yakalama antikoru IgY-PfHRP2 ekleyin (bkz. adım 1.4.3) adım 2.1.1'de açıklanan çözeltinin 100 μL'sini içeren farklı mikrotüplere (% 0.04 nihai boncuk konsantrasyonu) ve adım 2.1.2'de tarif edilenle aynı koşullar altında 16 saat inkübe edin.
    4. Numuneleri 857 × g'da 15 °C'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatantları atın ve santrifüjleme ve yeniden süspansiyon döngülerini kullanarak lateks boncukları 500 μL filtrelenmiş 10 mM PBS (%0.008 nihai boncuk konsantrasyonu) ile iki kez yıkayın.
      NOT: 857 × g'ı aşmayın, bu çalışmada olduğu gibi, bu hızın ötesinde boncukların test sonucunu olumsuz yönde değiştiren deformasyonlara uğradığı gözlemlenmiştir.
  2. Boncukların bloke edilmesi
    1. Numuneleri 1 mL bloke edici tampon (% 0.004 nihai boncuk konsantrasyonu) (filtrelenmiş 10 mM PBS + sığır serum albümini, BSA,% 5) içinde yeniden süspanse edin ve 2 saat boyunca adım 2.1.2'de tarif edilenle aynı koşullar altında inkübe edin.
    2. Bloke ettikten sonra, adım 2.1.4'te açıklandığı gibi yıkayın ve 10 mM PBS tamponunda yeniden süspanse edin.
  3. Alexa Fluor 488 ile etiketlenmiş anti-tavuk sekonder antikorları ile inkübasyon
    1. Adım 2.1.3'te açıklandığı gibi, her bir mikrotüpe 10 mM PBS +% 0.5 BSA'da 1: 2.000'e seyreltilmiş 100 μL floresan anti-tavuk antikoru (2 mg / mL) ekleyin.
    2. Numuneleri adım 2.1.2'de açıklandığı gibi, bu sefer karanlıkta 30 dakika inkübe edin.
    3. Boncukları adım 2.1.4'teki gibi yıkayın ve 250 μL (%0.016 nihai boncuk konsantrasyonu) filtrelenmiş 10 mM PBS ile yeniden süspanse edin. Akış sitometresi okumasını bölüm 5'te açıklandığı gibi gerçekleştirin.
      NOT: Elde edilen floresan yüzdesi verilerinden, plato oluşumunun başlangıç noktasını gözlemleyin (bu çalışmada gözlemlendiği gibi 1 μg). Sonraki adımlar için platonun ikinci noktasını (burada görüldüğü gibi 2 μg) kullanmanızı öneririz (Şekil 1).

figure-protocol-1
Şekil 1: Lateks boncuklara IgY-Pf HRP2 antikor bağlantısının doyma noktasını belirlemek için akış sitometrisi analizinin grafiği. X ekseni antikor konsantrasyonunu temsil eder ve Y ekseni elde edilen floresan yüzdesini temsil eder. Kruskal-Wallis testi, p < 0.0033. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Antijen tespiti için lateks boncuklara dayalı akış sitometrisi testi

  1. IgY antikorlarının lateks boncuklara doyma noktasını belirledikten sonra, adım 2.1.1'e göre boncuk aktivasyon işlemini tekrar gerçekleştirin.
    1. Boncukları gözlemlenen doygunluk konsantrasyonunda (adım 2.1.3'te açıklandığı gibi) birleştirin ve adım 2.1.2'ye göre inkübe edin.
      NOT: IgY-PfHRP2 antikoru kullanılarak yapılan testlerde, doygunluk koşulu her 1 μL lateks boncuk için 2 μg idi.
  2. Boncukları adım 2.2'ye göre bloke edin ve yıkayın.
  3. Antijen ile inkübasyon
    1. Tespit sınırını belirlemek için, 100 μL bloke boncuk preparatının eşdeğerini, farklı miktarlarda rekombinant protein Pf HRP2 (1 μg/mL) (r PfHRP2, 10 μg, 1 μg,0.1 μg, 0.01 μg, 0.001 μg, 0.0001 μg ve 0 μg) içeren tüplere dağıtın.
      NOT: Bu rekombinant protein, Sousa ve ark.9'un çalışmasında geliştirilmiştir.
    2. Boncuk çözeltilerini adım 2.1.2'de açıklandığı gibi rPfHRP2 proteini ile 1 saat inkübe edin.
    3. Yıkamaları adım 2.1.4'te açıklandığı gibi gerçekleştirin ve santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın.
  4. Primer antikor ile inkübasyon
    1. Her numunede 10 μL'lik bir nihai hacme 10 mM PBS +% 0.5 BSA içinde seyreltilmiş rPfHRP2 proteinine karşı 2 μg fare IgG antikoru ekleyin. Numuneleri adım 2.1.2'de açıklandığı gibi inkübe edin ve son santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın.
      NOT: Bu antikor, Sousa ve ark.9'un çalışmasında geliştirilmiştir.
  5. İkincil antikor ile inkübasyon
    1. Her numuneye 10 mM PBS +% 0.5 BSA'da 1: 2.000'e seyreltilmiş 100 μL floresan anti-fare antikoru (2 mg / mL) ekleyin. Adım 2.1.2'de açıklandığı gibi inkübe edin ve filtrelenmiş 10 mM PBS'nin 250 μL'sinde (% 0.016 nihai boncuk konsantrasyonu) yeniden süspanse edin. Okumayı bölüm 5'e göre gerçekleştirin.

4. Numunelerin akış sitometresi okuması

  1. Sitometri ayarı: Bir bilgisayara bağlı sitometrenin optik parametrelerinin hizalanması
    1. Bilgisayarı ve akış sitometresini açın ve ekipmanın bilgisayara bağlanması için birkaç dakika bekleyin.
    2. Bilgisayarda yüklü olan sitometri yazılımına tıklayın ve oturum açın. Yazılım çalışma alanından Sitometre | Başlangıç | Temiz mod | SIT sıvıları.
      NOT: Numune alınmadan önce sitometre başlatma işlemi sırasında hava kabarcıkları ve tıkanıklıklar giderilmelidir.
  2. Kalite kontrol
    1. Fotoçoğaltıcı tüplerin voltajlarını kontrol etmek ve sitometrenin hassasiyetini değerlendirmek için kalite kontrol reaktifini kullanın.
    2. Sitometre kurulum reaktifini ve izleme boncuklarını 12 mm x 75 mm kapaklı polistiren tüpe yerleştirin.
    3. Tüpü girdap yaparak yavaşça karıştırın.
  3. Askı boncuklarının hazırlanması
    1. Taban çizgisini tanımlamak için, 12 mm x 75 mm kapaklı polistiren tüpe 0,5 mL seyreltici (10 mM filtrelenmiş PBS, pH 7) ve üç damla boncuk ekleyin. Kullanmadan önce tüpü hafifçe sarın.
    2. Sitometre yazılımı çalışma alanında Sitometre | CST ve sitometrenin sitometre yazılım arayüzünden ayrılmasını ve CS&T arayüzüne bağlanmasını bekleyin. Ekranın altındaki sitometre yazılımı Durum Çubuğunda şu mesajı izleyin: Bağlantı Kesildi Sitometre.
    3. Kalite kontrol reaktifini içeren 12 mm x 75 mm kapaklı polistiren tüpü kullanın ve akış sitometresi probuna takın.
  4. Sitometre konfigürasyonunun doğrulanması
    1. Sistem Özeti penceresinde, sitometre yapılandırmasının deneme için uygun olduğunu doğrulayın.
  5. Performans kontrolü için kurulum
    1. CS&T araştırma boncuklarının lotuna karşılık gelen kurulum boncuklarının kimliğini seçin.
  6. Performans kontrolü
    1. Tüpü akış sitometresi probuna takın ve Kurulum Kontrolü penceresine tıklayın. Performansı Kontrol Et'i seçin ve Çalıştır'a tıklayın.
    2. Performans denetimi tamamlandıktan sonra bir iletişim kutusunun açılmasını bekleyin. Aşağıdakilerden birini yapın:
      1. Sitometre Performans raporunu görüntülemek için Raporu Görüntüle'ye tıklayın.
      2. Performans denetimini tamamlamak ve çalışma alanının kurulum görünümüne dönmek için Son'a tıklayın.
      3. Morfometrik ve floresan duyarlılık analizinin nihai sonucunu gözlemleyin Sistem Özeti | GEÇTİ durumuna sahip Sitometre Performans Sonucu.
      4. Tüpü sitometreden çıkarın. Sistem Özeti penceresinde görüntülenen sitometre performans sonuçlarını kontrol edin.

5. Akış sitometrisi kullanarak numune analizi

  1. Sitometre yazılımına giriş yapın.
    1. Sitometre yazılımı çalışma alanından Sitometre | Temiz mod | SIT sıvıları.
    2. Yazılım çalışma alanına uyum sağlayın.
    3. Negatif kontrol parçacıklarının morfometrik ve floresan özelliklerine (floresanssız boncuklar) dayalı geçit stratejisini tanımlayın.
    4. Hücre morfometrisini belirlemek için, SSC-A kullanarak FSC-A parametrelerinin analizi için Nokta Grafiği Grafiği'ni seçin (Ek Şekil 1A).
    5. Y ekseninde SSC-H ve x ekseninde SSC-W'nin analizi için Nokta Grafiği Grafiği kullanarak SSC ile tek hücreleri belirleyin (Ek Şekil 1B) ve y ekseninde FSC-H ve x ekseninde FSC-W analizi için Nokta Grafiği Grafiği kullanarak FSC ile tek hücreleri belirleyin (Ek Şekil 1C).
    6. Floresan analizleri için, FCS-A kullanan FL1 Nokta Grafiği Grafiklerini seçin. Etiketsiz sampve daha önce tek renkli Alexa Fluor 12 ile etiketlenmiş 75D ile etiketlenmiş samps içeren 488 mm x 488 mm tıpalı polistiren tüp kullanın (Ek Şekil 1D, E).
  2. Numuneyi akış sitometrisinde alın.
    1. Önceden etiketlenmiş numuneleri içeren 12 mm x 75 mm tıpalı polistiren tüp kullanın. Tüp içeriğini dikkatlice karıştırın, tüpü akış sitometresi probuna takın ve Al'a sol tıklayın.
    2. Lazerlerin gücünü ayarlamak için Parametreler'e tıklayın ve aşağıdaki seçeneklerde FSC'nin voltajını 182 V'a ve SSC'nin voltajını 236 V'a ayarlayın. Eşiği ayarlamak için Sitometre | Eşik ve aşağıdaki seçeneklerde FSC'yi 500 V'a ayarlayın.
    3. Parçacıkları boyut ve karmaşıklığa göre karakterize etmek ve tek hücreli analiz gerçekleştirmek için analiz kapısını ayarlayın.
    4. Otofloresansı gidermek için, yalnızca lateks boncukları içeren boyasız numuneyi analiz edin ve dedektörün voltajlarını ayarlayın: aşağıdaki seçeneklerde FL1'in (FITC) voltajını 332 V'a ayarlayın.
    5. Floresan analiz kapısını, nokta grafiğinde gösterilen negatif noktadan dörtgen biçimde ayarlayın.
    6. Morfometrik ve floresan analizler ayarlandıktan sonra, cihazı 50.000 olay için yapılandırın: Alım'ın altında Kaydet'e tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2, asitleştirme yoluyla IgY antikorlarının ekstraksiyon işleminin grafiksel bir temsilini ve ardından kaprilik asit kullanılarak ayırmayı sağlar (Şekil 2).

figure-results-1
Şekil 2: IgY antikorlarının ekstraksiyon aşamasının şematik gösterimi ve kaprilik asit kullanılarak

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IgY antikorunun pH redüksiyonu ve ardından kaprilik asit kullanılarak lipid ayrımı ile çökeltilmesi yöntemi, işlevsellikte herhangi bir kayıp olmadan toplam antikorların izole edilmesinde etkilidir. Burada önerilen yöntem, asitleştirme ve kaprilik asit ile çökeltmeyi de kullanan, ancak daha karmaşık ve zahmetli bir protokole sahip olan Redwan ve ark.11 tarafından bildirilenden daha basit ve daha ucuzdur. Bu yöntem aynı zamanda, diğerlerinin yanı sıra PEG çökeltme 12,13, sodyum sülfat

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve yayınlanması ile ilgili herhangi bir potansiyel çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FIOCRUZ'a ("Programa de excelência em pesquisa básica e aplicada em saúde dos laboratórios do Instituto Leônidas e Maria Deane - ILMD/Fiocruz Amazônia-PROEP-LABS/ILMD FIOCRUZ AMAZÔNIA"), Biyoteknoloji Yüksek Lisans Programı'na (Universidade Federal do Amazonas'ta PPGBIOTEC - UFAM), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível (CAPES) ve Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas'a (FAPEAM) burs sağladıkları için. Şekil 2 ve Şekil 4 biorender.com ile oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-Tavuk IgY (H + L), yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş, CF  EşekSigma-AldrichSAB4600031
Anti-fare IgG (H+L), F(ab′)2Sigma-AldrichSAB4600388
BD FACSCanto IIBD BiosciencesBF-FACSC2
BD FACSDiva CS& T araştırma boncukları (CS& T araştırma boncukları)BD Biosciences655050
BD FACSDiva yazılımı 7.0BD Biosciences655677
Bio-Rad Protein Testi Boya Reaktif KonsantresiBio-Rad# 5000006
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA4503
Kaprilik asitSigma-AldrichO3907
Santrifüj 5702 REppendorfZ606936
Klorür %37 asit moleküler sınıfNEON02618 NEON
CML lateks, %4 w/vInvitrogenC37253
Megafuge 8RThermo ScientificTS-HM8R
N-(3-Dimetilaminopropil)-N′-etilkarbodiimid Hidroklorür Tozu (EDC)Sigma-AldrichE7750-1G
N-Hidroksisüksinyum (NHS)Sigma-Aldrich130672-25G
Fosfat tamponlu tuzlu suSigma-Aldrich1003335620
Sodyum hidroksitAcs CientificaP.10.0594.024.00.27
Sodyum hipokloritAcs CientificaR09211000
Termo Karıştırıcı Isı/SoğutmaKASVIK80-120R

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Salzer, U., Sack, U., Fuchs, I. Flow cytometry in the diagnosis and follow up of human primary immunodeficiencies. Electronic Journal of the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory. 30 (4), 407(2019).
  2. de Figueiredo, A. M., Glória, J. C., Chaves, Y. O., Neves, W. L. L., Mariúba, L. A. M. Diagnostic applications of microsphere-based flow cytometry: A review. Experimental Biology and Medicine. 247 (20), 1852-1861 (2022).
  3. Morgan, E., et al. Cytometric bead array: A multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clinical Immunology. 110 (3), 252-266 (2004).
  4. Graham, H., Chandler, D. J., Dunbar, S. A. The genesis and evolution of bead-based multiplexing. Methods. 158, 2-11 (2019).
  5. Kellar, K. Multiplexed microsphere-based flow cytometric assays. Experimental Hematology. 30 (11), 1227-1237 (2002).
  6. Schade, R., et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine. ATLA Alternatives to Laboratory Animals. 33 (2), 129-154 (2005).
  7. Xu, Y., et al. Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases: A review. Biotechnology Advances. 29 (6), 860-868 (2011).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  9. Sousa, L. P., et al. A novel polyclonal antibody-based sandwich ELISA for detection of Plasmodium vivax developed from two lactate dehydrogenase protein segments. BMC Infectious Diseases. 14 (1), 49(2014).
  10. Klimentzou, P., et al. Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly immunogenic polypeptide prothymosin alpha. Peptides. 27 (1), 183-193 (2006).
  11. Redwan, E. M., Aljadawi, A. A., Uversky, V. N. Simple and efficient protocol for immunoglobulin Y purification from chicken egg yolk. Poultry Science. 100 (3), 100956(2021).
  12. Lee, H. Y., Abeyrathne, E. D. N. S., Choi, I., Suh, J. W., Ahn, D. U. K. Sequential separation of immunoglobulin Y and phosvitin from chicken egg yolk without using organic solvents. Poultry Science. 93 (10), 2668-2677 (2014).
  13. Pauly, D., Chacana, P., Calzado, E., Brembs, B., Schade, R. IgY Technology: Extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation. Journal of Visualized Experiments. (51), e3084(2011).
  14. Chang, H. M., Lu, T. C., Chen, C. C., Tu, Y. Y., Hwang, J. Y. Isolation of immunoglobulin from egg yolk by anionic polysaccharides. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 48 (4), 995-999 (2000).
  15. Ko, K. Y., Ahn, D. U. Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography. Poultry Science. 86 (2), 400-407 (2007).
  16. Polson, A. Isolation of IgY from the yolks of eggs by a chloroform polyethylene glycol procedure. Immunological Communications. 19 (3), 253-258 (1990).
  17. Simonova, M. A., et al. xMAP-based analysis of three most prevalent staphylococcal toxins in Staphylococcus aureus cultures. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (25), 6447-6452 (2014).
  18. Sharma, P., et al. A multiplex assay for detection of staphylococcal and streptococcal exotoxins. PLoS One. 10 (8), e0135986(2015).
  19. Merbah, M., et al. Standardization of a cytometric p24-capture bead-assay for the detection of main HIV-subtypes. Journal of Virological Methods. 230, 45-52 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

IgY AntikorlarAk SitometrisiLateks Boncuklarmm nassay StandardizasyonuAntikor EkstraksiyonuSandvi mm nassayFloresan AnaliziTan sal Assayler

İlgili makaleler