Method Article

Nanodisk İçeren Biyoaktif Ajanın Formülasyonu ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/65145

⸱

March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Nevada

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, nanodiskler içeren biyoaktif ajanların üretimini ve karakterizasyonunu açıklıyoruz. Amfoterisin B nanodiskleri, protokolü aşamalı olarak tanımlamak için örnek olarak alınmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanodisk terimi, çift katmanlı bir lipit, bir iskele proteini ve entegre bir biyoaktif ajandan oluşan ayrı bir nanopartikül tipini ifade eder. Nanodiskler, çevresi genellikle değiştirilebilir apolipoprotein ailesinin bir üyesi olan iskele proteini tarafından çevrelenen disk şeklinde bir lipit çift katmanı olarak düzenlenir. Çok sayıda hidrofobik biyoaktif ajan, parçacığın lipit çift katmanının hidrofobik ortamına entegrasyonlarıyla nanodisklerde verimli bir şekilde çözünür ve çapı 10-20 nm aralığında büyük ölçüde homojen bir parçacık popülasyonu elde edilir. Nanodisklerin formülasyonu, bireysel bileşenlerin kesin bir oranını, her bir bileşenin uygun bir sıralı ilavesini ve ardından formülasyon karışımının banyo sonikasyonunu gerektirir. Amfipatik iskele proteini, ayrık, homojen bir nanodisk parçacıkları popülasyonu oluşturmak için lipit / biyoaktif ajan karışımı oluşturan dağınık çift katmanlı ile kendiliğinden temas eder ve yeniden düzenler. Bu proses sırasında, reaksiyon karışımı opak, bulanık bir görünümden, tamamen optimize edildiğinde santrifüjleme sırasında çökelti vermeyen berraklaştırılmış bir numuneye geçer. Karakterizasyon çalışmaları, biyoaktif madde çözünürlük verimliliği, elektron mikroskobu, jel filtrasyon kromatografisi, ultraviyole görünür (UV / Vis) absorbans spektroskopisi ve / veya floresan spektroskopisinin belirlenmesini içerir. Bunu normalde kültürlenmiş hücreler veya fareler kullanılarak biyolojik aktivitenin araştırılması izler. Bir antibiyotik barındıran nanodiskler (yani, makrolid polien antibiyotik amfoterisin B) durumunda, maya veya mantarların büyümesini konsantrasyon veya zamanın bir fonksiyonu olarak inhibe etme yetenekleri ölçülebilir. Formülasyonun göreceli kolaylığı, bileşen parçalarına göre çok yönlülük, nano ölçekli parçacık boyutu, doğal stabilite ve sulu çözünürlük, nanodisk teknolojisinin sayısız in vitro ve in vivo uygulamasına izin verir. Bu makalede, hidrofobik biyoaktif ajan olarak amfoterisin B içeren nanodiskleri formüle etmek ve karakterize etmek için genel bir metodoloji açıklanmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeni ortaya çıkan diskoidal yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL'ler), insan dolaşım sisteminde bulunan çok daha bol küresel HDL'nin doğal olarak oluşan progenitörleridir. Pre-ß HDL olarak da adlandırılan bu yeni ortaya çıkan parçacıklar, benzersiz ve ayırt edici yapısal özelliklere sahiptir1. Aslında, küresel bir parçacık olarak var olmak yerine, yeni ortaya çıkan HDL'ler disk şeklindedir. Doğal ve yeniden yapılandırılmış diskoidal HDL'ler üzerine yapılan kapsamlı yapısal karakterizasyon çalışmaları, çevresi apoA-I gibi bir amfipatik değiştirilebilir apolipoprotein (apo) ile çevrelenmiş bir fosfolipid çift katmandan oluştuğunu ortaya koymuştu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İskele protein bileşeninin dönüşümü, ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. Plazmid içeren apoE4-NT ile BL21 bakteriyel transformasyonu
    1. BL21 (DE3) yetkin hücrelerden oluşan bir tüpü buz üzerinde 10 dakika boyunca çözün.
    2. Tüm buzlar eridikten sonra, 50 μL hücreyi buz üzerindeki bir dönüşüm tüpüne nazikçe ve dikkatlice karıştırın.
    3. Hücre karışımına 50 ng plazmid DNA'sı içeren 5 μL ekleyin (dizi için Ek Tablo 1'e bakınız). Karıştırmak için tüpü dört veya beş kez dikkatlice hareket ettirin. Vorteks yapmayın.
    4. Karışımı 30 dakika boyunca buz üzerine koyun.
    5. Isı, karışımı 10 s boyunca tam o....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyoaktif ajan nanodisk formülasyon prosesi
Tarif edilen ampB-nanodisk formülasyon prosedüründe, numune görünümü bulanıktan berraklığa geçtiğinde reaksiyon tamamlanmış sayılır (Şekil 1). Bu değişiklik, nanodisklerin oluştuğunu ve biyoaktif maddenin çözünür hale geldiğini gösterir. Çoğu zaman, biyoaktif ajanlar görünür dalga boyu bölgesindeki ışığı emer (örneğin, ampB, kurkumin, lutein, koenzim Q10) ve bu durumlarda numune biyoaktif maddenin rengini benimser. Nu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanodiskler içeren bir biyoaktif maddenin formülasyonu, aksi takdirde çözünmeyen hidrofobik bileşikleri çözmek için uygun bir yöntem sağlar. Ürün biyoaktif ajan nanodiskleri sulu ortamda tamamen çözünür olduğundan, çok çeşitli hidrofobik moleküller için yararlı bir dağıtım yöntemi sağlarlar (Tablo 1). Bunlar arasında küçük moleküller, doğal ve sentetik ilaçlar, bitkisel besinler, hormonlar vb. Bulunur. Formülasyon stratejisi genellikle biyoaktif maddenin organik çözücülerdeki çözünürlük özelliklerini dik.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R37 HL-64159) bir hibe ile desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amfoterisin BCayman Kimya Şirketi11636ND Formülasyonu ve Standart Hazırlama
AmpisilinFisher BilimselBP17925Dönüşümü & Genişleme
ApoE4-NT PlazmidGenScriptN/ADönüşüm
Şaşkın ŞişeNew Brunswick ScientificN/AGenişletme & İfade
BL21 yetkin E coliNew England BiolabsC2527IDönüşüm
Santrifüj şişeleriNalgene3140-0250İfade
KloroformFisher ScientificG607-4ND Formülasyonu
DMSOSigma Aldrich472301Standart Prepartasyon
DymiristoilfosfatidilkolinAvanti Lipidleri850345PND Formülasyonu
Erlenmeyer şişesiBellco BiotechnologyN/AGenişletme ve İfade
Falcon TüpleriSarstedt Ag & CoD51588Maya Canlılık Testi
Cam borosilikat tüplerVWR47729-570ND Formülasyonu
GraphPad (Yazılım)DotmaticsN/AMaya Canlılık
Testi Isıtmalı Sonikasyon BanyosuVWRN/AND Formulaton
Isıtma ve Azot modülüThermo ScientificTS-18822ND Formülasyonu
HiTrap Heparin HP (5 mL)GE Healthcare17-0407-03Saflaştırma
İzopropil β-D-1-tiyogalaktopiranosid Fisher ScientificBP1755İfade
J-25 Santrifüj BeckmanCoulterJ325-IM-2İfade
JA-14 RotorBeckman Coulter339247İfade
LiyofilizatörLabconco7755030ND Formülasyonu
MetanolFisher ScientificA452-4ND Formülasyonu
Azot gazıPraxairUN1066ND Formülasyonu
NZCYM ortamıRPI Araştırma ÜrünleriN7200-1000.0Genişletme ve İfade
Pet-22B vektörGenScriptN/ADönüşüm
Petri kabıFisher ScientificFB0875718Dönüşüm & Genleşme
KuvarsKüvetleri Fisher Brand14385 928ASpektral Analiz
Sallama İnkübatörüNew Brunswick ScientificM1344-0004Dönüşüm, Genişleme ve İfade
Slide-A-Lyzer ŞamandıralarıThermo Scientific66430Arıtma
SnakeSkin Diyaliz TüpüThermo Scientific68100Arıtma
SnakeSkin Diyaliz TüpüThermo Scientific88243Saflaştırma
Sodyum KlorürFisher ScientificS271Arıtma
Sodyum Fosfat dibazikFisher ScientificS374-500Saflaştırma
Sodyum Fosfat monobazikFisher ScientificBP329-500Saflaştırma
Spektrumu/POR Ağırlıklı KapaklarSpektrumu Medikal Endüstriler132736Arıtma
SpektrofotometresiShimadzu UV-1800220-92961-01spektral analiz
Masa Üstü SantrifüjBeckman Coulter366816ND Formülasyonu
UVProbe 2.61 (Yazılım)ShimadzuN/ASpektral Analiz
Vakum filtresiMillipore9004-70-0İfade & Arıtma
Vakum pompasıGAST İmalat A.Ş.DOA-P704-AAİfade & Arıtma
VortexFisher Scientific12-812ND Formülasyon Maya
N/ABY4741Maya Canlılık Testi
Maya Özü-Pepton-DekstrozBD242820Maya Canlılık Testi

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025(2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nanodisk FormulationBioactive NanodisksAmphotericin B NanodisksScaffold ProteinLipid Bilayer NanoparticlesDrug Delivery NanodisksUV Visible SpectroscopyDialysis TubingYeast Growth InhibitionHydrophobic Bioactive Agents

Related Articles