Narenciye tomurcuk ağacı işlemenin, cihaz mühendisliği yoluyla aşağı akış patojen tespiti için otomatikleştirilmesi

Summary

Floem bakımından zengin kabuklu narenciye tomurcuk ağacı dokularını hızla işleyen bir alet tasarladık, ürettik ve onayladık. Mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, tomurcuk ağacı doku çıkarıcısı (BTE), numune verimini artırdı ve gerekli işçilik ve ekipman maliyetlerini azalttı.

Abstract

Virüsler, viroidler ve bakteriler gibi narenciyenin greftle bulaşabilen, floemle sınırlı patojenleri, dünya çapında yıkıcı salgınlardan ve ciddi ekonomik kayıplardan sorumludur. Örneğin, narenciye tristeza virüsü dünya çapında 100 milyondan fazla narenciye ağacını öldürürken, "Candidatus Liberibacter asiaticus" Florida'ya 9 milyar dolara mal oldu. Ağaç yayılımı için patojen testi yapılmış narenciye tomurcuk ağacının kullanılması, bu tür patojenlerin yönetimi için anahtardır. Riverside, California Üniversitesi'ndeki Narenciye Klonal Koruma Programı (CCPP), Kaliforniya'nın narenciyesini korumak ve Ulusal Temiz Bitki Ağı'na temiz çoğaltma üniteleri sağlamak için her yıl narenciye tomurcuk ağacı kaynak ağaçlarından binlerce numuneyi test etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tahlillerini kullanır. Narenciye virüslerinin ve viroidlerinin yüksek verimli moleküler tespitinde ciddi bir darboğaz, bitki dokusu işleme adımıdır.

Uygun doku hazırlığı, kaliteli nükleik asitlerin ekstraksiyonu ve PCR tahlillerinde aşağı akış kullanımı için kritik öneme sahiptir. Nükleik asit bozulmasını önlemek için düşük sıcaklıklarda bitki dokusu doğrama, tartma, dondurarak kurutma, öğütme ve santrifüjleme zaman yoğun ve emek yoğundur ve pahalı ve özel laboratuvar ekipmanı gerektirir. Bu makale, tomurcuk ağacı dokusu çıkarıcı (BTE) olarak adlandırılan, turunçgil tomurcuk ağacından floem bakımından zengin kabuk dokularını hızlı bir şekilde işlemek için tasarlanmış özel bir aletin doğrulanmasını sunmaktadır. BTE, mevcut yöntemlere kıyasla numune verimini %100 artırır. Ek olarak, işçiliği ve ekipman maliyetini azaltır. Bu çalışmada, BTE örnekleri, CCPP'nin elle doğrama protokolü (77.84 ng/μL) ile karşılaştırılabilir bir DNA verimine (80.25 ng/μL) sahipti. Bu cihaz ve hızlı bitki doku işleme protokolü, Kaliforniya'daki çeşitli narenciye teşhis laboratuvarlarına ve programlarına fayda sağlayabilir ve dünya çapındaki diğer odunsu çok yıllık mahsuller için doku işleme için model bir sistem haline gelebilir.

Introduction

Viroidler, virüsler ve bakteriler gibi narenciyenin greftle bulaşabilen floemle sınırlı patojenleri, dünyanın narenciye üreten her bölgesinde yıkıcı salgınlara ve ciddi ekonomik kayıplara neden olmuştur. Turunçgil viroidleri, trifoliat, trifoliat melezleri, mandalina, clementine ve mandalina^gibi ekonomik açıdan önemli turunçgil türlerinde neden oldukları ekzokortis ve kaşeksi hastalıkları nedeniyle üretim faktörlerini sınırlamaktadır ^1,2,3. Kaliforniya'da, bu viroide duyarlı narenciye türleri, tüketicilerin soyulması kolay, dilimlenmiş ve çekirdeksiz meyvelere yönelik tercihlerindeki değişen eğilimi takiben, büyüyen ve karlı "kolay soyulanlar" pazarının temelidir ^4,5,6. Bu nedenle, narenciye viroidleri Kaliforniya Gıda ve Tarım Bakanlığı (CDFA) "Narenciye Fidanlığı Stok Haşere Temizleme Programı-Senato Yasa Tasarısı 140" kapsamında düzenlenmektedir ve CDFA'nın Bitki Zararlıları Teşhis Şubesi laboratuvarları yılda binlerce narenciye viroid testi gerçekleştirmektedir 7,8,9,10 . Narenciye tristeza virüsü (CTV), 1930'larda küresel salgının başlangıcından bu yana 100 milyondan fazla narenciye ağacının ölümünden sorumlu olmuştur 3,9,10,11. Kaliforniya'da, virüsün kök çukurlaşması ve üç yapraklı kırılma direnci izolatları, 3,6 milyar dolarlık Kaliforniya narenciye endüstrisi için ciddi bir tehdit oluşturuyor^12,13,14. Sonuç olarak, CDFA, CTV'yi düzenlenmiş bir A sınıfı bitki zararlısı olarak sınıflandırır ve Orta Kaliforniya Tristeza Eradikasyon Ajansı'nın (CCTEA) laboratuvarı her yıl kapsamlı saha araştırmaları ve binlerce virüs testi gerçekleştirir^15,16. "Candidatus Liberibacter asiaticus" (CLas) bakterisi ve huanglongbing (HLB) hastalığının, narenciye ekim alanlarında% 40'lık bir azalma, narenciye operasyonlarında% 57'lik bir azalma ve yaklaşık 8.000 iş kaybı sonucunda Florida'da 9 milyar dolara yakın ekonomik hasara neden olduğu tahmin edilmektedir^17,18. Kaliforniya'da, HLB nedeniyle narenciye alanında varsayımsal 'lik bir azalmanın 8.200'den fazla iş kaybına ve eyaletin gayri safi yurtiçi hasılasında yarım milyar doların üzerinde bir azalmaya neden olacağı tahmin ediliyordu. Bu nedenle, Narenciye Zararlıları ve Hastalıklarını Önleme Programı, Kaliforniya^{14,17,19,20'den} CLas'ı test etmek^, tespit etmek ve ortadan kaldırmak için yapılan anketlere yılda ⁴⁰ milyon doların üzerinde harcama yapmaktadır.

Narenciye viroidlerinin, virüslerin ve bakterilerin yönetiminin önemli bir unsuru, ağaç üretimi için patojen testi yapılmış çoğaltma malzemelerinin (yani tomurcuk ağacı) kullanılmasıdır. Patojen testi yapılmış narenciye tomurcuk ağacı, gelişmiş patojen eliminasyon ve tespit tekniklerini kullanan kapsamlı karantina programları kapsamında üretilir ve bakımı yapılır^10,21. Riverside, California Üniversitesi'ndeki Narenciye Klonal Koruma Programı (CCPP), Kaliforniya'nın narenciyesini korumak ve Narenciye için Ulusal Temiz Bitki Ağı'nın işlevlerini desteklemek için her yıl eyalete ve ABD'ye yeni ithal edilen narenciye çeşitlerinden ve narenciye tomurcuk ağacı kaynak ağaçlarından binlerce tomurcuk ağacı örneğini test ediyor^10,17,22. Büyük hacimli narenciye testinin üstesinden gelmek için, yüksek verimli, güvenilir ve uygun maliyetli patojen tespit testleri, CCPP ^7,10,22 gibi programların başarısı için temel bir bileşendir.

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi moleküler bazlı patojen tespit testleri, bitki teşhis laboratuvarlarında verimde önemli artışlara izin verirken, deneyimlerimize göre, yüksek verimli protokollerin uygulanmasındaki en kritik darboğazlardan biri bitki doku numunesi işleme adımıdır. Bu özellikle narenciye için geçerlidir, çünkü yaprak sapları ve tomurcuk ağacı kabuğu gibi floem bakımından zengin dokuların işlenmesi için şu anda mevcut olan protokoller emek yoğundur, zaman alıcıdır ve pahalı ve özel laboratuvar ekipmanı gerektirir. Bu protokoller, nükleik asit bozulmasını önlemek için düşük sıcaklıklarda elle doğrama, tartma, dondurarak kurutma, öğütme ve santrifüjleme gerektirir ^8,23,24. Örneğin, CCPP tanı laboratuvarında numune işleme, (i) elle doğrama (6-9 numune/saat/operatör), (ii) dondurarak kurutma (16-24 saat), (iii) toz haline getirme (30-60 saat) ve (iv) santrifüjlemeyi (1-2 saat) içerir. Süreç ayrıca özel sarf malzemeleri (örneğin, ağır hizmet tipi güvenli kilitli borular, paslanmaz çelik taşlama bilyaları, adaptörler, bıçaklar, eldivenler) ve çok sayıda maliyetli laboratuvar ekipmanı (örneğin, ultra düşük dondurucu, dondurarak kurutucu, doku pulverizatör, sıvı nitrojen kriyo istasyonu, soğutmalı santrifüj) gerektirir.

Her sektörde olduğu gibi, ekipman mühendisliği ve süreçlerin otomasyonu, maliyetleri düşürmenin, verimi artırmanın ve yüksek kaliteli, tek tip ürün ve hizmetler sunmanın anahtarıdır. Narenciye endüstrisi, çalıştırmak için minimum beceri gerektiren düşük maliyetli doku işleme cihazlarına ihtiyaç duyar ve bu nedenle, hızlı aşağı akış patojen tespiti için yüksek numune işleme kapasitesine izin vermek için teşhis laboratuvarlarına ve saha operasyonlarına aktarılması kolaydır. Teknoloji Gelişen Çözümler (TES) ve CCPP, floem bakımından zengin narenciye dokularının (yani tomurcuk ağacı) hızlı işlenmesi için düşük maliyetli (yani özel laboratuvar ekipmanına olan ihtiyacı ortadan kaldıran) bir cihaz geliştirdi (yani tasarladı ve üretti) ve doğruladı (yani, narenciye numuneleriyle test edildi ve standart laboratuvar prosedürleriyle karşılaştırıldı), tomurcuk ağacı doku çıkarıcı (BTE) olarak adlandırıldı. Şekil 1'de görüldüğü gibi, BTE, güç ve kontroller için bir temel bileşenin yanı sıra narenciye tomurcuk ağacının işlenmesi için çıkarılabilir bir oda içerir. BTE odası, floem bakımından zengin kabuk dokularını narenciye tomurcuk ağacından sıyırmak için özel olarak tasarlanmış bir öğütme çarkından oluşur. Parçalanmış kabuk dokusu, bir slayt portundan ekstraksiyon tamponu içeren bir şırıngaya hızla çıkarılır, süzülür ve herhangi bir ek işlem veya hazırlık olmaksızın nükleik asit ekstraksiyonu ve saflaştırması için hazır hale getirilir (Şekil 1). BTE sistemi ayrıca, numune işleme bilgilerini gerçek zamanlı olarak çevrimiçi bir veritabanına kaydeden kağıtsız bir numune izleme uygulaması ve entegre bir tartım uygulaması içerir.

BTE sistemi, CCPP'nin laboratuvar teşhis kapasitesini 0'ün üzerinde artırdı ve sürekli olarak yüksek kaliteli nükleik asitlerin saflaştırılması ve PCR tahlilleri kullanılarak narenciyenin greftle bulaşan patojenlerinin aşağı yönde tespiti için uygun narenciye dokusu ekstraktları üretti. Daha spesifik olarak, BTE, doku işleme süresini numune başına 24 saatten ~3 dakikaya düşürdü, maliyeti 60.000 doların üzerinde olan laboratuvar cihazlarının yerini aldı (Şekil 2, adım 2-4) ve daha büyük numune boyutlarının işlenmesine izin verdi.

Bu makale, sırasıyla CCPP Rubidoux Karantina Tesisi ve Lindcove Vakfı Tesisi'nden alınan tüm uygun pozitif ve negatif kontroller dahil olmak üzere, kaynak ağaçlardan alınan narenciye tomurcuk ağacı örnekleriyle BTE yüksek verimli narenciye kabuğu doku işleme, nükleik asit ekstraksiyonu ve patojen tespit doğrulama verilerini sunmaktadır. Ayrıca, mevcut laboratuvar prosedürüne kıyasla verim ve işlem süresi değişikliklerini de sunuyoruz (Şekil 2). Ek olarak, bu çalışma narenciye patojen test laboratuvarları için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlar ve BTE'nin patojen temizliği yapan fidanlık stoğu, araştırma ve eradikasyon programlarının işlevlerini nasıl destekleyebileceğini gösterir.

Şekil 1: Tomurcuk ağacı doku çıkarıcısı. BTE, güç ve kontroller için bir temel bileşenin yanı sıra narenciye tomurcuk ağacının işlenmesi için çıkarılabilir bir bölme içerir. BTE odası, floem bakımından zengin kabuk dokularını narenciye tomurcuk ağacından sıyırmak için özel olarak tasarlanmış bir öğütme çarkından oluşur. Parçalanmış kabuk dokusu, bir slayt portundan bir şırıngaya hızla çıkarılır, süzülür ve herhangi bir ek işlem veya hazırlık olmaksızın nükleik asit ekstraksiyonu ve saflaştırması için hazır hale getirilir. Kısaltma: BTE = tomurcuk ağacı doku çıkarıcı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Konvansiyonel elle doğrama laboratuvarı prosedürü ile BTE prosesi arasında adım adım karşılaştırma. BTE işleme, yüksek verimli narenciye kabuğu dokusu işleme, nükleik asit ekstraksiyonu ve patojen tespitini içerir. Her adımın zamanı parantez içinde belirtilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

1. Narenciye tomurcuk ağacı örneklerinin gemiye toplanması

1. Technology Evolving Solutions'a web sunucularına yüklemeleri için bir ağaç bilgileri elektronik tablosu gönderin (sonunda kullanıcı yeni ağaçlar oluşturacaktır).
2. Bir ağaç seçmek için telefon uygulaması TES izleyicisini kullanın ve ağaç bilgilerini etikete yüklemek için telefona bir yakın alan iletişimi (NFC) yaka etiketi tutun.
3. Üç ila dört narenciye tomurcuk ağacı örneğini BTE uyumlu plastik torba taşıyıcısına yerleştirin ve kapakla kapatın.
   1. Tomurcuk ağacının uzunluğunun 8 inç'i geçmediğinden ve 5 inç'ten az olmadığından emin olun.
      1. Uzunluk 8 inçten büyükse, kısaltmak için steril tek kullanımlık bir tıraş bıçağı veya %10 çamaşır suyu solüsyonu (%1 sodyum hipoklorit) ile dekontamine edilmiş budama makası kullanın.
      2. Uzunluk 5 inçten azsa, torbaya koymak için farklı bir tomurcuk ağacı örneği toplayın.
   2. Herhangi bir koltuk altı büyümesinin veya büyük dikenlerin elle veya %10 ağartıcı ile sterilize edilmiş kesici aletler (%1 sodyum hipoklorit) kullanılarak çıkarıldığından emin olun.
      NOT: Bu adım, tomurcuk ağacının haznenin açılmasında manevra yapmasını kolaylaştırmak için önemlidir.
   3. Kavisli özelliklere sahip tomurcuk ağacı örneği olmadığından emin olun. Bunu yaparlarsa, %10 ağartıcıyla sterilize edilmiş kesici aletler (%1 sodyum hipoklorit) kullanarak bunları çıkarın ve BTE torbalarına numunenin yalnızca düz kısımlarını yerleştirin.
      NOT: Kavisli tomurcuk ağacının alete manevra yapması çok zordur, bu da düzensiz kabuk şeritlerine neden olur.
4. Ağacın NFC yaka etiketini taramak ve numune çantasındaki NFC klips etiketiyle bağlamak için telefon uygulaması TES izleyicisini kullanın.
5. Tomurcuk ağacının kalınlığına dikkat edin, çünkü bu, operatörün BTE haznesi içindeki floem bakımından zengin tomurcuk ağacı kabuğunu nasıl soyacağını belirler.
   1. Tomurcuk ağacının kalınlığı 0,20 inç'in altındaysa, tomurcuk ağacını sıyırırken dikkatli olun çünkü haznedeki yüksek hızlı eğirme iplikleri tüm tomurcuk ağacını çekirdeğine, kabuk tabakasının ötesine ve floem açısından zengin olmayan odun ve öz dokularına toz haline getirecektir.
   2. Daha kalın tomurcuk ağacı seçin çünkü floem bakımından zengin olmayan tomurcuk ağacı dokularından kaçınırken kabuk dokularını soymak daha kolaydır.
6. Numuneleri birkaç buz paketi ile yalıtımlı bir nakliye konteynerine yerleştirin.

2. Çeker ocakta kurulum

NOT: BTE'nin çeker ocak içinde çalıştırılması tercih edilir. Bu, bitki dokusu çapraz kontaminasyonu ve laboratuvar kontaminasyonu riskini azaltacaktır.

1. %10 (%1 sodyum hipoklorit) sprey şişesi kullanarak dezenfekte edin.
   1. Davlumbazın yüzeyine püskürtün ve çamaşır suyunu bir kağıt havluyla silmeden önce yaklaşık 1 dakika bekletin.
   2. Çamaşır suyu solüsyonu ile bir kağıt havlu püskürtün. TE tabanını, kantar bileşenlerini (tartı, hava kalkanı ve kule) ve bir keçeli kalemi silin.
2. İşlenecek numune sayısı için bir şırınga setini açın ve bunları kapalı bir karton kutuya yerleştirin.
3. İhtiyaç duyulması ihtimaline karşı kaputun dışında bir paket bez bulundurun.
4. Ağırlık ölçeğini hazırlayın.
   1. Ağırlık kulesini tartıdan çıkarın ve açmak için güç düğmesini basılı tutun. Ölçek 0'ı gösterdikten sonra kuleyi ölçeğin ortasına yerleştirin.
   2. Kantar hava kalkanını kantarın ön tarafına kaydırın.
5. Arkadaki anahtarı çevirerek doku çıkarıcı tabanını hazırlayın. Kutunun sol tarafındaki anahtarın üst kısmına basıldığından emin olun. Odanın hazır olduğunu gösteren yanıp sönen yeşil bir LED bekleyin.

3. Temizleme istasyonlarını kurun (Ek Şekil S1).

1. Ultrasonik temizleyiciye 1 L su koyun.
2. Ultrasonik temizleyicinin üstüne iki çöp torbası sarın.
3. Ultrasonik temizleyiciye ~ 5 L% 10 çamaşır suyu (% 1 sodyum hipoklorit çözeltisi) dökün.
4. Su küvetini bir hazneyi daldırmaya yetecek kadar suyla doldurun.
5. Hava kompresörünü açın ve valfi açın.
6. Hazne kururken sıvıyı yakalamak için bir zemin oluşturun.

4. Narenciye tomurcuk ağacı kabuğu sıyırma için BTE malzemesinin işlenmesi

1. Hazneyi BTE Tabanına yükleyin.
   1. BTE Odasını hazırlayın.
      1. Haznenin arkasına boş bir numune torbası takın. Boş torbayı BTE odasının arka ağzına sabitlemek için iki O-ring kullanın.
      2. Bıçağı, plastiğe devam ettiği yerde bıçak üzerinde oluşan kesikler veya uçta oluşan kesikler gibi aşınma veya hasar belirtileri açısından inceleyin. Bıçak üzerindeki okun tek kilit simgesiyle aynı hizada olduğundan emin olun.
      3. Haznenin altındaki hava tahliyesinin O sembolüne doğru çevrildiğinden emin olun. Şeffaf kapağı hazne açıklığının üzerine yerleştirin ve haznenin sağındaki rayı kullanarak şeffaf BTE sürgüsünü haznenin üzerine kaydırın. Haznenin altındaki kilidi, kızağın içine girebildiği kadar itin. Piston kapağının sürgünün üstüne monte edildiğinden emin olun.
   2. Hazneyi, BTE tabanının nozulu haznenin arkasına doğru çıkıntı yapacak şekilde BTE tabanına yerleştirin. Yerleştirmenin başarılı olduğunu gösteren mavi LED'in yanıp sönmesini bekleyin.
2. YüklesampNFC klipsindeki beyaz etiketi hareket ettirerek BTE tabanına tag kutunun sağ tarafındaki Z'ye. Sarı ışık yanıp sönmeye başlayana kadar etiketi Z üzerinde yavaş dairesel hareketlerle hareket ettirin. Numuneyi BTE tabanına takın ve numune torbasında delik olmadığından emin olun; Bir delik varsa, bantla yamalayın. O-ringi s'nin üzerine yerleştirinampBTE nozulunun önüne sabitlemek için torba.
3. Kullanılmayan şırınga setini yükleyin.
   1. Şırınga setinin darasını alın. Kullanılmayan şırınga setini kantar kulesine yerleştirin. Kırmızı bir ışık yanıp sönmeye başladığında veya tartı 0 gösterdiğinde şırınga setini çıkarın.
   2. Pistonu filtreli şırıngadan çıkarın. Sıvının alt (filtresiz) şırıngada olduğundan emin olun. Pistonu bir kağıt havlu üzerine veya siyah pistonun herhangi bir yüzeye temas etmediği kuleye yerleştirin.
   3. Çıkış portunu şırıngaya bastırarak ve 90° çevirerek şırıngayı sürgülü çıkış portuna takın.
4. Tomurcuk ağacı örneğini işleyin.
   DİKKAT: BTE, yüksek hızlı hareketli parçalara sahiptir. Tüm işlemlerin bir çeker ocak içinde gerçekleşmesi gerekir. Tüm kullanıcılar koruyucu gözlük, kulaklık (kulak tıkacı) ve eldiven ve laboratuvar önlüğü gibi diğer tüm kişisel koruyucu ekipmanları (KKD) kullanmalıdır.
   1. Makineyi başlatmak için üstteki siyah düğmeye basın. İşleme sırasında herhangi bir zamanda motoru durdurmak için ikinci kez basın.
      NOT: Kutu, düzgün çalışmasını sağlamak için hız ve sıcaklık algılama özelliğine sahiptir.
   2. Torbadan bir tomurcuk ağacı çubuğu alın ve BTE memesinin üstünden geçirin.
   3. Diğer elinizle haznenin diğer tarafındaki tomurcuk ağacı çubuğunu tutun ve yavaşça bıçağa doğru inin. Tomurcuk ağacının kabuğundan sıyrıldığını gösteren hafif bir uğultu sesi dinleyin. Tomurcuk ağacını döndürürken yavaşça ileri geri hareket ettirin.
      1. Yüksek, agresif bir doğrama sesi duyulursa, dalı hızla yukarı doğru hareket ettirin ve/veya motoru durdurmak için üst düğmeye basın. Motoru durdurmak için, işlemi bitirmek için sağ taraftaki anahtarı kullanın (bkz. adım 4.4.3.2).
      2. Keserken çıkıştan malzeme çıkmıyorsa, haznede tıkanıklık vardır. Motoru kapatın, sürgülü piston kapağını çıkarın ve tıkanıklığı makinenin çıkışından dışarı itmek için çubuğun plastiğini kullanın. İşlemi bitirmek için sağ taraftaki anahtarı kullanın: Yukarı = İleri kesme; Orta = Motor kapalı; Aşağı = Ters Kesim.
   4. Kalan dallar için 4.4.2 ve 4.4.3 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Yeterli tomurcuk ağacı kabuğunun sıyrıldığının genel bir göstergesi, şırınganın %25'inin bitki dokusuyla doldurulmuş olmasıdır. Narenciyenin aşı ile bulaşan patojenleri ağaçta eşit olmayan bir şekilde dağılabilir. Bu nedenle, narenciye ağacı gölgesinin etrafından üç ila dört tomurcuk ağacı örneği toplanır. BTE taşıma torbasındaki her tomurcuk ağacı örneğinin, tam bir ağaç temsili numunesinin patojenler için test edilmesini sağlamak için nihai öğütülmüş doku numunesine katkıda bulunması önemlidir.
   5. İşlemeyi durdurmak için üstteki siyah düğmeye basın. Işığın tekrar sarı renkte yanıp sönmeye başlamasını bekleyin.
5. Numune ağırlığını doğrulayın.
   1. Şırıngayı 90° döndürün ve çıkarmak için aşağı çekin. Pistonu şırıngaya geri yerleştirin ve şırıngayı kuleye yerleştirin.
   2. Terazinin numuneyi otomatik olarak algılamasını bekleyin ve numunenin uygun ağırlık aralığında (0,25 ± 0,05 g) olup olmadığını belirleyin. Numune ağırlığı çok düşükse (<0,20 g), adım 4.4'ü tekrarlayın; kırmızı LED yanıp sönmeye başlayacaktır. Numune ağırlığı çok yüksekse (>0,30 g), numune malzemesinin bir kısmını çıkarın; sarı LED daha yavaş yanıp sönmeye başlayacaktır. Numune aralık içindeyse, yeşil LED yanıp sönmeye başlayacaktır.
6. Tomurcuk ağacı örneğinin homojenleştirilmesi
   1. Pistonu numunenin bulunduğu şırıngadan çıkarın, sıvıyı numunenin bulunduğu şırıngaya itin ve pistonu tekrar ekleyin. Piston, tamponu ve bitki özsuyunu ağ filtreden (herhangi bir büyük kabuk dokusu parçasını alıkoyarak) ve kauçuk boru yoluyla boş şırıngaya iter.
   2. Tamponu ve bitki özsuyunu bir şırıngadan diğerine ileri geri iterek numuneyi karıştırın. Numune homojen bir yeşil sıvı karışımı haline gelene kadar ~3x-4x tekrarlayın.
   3. İyice homojenize edildikten sonra, bitki özsuyu örneğini ağ filtresi olmadan şırıngaya itin ve kauçuk boruyu ve filtreli şırıngayı numunenin bulunduğu şırıngadan ayırın.
   4. Bitki özsuyu örneğini şırıngadan 2 mL'lik steril bir mikrosantrifüj tüpüne boşaltın ve daha fazla kullanılana kadar −20 °C'de saklayın. Numuneyi torba numarasıyla etiketlemek için kalıcı bir işaretleyici kullanın.
      NOT: Adım 4.6.5'teki bitki numunesi özsuyu artık mevcut nükleik asit, RNA veya DNA'dan herhangi biri, nükleik asit ekstraksiyonu ve saflaştırılması için fenol-kloroform, silika kolonu veya manyetik boncuklara^dayalı ekstraksiyon yöntemleri 9,25,26,27 ile işlenebilir (bkz. adım 7) ve narenciyenin greftle bulaşan patojenlerinin aşağı akış tespiti (bkz. adım 8).

5. BTE çıkarılabilir bölmesinin sterilize edilmesi

DİKKAT: Şırınga setindeki tampon hazneye veya sürgüye girerse, temizlemeden önce durulayın ve laboratuvarın tüm güvenlik kurallarına uyun. Şırınga seti guanidin tiyosiyanat içerir. Şırınga setindeki tampon ağartıcı ile temas ederse siyanür gazı oluşturur.

1. 10. numune haznede işlendikten sonra aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Yeşil LED'in mavi yanıp sönmek yerine yanıp sönmeye devam edeceğini unutmayın.
2. Olası tüm kirleticileri temizlemek için BTE odasını sökün; Şeffaf plastik kapağı çıkarın, hazne sürgüsünü temizleyin ve hazne kızağındaki tıkanıklık portunu temizleyin.
3. Haznenin altındaki hava tahliye vanasını açık konuma çevirin (asma kilit işaretini açın). Hazne bileşenlerini kurulum ultrasonik temizleyiciye yerleştirin (bkz. adım 3.1). Yüzmesini önlemek için kapağı haznenin altına yerleştirin. Ultrasonik temizleyiciyi 15 dakika çalıştırın.
   NOT: Ultrasonik temizleme banyosu (5 L) iki hazneye kadar tutabilir.
4. Hazne bileşenlerini su banyosunda (adım 3.4) en az 30 saniye durulayın. Hazne bileşenlerini kurutma istasyonuna taşıyın.
   DİKKAT: Kurutma, hazne içinde hızlı hareket eden parçalara, yüksek seslere (~85 desibel [dB]) ve olası sıçramalara neden olur. Tüm kullanıcılar, işletim laboratuvarının güvenlik kurallarının gerektirdiği şekilde koruyucu gözlük, kulaklık (kulak tıkacı), laboratuvar önlüğü ve diğer tüm KKD'leri kullanmalıdır.
5. BTE haznesini kurutun.
   1. Hava tabancasını, haznenin üst açıklığının oluğu ile aynı hizaya getirin (sürgünün tipik olarak olacağı yer). ~30 s boyunca hava dağıtmak için tabancanın tetiğine basın.
      NOT: Açıklığın kullanıcıdan zemine doğru uzakta olduğundan emin olun. Bu, altında sıkışan sıvıyı çıkarmak için bıçak setini döndürmelidir.
   2. Hava tabancasını haznenin üst nozullarına doğru konumlandırın. Hava tabancasının tetiğine basın ve her bir nozul girişinin üç tam dairesini yavaşça izleyin.
   3. Hava tabancasını BTE'nin ortasına yerleştirin. En içteki noktadan başlayarak tetiği basılı tutun ve hava tabancası kızağın olacağı yere doğru hareket ettirin.
   4. Yüzey suyunu dışarıdan uzaklaştırmak için havayı ön ve arka olmak üzere tüm hazneye hızlı bir şekilde akıtan.
6. BTE slaytını kurutun.
   1. Hava tabancasını sürgünün piston yuvasına yerleştirin ve sürgü çıkışından suyu çıkarmak için tetiğe basın.
   2. Kurutmak için sürgünün iç yüzeyi boyunca bir hava tabancası çalıştırın.
   3. Suyu dışarı itmek için kızak oluğu boyunca bir hava tabancası çalıştırın.
   4. Yüzey suyunu çıkarmak için havayı tüm dış kısımdan hızla geçirin.
7. Bileşenleri kurutun.
   1. Sürgülü piston kapağını ve O-ringleri elinizde tutun ve tetiğe basın.
   2. Kapağın iç yüzeyi üzerinde bir hava tabancası çalıştırın.
   3. Bileşenleri hazneye yerleştirin ve kurutmaya devam etmek veya yeniden monte etmek için kaydırın.
      NOT: Birden fazla fonksiyonel BTE'ye sahip yüksek doku işleme ortamı için, aynı anda 10 odayı dekontamine edebilen bir toplu sanitasyon sistemi sağlanabilir.

6. İmha etme ve sterilize etme

1. Şırıngaları ve kauçuk boruları belirtilen guanidin atık kabına atın.
2. Herhangi bir bitki materyalini biyolojik olarak tehlikeli atık kabına atın.
3. BTE haznesini BTE tabanından çıkarın.
4. BTE odasını sökün ve 5. adımda açıklandığı gibi dekontaminasyona devam edin.

7. BTE narenciye tomurcuk ağacı ekstraktlarından saflaştırılan RNA'nın doku işlemesi ve kalitesinin değerlendirilmesi

NOT: Bu protokolde, narenciye tomurcuk ağacı dokusunun işlenmesi için gereken süreyi ve BTE tarafından hazırlanan kabuk dokusu ekstraktlarından saflaştırılan RNA'nın kalitesini karşılaştırmak için 255 narenciye ağacından tomurcuk ağacı örnekleri kullandık (Şekil 2, sağ taraf, adım 1, adım 5 ve adım 6) ile elle soyma ve doğrama kullanılarak düzenleyici olarak onaylanmış narenciye tomurcuk ağacı doku işleme yöntemi izlenerek hazırlananlar, Dang ve ^ark.23 tarafından tarif edildiği gibi kabuk dokusunun dondurularak kurutulması, toz haline getirilmesi ve santrifüjlenmesi (Şekil 2, sol taraf, adım 1-6).

1. Mevcut laboratuvar prosedürü: Yasal olarak onaylanmış yönteme göre doku işleme için tomurcuk ağacı numuneleri hazırlayın²³.
   1. Dang ve ^ark.23 tarafından tarif edildiği gibi kabuk dokusunun elle soyulmasını ve doğranmasını, dondurarak kurutmayı, toz haline getirmeyi, santrifüjlemeyi ve bitki özsuyunun RNA ekstraksiyon tüpüne transferini gerçekleştirin (Şekil 2, sol taraf, adım 1-6).
   2. Test edilen her ağaçtan üç ila dört tomurcuk ağacı örneğini elle soyduktan sonra, tüm tomurcuk ağacını BTE uyumlu bir plastik torba taşıyıcısına koyun ve BTE işlemine kadar 4 °C'de saklayın (adım 7.2).
2. BTE prosedürü: BTE narenciye tomurcuk ağacı dokusu işlemeyi başlatın (bölüm 4, adım 4.1-4.6; Şekil 2, sağ taraf, adım 1, adım 5 ve adım 6).
   1. Tomurcuk ağacı s'yi kullanınampadım 7.1.2'deki BTE taşıma çantalarında saklanır.
3. Mevcut laboratuvar prosedüründen (adım 7.1.1) ve BTE prosedüründen (adım 7.2.2) elde edilen bitki özsuyundan RNA'yı, düzenleyici olarak onaylanmış yarı otomatik manyetik boncuk bazlı yöntem 8,23,28 kullanarak ekstrakte edin ve saflaştırın.
4. Konsantrasyonunu, saflığını ve bütünlüğünü ölçerek RNA kalitesini değerlendirin 8,23,24,29,3 ^3,31.
   1. Konsantrasyonu hesaplamak için 260 nm dalga boyunda spektrofotometri ve optik yoğunluk (OD) kullanın.
   2. Saflığı değerlendirmek için 260/280 spektrofotometrik OD oranı kullanın.
   3. Bütünlüğü kontrol etmek için, NADH dehidrojenaz narenciye geninin^24,32 mRNA'sını hedefleyen ters transkripsiyon (RT) kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) reaksiyonu kullanın.

8. BTE narenciye tomurcuk ağacı ekstraktlarından saflaştırılmış RNA kullanılarak narenciye virüslerinin ve viroidlerinin çapraz kontaminasyonunun ve tespitinin değerlendirilmesi

NOT: Bu protokolde, BTE tarafından işlendiğinde numuneler arasında çapraz kontaminasyon potansiyelini değerlendirmek için enfekte olmamış 72 narenciye ağacından ve virüs ve viroidlerle enfekte olmuş bir ağaç karışımından tomurcuk ağacı örnekleri kullandık (Şekil 2, sağ taraf, adım 1, adım 5 ve adım 6) ve narenciye virüslerinin ve viroidlerin RT-qPCR tespiti için bir şablon olarak kullanılmak üzere BTE tarafından hazırlanan kabuk dokusu ekstraktlarından saflaştırılmış RNA'nın uygunluğu.

1. İlk BTE numune işleme: Enfekte olmamış 72 numuneyle temel bir deney yapın.
   1. Üç (AC) BTE odası hazırlayın (adım 4.1.1).
   2. Enfekte olmayan tüm narenciye tomurcuk ağacı örneklerini (1-72) BTE taşıma torbalarında hazırlayın ve her örnek için bir şırınga sistemi ile iki şırıngalı BTE örnek toplama sisteminde eşit sayıda (72) hazırlayın (adım 2.4).
   3. Numune taşıma torbalarını ve numune toplama şırıngalarını her biri 12 numuneden oluşan altı partiye (I-VI) ayırın.
   4. Aşağıdaki sırayı izleyerek BTE narenciye tomurcuk ağacı doku işlemeyi (adım 4) başlatın (adım 8.1.4.1-8.1.4.6) (Bkz. Tablo 1, İlk BTE Numune İşleme).
      1. Parti I/Numune 1-12 için, A haznesini kullanarak 12 numuneyi işleyin. Numune 12'den sonra A haznesini sterilize edin (adım 5).
      2. Parti II/Numuneler 13-24 için, B haznesini kullanarak 12 numuneyi işleyin. Numune 24'ten sonra B haznesini sterilize edin (adım 5).
      3. Parti III/Numuneler 25-36 için, C haznesini kullanarak 12 numuneyi işleyin Numune 36'dan sonra C haznesini sterilize edin (adım 5).
      4. Parti IV/Numuneler 37-48 için, sterilize edilmiş oda A'yı kullanarak 12 numuneyi işleyin (adım 8.1.4.1).
      5. Parti V/Numuneler 49--60 için, sterilize edilmiş oda B'yi kullanarak 12 numuneyi işleyin (adım 8.1.4.2).
      6. Parti VI/Numuneler 60-72 için, sterilize edilmiş oda C'yi kullanarak 12 numuneyi işleyin (adım 8.1.4.3).
   5. BTE taşıma torbalarını tüm s'lerle birlikte 4 °C'de saklayın.ampadım 8.2'de kullanıma kadar.
   6. 72 adım 8.1.4.1-8.1.4.6'da oluşturulan bitki özsuyu örneğinden, düzenleyici olarak onaylanmış yarı otomatik manyetik boncuk bazlı yöntem 8,23,28'i kullanarak RNA'yı çıkarın ve saflaştırın.
   7. Daha önce açıklandığı gibi narenciye virüslerinin ve viroidlerin tespiti için RT-qPCR gerçekleştirin ^8,33.
2. İkinci BTE numune işleme için, 70 enfekte olmayan numune ve iki karışık enfekte numune ile çapraz kontaminasyon deneyi gerçekleştirin.
   1. Üç (AC) BTE odası hazırlayın (adım 4.1.1).
   2. Karışımla enfekte olmuş narenciye tomurcuk ağacı örneğini (73) iki BTE taşıma torbasında (adım 1.3) toplam iki enfekte numune için hazırlayın.
   3. BTE taşıma torbalarını, enfekte olmamış narenciye tomurcuk ağacı numuneleriyle birlikte toplayın, Numune 3-Parti I ve Numune 51-Parti V hariç (bkz. adım 8.2.4'teki numune değişimi), toplam enfekte olmayan numune sayısı için adım 8.2.4'ten.
   4. Toplam 72 numune sayısı için Parti I'deki Numune 3 yerine miks ile enfekte numune 73 ve Parti V'deki Numune 51 yerine ikincisini içeren ilk BTE taşıma çantasını ekleyin.
   5. Her numune için bir çift şırınga sistemi ile iki şırıngalı BTE numune toplama sisteminde eşit sayıda (72) hazırlayın (adım 2.4).
   6. 72 numune taşıma torbasını ve numune toplama şırıngasını her biri 12 numuneden oluşan altı partiye (I-VI) ayırın.
   7. BTE narenciye tomurcuk ağacı dokusu işlemeyi başlatın (adım 4), adım 4-8.1.4.1-8.1.4.6'daki sırayı takip edin.
      NOT: Tek fark, Parti I'deki Numune 3'ün ve Parti V'deki Numune 51'in enfekte numune 73 (adım 8.2.4) ile değiştirilmesidir (Tablo 1, İkinci BTE Numune İşleme).
   8. Adım 8.2.7'de oluşturulan 72 bitki özsuyu örneğinden RNA'yı adım 8.1.6'da olduğu gibi ekstrakte edin ve saflaştırın.
   9. Adım 8.1.7'de olduğu gibi narenciye virüslerinin ve viroidlerin tespiti için RT-qPCR gerçekleştirin.

Results

BTE ile işlenmiş tomurcuk ağacı narenciye dokusu kullanılarak RNA ekstraksiyonu, saflaştırılması ve kalitesi ve doku işleme süresinin değerlendirilmesi
BTE'den alınan RNA kalitesini standart prosedürle karşılaştırmak için bu test için 255 temsili narenciye ağacından tomurcuk ağacı örnekleri kullandık. Numuneler, tomurcuk ağacı doku çıkarıcısı (BTE) tarafından işlendi (protokol adımları 4.1-4.6 ve Şekil 2, sağ taraf, adım 1, adım 5 ve adım 6) veya Dang ve ^ark.23 tarafından tarif...

Discussion

HLB narenciye hastalığının ortaya çıkmasıyla birlikte, kayıpları azaltmak için narenciye endüstrisi, düzenleyici kurumlar ve teşhis laboratuvarları, hastalık yönetimi uygulamalarıyla birlikte tek tek ağaçların test edilmesi için qPCR³⁴ gibi düşük verimli manuel numune işleme ve patojen tespit testleri ile birlikte yüksek verimli nükleik asit ekstraksiyon yöntemlerine güvenmeye teşvik edilmiştir³⁵. Kaliforniya'nın HLB pozitiflik oranı 2012'de %0,01'den 2020'de %1,2'ye çıktı....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,08" Altıgen Düzeltici hattı	PowerCare	FPRO07065	Bıçakları değiştirmek için gereklidir.
1 Hp, 8 gal hava kompresörü	California Hava Araçları	8010	Durulandıktan sonra odaları hızla kurulayın
1,5 mL mikrosantrifüj tüpü	Globe Scientific	111558B	Enjektörlerle çalkaladıktan sonra numuneyi saklayın
10 mL Şırınga Seti	Teknoloji Gelişen Çözümler	TE006-F1-10A-G1000-E1	Şırınga malzemesi kesilir. Guanidin tiyosiyanat tamponlu 1 L şişe. UYARI - guanidin tiyosiyanat içerir, tehlikeli atık servisi gereklidir - çamaşır suyu
12 "Ruler	Westcott	& lrm ile karıştırmayın; 16012	Kesmeden önce düzeltici hattını ölçmek için
% 12 Sodyum Hipoklorit	Hasa	1041	İşlemden sonra odaları dezenfekte
eder-20 C Dondurucu	Insignia	NS-CZ70WH0	İşlemden sonra numuneyi saklayın
4 "x 12" plastik torbalar	Plymor	FP20-4x12-10	Nakliye sırasında dalları tutmak için torbalar. O-ringler,
tıkanıklıkları gidermek için	"Pamuklu Çubuk	Puritan	806-PCL
7 Galon Depolama Çantası	HDX	206152	Odaları dezenfekte etmek için sodyum hipoklorit çözeltisini ve odaları durulamak için suyu tutar
Hava üfleme tabancası	JASTIND	& lrm; JTABG103A	Havayı yüksek basınçta odalara yönlendirir
Black Sharpie	Sharpie	S-19421	Numuneyi daha sonra tanımlayabilmeniz için 1,5 mL'lik tüpleri işaretleyin
Şişe Üstü Dağıtıcı	Marka	Z627569	Gandini şırıngaya dağıtmak için ayarlanabilir şişe üstü dağıtıcı
BTE Oda Teknolojisi	Gelişen Çözümler	TE002BB-A05-E1	Tomurcuk ağacını işlemek için kullanılır. O-ringler, BTE Sürgü, sürgülü piston, tahliye vanası, kapak, bıçak seti ve bıçak seti çıkarma aleti içerir
hipokloritin hazneye nüfuz etmesini iyileştirmek için	Bulaşık Sabunu	Dawn	57445CT
Parlatıcı Hepa filtreli davlumbaz	Air Science	P5-36XT-A Hepa	filtreli çeker ocak (ASTS-030)  olası kontaminasyonu sınırlamak ve kimyasal dökülmelere karşı korumak için
Yalıtımlı köpük nakliye konteyneri	PolarTech	261/J50C	Numuneler toplandıktan sonra buz üzerinde sevk etmek için yalıtımlı nakliye konteyneri
Laboratuvar önlüğü	Kırmızı Kap	KP14WH LN 46	Olası kontaminasyonu sınırlamak ve kimyasal dökülmelere karşı korumak için laboratuvar önlüğü
Dizüstü	TES		GUI'yi çalıştırmak için Microsoft Surface Wifi özellikli dizüstü bilgisayar. İlk kurulum için gereklidir ve doku işleme tabanı hakkında daha ayrıntılı bilgi sağlar
NFC Özellikli Telefon	Samsung	Galaxy S9	TES telefon uygulamasını indirmek ve kullanmak için telefon NFC
klip etiketi	Teknoloji Gelişen Çözümler	TE005-Clip-E1	Ağaçlarla bağlanabilen örnek etiket. TES telefon uygulaması NFC Yaka Etiketi Teknolojisi ile çalışacak şekilde üretilmiştir
	Gelişen Çözümler	TE005-Yaka-E1	Bir ağaca tutturulmuş etiket. TES telefon uygulamasıyla çalışacak şekilde üretilmiştir
Nitril Eldivenler	Usa Scientific	3915-4400	Olası kontaminasyonu sınırlamak ve kimyasal dökülmelere karşı koruma sağlamak için eldivenler
Gürültü Azaltıcı Kulaklık	3M	90565-4DC-PS	Hava kompresörünü ve doku işleme tabanını çalıştırırken kulakları koruyun
Poliüretan Geri Tepme Hava Hortumu	FYPower	‎ 510019	Hava tabancasını kompresöre bağlar
Emniyet gözlükleri	Solidwork	SW8329-US	Gözleri kimyasal ve fiziksel tehlikelere karşı koruyun
Sprey şişesi	JohnBee	B08QM81BJV	Yüzeyleri dekonatinize etmek için sprey ağartıcı
Doku Çıkarıcı Baz Teknolojisi	Gelişen Çözümler	TE001-A-E1	Bitki dokusunu işlemek için sistem. Çalışması için BTE veya LTE odalarına ihtiyaç duyar. Güç kablosu, bıçak adaptörü ve 8/32" alyan anahtarı içerir
Doku İşleme Tabanı Ağırlık Kantarı	Teknolojisi Gelişen Çözümler	TE003-A05-200g-01-E1	Ağırlık aralıklarını zorlamak ve/veya ağırlıkları numuneyle bağlamak için doku işleme tabanına bağlanan 200 g, 0,01 çözünürlüklü ağırlık ölçeği. Tartı, güç kablosu, bağlantı kablosu, 5ml şırınga tutucu, kule hava kalkanı içerir;
Vermikülit	EasyGoProducts	B07WQDZGRP	Tehlikeli atık bertaraf servisi Tel Kesici Boenfu&lrm kullanarak tehlikeli atıkları (guanidin tiyosiyanat) taşımak için gereklidir
		; BOWC-06002-US	Düzeltici hattını kesmek için tel kesiciler