Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare Yenidoğan Beyinlerinin Mikro-BT Görüntüleme ve Morfometrik Analizi

2.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65180

⸱

19 Mayıs 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Unidad Ejecutora de Estudios en Neurociencias y Sistemas Complejos (ENyS, CONICET-UNAJ-HEC), 2Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Plata, 3Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 4Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) ve ex vivo örneklerde bir kontrast maddeyi birleştirerek yenidoğan fare beyinlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etme adımlarını açıklamaktadır. Bu görüntülerde beyin boyutunu ve şeklini ölçmek için temel morfometrik analizleri açıklıyoruz.

Özet

Nörogörüntüler, hayvan modelleri kullanılarak yapılan deneylerde beyin morfolojisini incelemek için değerli bir araçtır. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG), yumuşak dokular için standart yöntem haline gelmiştir, ancak düşük uzamsal çözünürlüğü küçük hayvanlar için bazı sınırlar oluşturmaktadır. Burada, mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) kullanarak fare yenidoğan beyinleri ve kafatasları hakkında yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) bilgi elde etmek için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, numuneleri incelemek, beyni boyamak ve taramak ve tüm organ ve ilgilenilen bölgelerin (ROI'ler) morfometrik ölçümlerini elde etmek için gereken adımları içerir. Görüntü analizi, yapıların segmentasyonunu ve nokta koordinatlarının sayısallaştırılmasını içerir. Özetle, bu çalışma, mikro-BT ve Lugol solüsyonunun kontrast madde olarak kombinasyonunun, küçük hayvanların perinatal beyinlerini görüntülemek için uygun bir alternatif olduğunu göstermektedir. Bu görüntüleme iş akışı, gelişim biyolojisi, biyotıp ve çeşitli genetik ve çevresel faktörlerin beyin gelişimi üzerindeki etkisini değerlendirmekle ilgilenen diğer bilimlerde uygulamalara sahiptir.

Giriş

Mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) görüntüleme, farklı araştırma alanları için değerli bir araçtır. Biyolojide, mineralize dokularda X-ışını emilimi nedeniyle özellikle kemik araştırmaları için uygundur. Bu özellik nedeniyle, diğer konuların yanı sıra kemik gelişimi1, metabolizma2 ve evrim 3,4 ile ilgili çeşitli sorulara mikro-BT yardımıyla yaklaşılmıştır. 2008 yılında, de Crespigny ve ark.5, yetişkin fare ve tavşan beyinlerinin mikro-BT görüntülerinin kontrast madde olarak iyot kullanılarak elde edilebileceğini gösterdi. Bu çalışma, bu görüntüleme tekniği için yeni bir uygulama açtı, çünkü iyot, aksi takdirde X-ışınlarına duyarsız olacak yumuşak dokulardan görüntülerin alınmasına izin verdi. Bu nedenle, mikro-BT ve iyot bazlı bir kontrast maddeyi birleştirmenin genel amacı, yumuşak dokuların mezo veya makro anatomik düzeyde ayırt edilebildiği ve tanımlanabildiği yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmektir.

Bu teknik, deneysel tasarımlarda yaygın olarak kullanılan fare embriyoları gibi küçük örneklerin ayrıntılı ex vivo fenotipik karakterizasyonunu gerektiren çalışmalar için dikkate değer bir potansiyele sahiptir6. Mikro-BT görüntüleme ile birlikte iyot kontrastı, organların7 ve dönüm noktası niteliğindeki üç boyutlu (3D) yapıların 8,9 hacimsel niceliklerini elde etmek için kullanılmıştır. Son yıllarda, kemirgenlerin10 beyin fenotipik özelliklerini tanımlamak için boyanmış örneklerin mikro-BT taraması uygulanmış ve teknikte farklı iyileştirmeler önerilmiştir. Yetişkin beyinleri için, bir hidrojel ile önceki bir perfüzyon adımı ile iyot içine 48 saatlik bir daldırma protokolünün, yüksek kaliteli görüntüler ürettiği bulundu11. Gignac ve ark.12, iyotla boyanmış sıçan beyinlerinin rutin histolojik teknikleri uygulamak için işlenebileceğini göstererek bu tekniğin sınırlarını genişletti. Benzer şekilde, bu prosedürler embriyonik ve sütten kesilmeden önce kemirgen beyinleri için umut verici sonuçlar göstermektedir 8,13,14,15.

Sinirbilim, beyin gelişiminin farklı yapısal ve işlevsel yönlerini değerlendirmek için büyük ölçüde mikroskop tabanlı teknikler uygulamış olsa da, bu tür çalışmalar belirli hücre popülasyonlarını veya mekansal olarak sınırlı yapıları karakterize etmek için daha uygundur. Tersine, mikro-BT görüntüleme, tüm yapıların tanımlanmasına ve mikroskobik tekniklerin tamamlayıcısı olan ilgili uzamsal bilgileri koruyan 3D modellerin elde edilmesine izin verir. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) de küçük hayvanların yapısal özelliklerini araştırmak için uygulanan standart bir tekniktir 16,17,18. Bununla birlikte, bir kontrast madde kullanan mikro-BT'nin ex vivo sabit numuneler için iki ana avantajı vardır: mikro-BT tarayıcıları büyük ölçüde daha ucuzdur ve kullanımı kolaydır ve MRI12'den daha yüksek bir uzamsal çözünürlüğe izin verir.

Bu çalışma, iyot bazlı bir kontrast madde olan Lugol çözeltisi ile boyandıktan sonra mikro-BT taraması kullanılarak yenidoğan fare beyinlerinden yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etme prosedürünü tanımlamayı amaçlamaktadır. Numune toplama ve dokuların fiksasyonu gibi ön aşamalarla başlayan ve boyama, mikro-BT görüntü elde etme ve standart işlemeden geçen kapsamlı bir protokol sunulmaktadır. Görüntü işleme, tüm kafanın ve beynin 3 boyutlu hacminin segmentasyonunu ve daha sonra morfometrik analizlerde kullanılabilecek nokta koordinatlarını sayısallaştırmak için belirli anatomik düzlemlerin seçilmesini içerir. Burada odak noktası yenidoğan fare beyni olsa da, benzer stratejiler diğer yumuşak dokulara da uygulanabilir. Bu nedenle, burada sunulan protokol, ince değişikliklerle diğer numune türlerine uygulanabilecek kadar esnektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerini takip etti.

1. Numune toplama ve hazırlama

  1. 500 mL% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
    1. Bir kabindeki ekstraksiyon akışı altında, 1 L'lik bir cam beherde 250 mL 1x fosfat tamponlu saline (PBS) 20 g PFA tozu ekleyin. Mıknatıslı kabı manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirin.
    2. Isıtırken karıştırın. Bir termometre ile, çözeltinin sıcaklığını 60 °C'nin altında tutmak için sürekli kontrol edin.
    3. Plastik bir Pastör pipeti ile PFA'yı çözmek için çözeltiye 1 M NaOH damlası ekleyin. PFA tozu tamamen çözüldüğünde, çözeltiyi oda sıcaklığında (RT) soğutun.
    4. 1x PBS ile ses seviyesini 500 mL'ye ayarlayın. Plastik bir Pasteur pipeti ile 1 M HCl'lik damlalar ekleyerek pH'ı 7.2-7.3'e ayarlayın.
    5. Bir kağıt filtre ve bir cam huni kullanarak, çözeltiyi 1 L'lik bir cam şişede süzün.
    6. Cam şişeyi kapatın, flux dolabından çıkarın ve -4 °C'de buzdolabında saklayın.
  2. Beyin örnekleri toplayın.
    1. Örnek almak için, fare yenidoğanlarını doğumlarını takip eden sabah, 0.5 günlükken (P 0.5), başlarını kesmek için cerrahi makas kullanarak kurban edin.
    2. Vücudu tutarken makası yenidoğanın boynuna yerleştirin ve tek ve temiz bir kesim yapın.
  3. Numuneleri PFA'ya sabitleyin.
    1. 50 mL'lik bir konik tüpü 40 mL% 4 PFA ile doldurun.
    2. Her kafayı bir fiksasyon maddesi olarak PFA içeren tüpe daldırın. Bu işlem için bir Paton spatula veya kaşık kullanın.
    3. Konik tüpleri buzdolabında -4 °C'de 48 saat saklayın, ardından koruyucu olarak %0,1 sodyum azid içeren 40 mL 1x PBS'ye geçin. Buzdolabında -4 °C'de muhafaza edin.

2. Örnek boyama

  1. Lugol'un çözeltisini hazırlayın (% 3.75 a / h).
    1. Bir kabindeki bir ekstraksiyon akısı altında, 1 L'lik bir cam beherde, 10 g Kl ve 5 g I2'yi 400 mL damıtılmış su içinde manyetik bir karıştırıcı kullanarak sürekli karıştırarak çözün.
  2. Her kafayı 40 mL Lugol çözeltisi içeren 50 mL'lik konik bir tüpe daldırın.
    1. Yaklaşık vücut büyüklüğü 1.3 g olan yenidoğanlar için, numuneleri bir orbital çalkalayıcı kullanarak sürekli karıştırarak 15-20 saat daldırılmış halde bırakın.
    2. Numuneleri, taramadan önce 30 dakika boyunca 10 mL% 1 agaroz içeren 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.

3. Mikro-CT taraması

NOT: Mikro-CT taraması özel ekipman gerektirir. Bu tür bir tarayıcı için farklı seçenekler vardır ve satın alma ile ilgili ayrıntılar kullanılan ekipmanın özelliklerine bağlıdır. Dr. Hallgrímsson'un laboratuvarı, mikro-CT tarayıcılarının bazı alternatiflerine güveniyor. Burada protokol, dünyanın dört bir yanındaki laboratuvarlar tarafından kullanılan daha erişilebilir küçük hayvan görüntüleme makineleri arasında yer alan temel bir masaüstü tarayıcısının kullanımına dayanmaktadır. Tarama hedefi kafatası ise, protokolün 2. bölümündeki adımları atlayın ve 3. bölüme geçin. Kafatası tarandıktan sonra, hem beynin hem de kafatasının aynı örneklerinden görüntüler elde etmek için boyama işlemi ve beynin taranması gerçekleştirilebilir.

  1. Numuneyi mikro-CT tutucusuna yerleştirin.
    1. Numuneyi 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Tarayıcı oturumu sırasında hareket etmemek için örneği düzeltin. Bu amaçla, tüpün boş kısımlarını doldurmak için bir miktar poliüretan malzeme kullanılabilir.
    2. Ekipmanı açın ve numunenin bulunduğu tüpü mikro-CT tutucusuna yerleştirin.
    3. Mikro-CT kontrol paneline giriş yapın ve taranacak numuneyi kaydedin. Bu, otomatik olarak bir numune numarası oluşturacaktır. Numaraya ek olarak, "Ad" alanını doldurun. Ham verilerin tekrar alınması gerekmesi ihtimaline karşı hem numune adı hem de numarası başka bir yere (örneğin bir elektronik tabloya) kaydedilmelidir.
    4. Tarama programını başlatın. Numune adını veya numarasını girin ve tarama parametrelerini içermesi gereken bir Kontrol dosyası seçin.
  2. Örneği tarayın.
    1. Mikro-CT yazılımının ekranında aşağıdaki parametreleri ayarlayın: 0,012 mm izotropik voksel boyutu, 45 kVp, 177 lA, 800.000 ms entegrasyon süresi ve 180°'de 500 projeksiyon.
    2. Scout View'ı seçerek tarama bölgesini ayarlayın. Referans görüntü göründüğünde, bölgeyi ayarlamak için Referans Çizgisi'ne basın. Düz yeşil çizgiyi örneğin kenarına taşıyın, ardından tarama bölgesini örneğin diğer kenarına genişletmek için imleci sürüklerken Shift tuşunu basılı tutun.
    3. Taramayı başlatmak için Tamam'ı seçin.
  3. Taramayı değerlendirin ve dışa aktarın.
    1. Mikro-CT tarayıcı Değerlendirme Programını açın ve Numune ve Ölçüm Seç'e tıklayın. Filtre alanına örnek adını yazın, örneği seçin ve ölçüm dosyasını seçin.
    2. Dosya, sayısı ilk tarama penceresine bağlı olan dilimler halinde yüklenecektir. Tıkla Tümünü yükle düğmesi, her dilimi yükleyecek ve daha sonra dilimler arasında hareketi kolaylaştıracaktır.
    3. Dilimlerin etrafında bir kırpma kutusu başlatmak için Görevler > Değerlendirme 3D'yi seçin. Görev/Değerlendirme, VOI (İlgilenilen Hacim), Başlangıç X, Y, Z ve X, Y, Z Boyutu dahil olmak üzere bir dizi alan içeren bir 3D Değerlendirme istemi görünecektir.
    4. Yeniden yapılandırma, segmentasyon, morfometri (örneğin, kemik mineral yoğunluğu) ve dosya dönüştürmeleri veya aktarımları gibi çeşitli değerlendirme görevleri gerçekleştirilebileceğinden, Görev > Değerlendirme 3B alanını uygun komut dosyasına ayarlayın. Varsayılan Değerlendirme betiği kılavuz olarak kullanılabilir.
    5. Komut dosyasını seçtikten sonra, ana görüntüdeki VOI kutusunu ayarlayın. İlk dilimden başlayın. Kutunun değerlendirilecek anatomiyi içerdiğinden emin olun. Küçük beyaz karelerden birine kutu kenarına doğru sağ tıklayarak ve farenin orta düğmesini kullanarak VOI'yi yeniden boyutlandırarak VOI'yi hareket ettirin. Alternatif olarak, Boyut alanlarını sayısal olarak ayarlayın.
    6. Tüm anatomilerin VOI kutusunda yakalandığından emin olmak için görüntünün altındaki kaydırma çubuğunu kullanarak numuneden geçirin. Yönü değiştirmek için yazılımın sol üst köşesindeki XY, XZ veya YZ'ye tıklayın.
    7. Değerlendirmeyi Başlat'ı seçin. Görev Değerlendirme komut dosyasına bağlı olarak, bu, karşılık gelen bir .txt başlık dosyasına sahip bir 3B .aim görüntü dosyası oluşturur. Ek olarak, komut dosyasında görüntüyü belirli bir konuma Dosya Aktarım Protokolü (FTP) için bir yol belirtilebilir.

4. Görüntü işleme

  1. Görüntüleri görüntü işleme yazılımında açın.
    NOT: Görüntü işleme, çeşitli yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu protokol, alanda yaygın olarak kabul gören ve temel ve gelişmiş işleme için çok yönlü araçlara sahip olan ticari bir yazılımdaki temel adımları içerir. Ek olarak, yeniden yapılandırılmış mikro-BT görüntüleri için kabul edilebilir farklı formatlar vardır. Bu özellik genellikle satın alma için kullanılan ekipmana ve yazılımına bağlıdır. Burada .bmp görüntüleri ile görüntü işleme gerçekleştirilir. Aynı prosedür .tiff görüntüler ve diğer türler için de uygulanabilir. Alım, varsayılan biçim olarak .aim olan bir tarayıcıda gerçekleştirildiğinden, ilk olarak .aim'den .bmp'e bir dönüşüm sunulur.
    1. .aim dosyalarını açmak için Dosya > Veri Aç'ı seçin ve dosyayı seçin. Bundan sonra, Dosya Biçimi Seçimi başlıklı bir pencere açılacaktır. Ham Veriler'i seçin.
    2. Ham Veri Parametreleri başlıklı bir pencere açılacaktır. Bu pencerede, her .aim dosyası için oluşturulan başlık .txt dosyasındaki bilgileri izleyerek parametreleri doldurun. Veri Türü için, Görüntü verileri bayt uzaklığında başladıktan sonraki sayıyla tamamlanan başlık için 16 bit'i seçin. Ayrıca, başlık .txt dosyasındaki bilgileri kullanarak boyutları ve voksel boyutunu ayarlayın. Parametreler tamamlandıktan sonra Tamam'a basın.
    3. .aim öğesinden .bmp dönüştürme gerekiyorsa, Ana Panel > Proje Görünümü'nde .aim nesnesine sağ tıklayın ve Görüntü Türünü Dönüştür > Dönüştür seçeneğini belirleyin. Özellikler'de, Çıktı Türü olarak 8 bit'i seçin. Uygula'yı seçin.
    4. Yeni 8 bitlik nesneye sağ tıklayın. Farklı kaydet'i seçin. .bmp seçin ve kaydedin.
    5. .bmp dosyasını açmak için Dosya > Veri Aç'ı seçin ve dosyayı seçin. Bundan sonra, görüntünün parametrelerini içeren bir pencere açılır. Parametreleri onaylayın ve doğruysa kabul edin.
    6. Ana Panel > Proje Görünümü'nde, .bmp dosyalarının adıyla yeni bir nesne oluşturulur. Bu nesneye sağ tıklayın ve Orto Dilim seçeneğini seçin. Özellikler'de, görmek için dilim numarasını ve yönlendirme düzlemini seçin.
  2. Tüm kafanın 3D hacimlerini elde edin.
    1. Ana Panel > Proje Görünümü'nde, görüntü nesnesini sağ tıklatın. Oluştur'> Etkileşimli Eşikleme seçeneğini belirleyin. Özellikler'de, görüntünün hayvanın kafasına karşılık gelen kısmı seçilene kadar Minimum RGB ve Maksimum RGB değerlerini değiştirin. Uygula'yı seçin.
    2. Ana Panel > Proje Görünümü'nde eşikli bir nesne oluşturulur. Bu nesneye sağ tıklayın ve Özellikler'de Isosurface'i seçin. Özellikler'de, yüzeyi görselleştirmek için bir eşik seçin ve Uygula'yı tıklatın. Bu eşiğin ampirik olarak seçilmesi gerekir, daha sonra farklı değerlerin incelenmesi gerekebilir.
  3. Nokta koordinatlarının sayısallaştırılması
    1. 3B nokta koordinatları hem dilimlere hem de çıkarılan yüzeylere göre sayısallaştırılabilir. İlk seçenek için, görüntü seçeneğine sağ tıklayın ve Dilim'i seçin. Çevir'de, eksenel düzlemde istediğiniz dilimi seçin. Düzlem doğru yerleştirilmemişse, doğru yönlendirmeyi oluşturmak için Özellikler'de Seçenekler'i > Döndür'ü tıklatın.
    2. Yer işaretlerini sayısallaştırmak için Ana Panel'de Proje Görünümü'> sağ tıklatın ve Noktalar ve Çizgiler > Yer İşaretleri > Nesne Oluştur'u seçin. Yeni Nesne Yer İşaretleri'ne sağ tıklayın ve Yer İşareti Görünümü'nü seçin. Yer İşareti Görünümü'nde, Boyut'taki noktanın boyutunu değiştirin. Özellikler'de yer işaretleri eklemek için, Düzenleme Modunda Ekle seçeneğini kullanın.
      NOT: Yenidoğanlar için, beynin eksenel ve sagital eğrileri etrafında bir dizi yer işareti ve yarı yer işareti daha önce yayınlanmıştı14.
    3. İlk olarak, koku soğancıklarının en rostral noktasını ve korteksin en kuyruk noktasını geçen eksenel düzlemi seçin.
    4. Nesne Yer İşaretleri'ni seçin ve Özellikler'de Yer İşareti Düzenleyicisi'ni seçin. Oku kullanarak, noktanın sayısallaştırılacağı yere tıklayın.
    5. Önerilen yer işaretleri kümesinde, seçilen eksenel düzlemde 24 nokta sayısallaştırılmıştır. Beynin orta hattaki en kaudal noktasındaki ilkini sayısallaştırın.
    6. Orta beyin ve korteks arasındaki kesişme noktasındaki bir sonraki dönüm noktasına kadar eğri etrafında eşit olarak dağılmış beş noktayı (yarı yer işaretleri) sayısallaştırın.
    7. Ardından, korteksin etrafındaki sekiz noktayı (yarı yer işaretleri) sayısallaştırın.
    8. Korteks ve koku ampulleri arasındaki kesişme noktasında yeni bir dönüm noktasını dijitalleştirin. Ardından, koku ampullerinin etrafındaki dört noktayı (yarı yer işaretleri) sayısallaştırın.
    9. Orta hattaki koku ampullerinin en önemli noktasında yeni bir dönüm noktasını dijitalleştirin. Ardından, her iki koku ampulü arasındaki iki noktayı (yarı yer işaretleri) sayısallaştırın.
    10. Orta hattaki koku ampullerinin en kuyruk noktasında yeni bir dönüm noktasını dijitalleştirin.
    11. Sagital noktalar için, beynin sağ tarafında, beynin kaudal olarak en belirgin olduğu parasagital düzlemde bir dilim oluşturun.
    12. Önerilen yer işaretleri kümesinde, seçilen parasagital düzlemde 33 nokta sayısallaştırılmıştır. Diensefalon ve arka beyin arasındaki kesişme noktasında ilkini sayısallaştırın. Ardından, beynin ventral sınırındaki dokuz noktayı (yarı yer işaretleri) sayısallaştırın.
    13. Koku soğancığının en önemli noktasında yeni bir dönüm noktasını dijitalleştirin. Ardından, koku ampullerinin etrafındaki üç noktayı (yarı yer işaretleri) sayısallaştırın.
    14. Koku ampulü ve korteks arasındaki kesişme noktasında yeni bir dönüm noktasını dijitalleştirin. Ardından, koku ampullerinin etrafındaki üç noktayı (yarı yer işaretleri) sayısallaştırın.
    15. Koku ampulü ve korteks arasındaki kesişme noktasında yeni bir dönüm noktasını dijitalleştirin. Ardından, korteksin etrafındaki yedi noktayı (yarı yer işaretleri) sayısallaştırın.
    16. Korteks ve orta beyin arasındaki kesişme noktasında yeni bir dönüm noktasını dijitalleştirin. Ardından, korteksin etrafındaki yedi noktayı (yarı yer işaretleri) sayısallaştırın.
    17. Korteks ve orta beyin arasındaki kesişme noktasında yeni bir dönüm noktasını dijitalleştirin. Ardından, orta beynin etrafındaki altı noktayı (yarı yer işaretleri) sayısallaştırın.
    18. Orta beyin ve beyincik arasındaki kesişme noktasında yeni bir dönüm noktasını dijitalleştirin. Ardından, beyincik etrafındaki iki noktayı (yarı yer işaretleri) sayısallaştırın.
    19. Beyincik ve arka beyin arasındaki kesişme noktasında yeni bir dönüm noktasını dijitalleştirin.
    20. Sayısallaştırılmış noktaları kaydedin. Nesne Yer İşaretleri'ne sağ tıklayın ve Verileri Kaydet seçeneğini seçin.
  4. Nokta koordinatlarını analiz edin.
    NOT: Bir dizi örnek için nokta koordinatları sayısallaştırıldıktan sonra, boyut (merkez boyutu) ve şekil değişkenlerini (şekil veya Procrustes koordinatları) elde etmek için geometrik morfometri araçları kullanılarak temel analizler yapılabilir. Analizler, özellikle istatistiksel analizler için uygun olan ücretsiz bir açık yazılım ortamında gerçekleştirilir.
    1. Bir not defteri kullanarak, sayısallaştırılmış tüm örneklerin koordinatlarını içeren bir dosya oluşturun. Bu amaçla, https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm'da açıklandığı gibi TPS biçimini izleyin.
    2. İstatistik yazılımını açın. .tps dosyasının kaydedildiği dizini seçmek için Dosya > Dizini Değiştir'i seçin .
    3. Paketler > Paketleri yükle'yi seçin. Bir Cran Aynası seçin. Geomorph'u arayın ve kurun.
    4. Konsola şunu yazarak paketleri yükleyin: library(geomorph) ve library(Morpho).
    5. Konsola şunu yazarak veri kümesini yükleyin: dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID").
    6. Konsola şunu yazarak genelleştirilmiş Procrustes analizi gerçekleştirin: GPA<- gpagen(dataset).
    7. Konsola yazarak centroid boyutunu elde edin: CS<-GPA$Csize.
    8. Konsola şunu yazarak Procrustes koordinatlarını alın: ProcCoord<- GPA$coords.
    9. Konsola şunu yazarak Procrustes koordinatlarını ve ortalama şekli çizin: plotAllSpecimens(ProcCoord).
  5. Yatırım Getirilerinin Segmentasyonu
    NOT: Beyni bölümlere ayırmak ve 3D rekonstrüksiyon elde etmek için, her dilimdeki beyin dokularını manuel olarak tanımlayın. Aynı prosedür, koku ampulleri, korteks vb. gibi belirli ROI'lere de uygulanabilir.
    1. Ana Panel'e > Proje Görünümü'ne sağ tıklayın ve Nesne Oluştur > Etiket Alanı'nı seçin.
    2. Etiket Alanı nesnesini seçerek, Özellikler'de Segmentasyon Düzenleyicisi seçeneğine basın.
    3. Malzemeler'de yeni bir malzeme ekleyin ve isterseniz Beyin olarak yeniden adlandırın.
    4. Seçim'de, her dilimde beyne karşılık gelen dokuyu bölümlere ayırmak için Geçerli Dilim seçeneğini seçin.
    5. Araçlar'da bulunan seçenekleri kullanarak, her dilimdeki beyin dokusunu seçin. Bu durumda Sihirli Değnek ve Fırça en uygun olanlardır.
    6. Her dilimde seçim yapıldıktan sonra, Seçime Ekle'ye basın.
    7. Tüm dilimlerde seçim bittiğinde, Ana Panel'deki Proje Görünümü'ne dönün ve Yüzey Oluştur'u seçmek için Etiket Alanı'na sağ tıklayın ve ardından Uygula'ya tıklayın.
    8. Yüzey elde edildikten sonra, Yüzeyi Çıkar uygulayarak dışa aktarın.
    9. Parçalı yapıların hacmini elde etmek için, Ana Panel'de > Proje Görünümü'nde, etiketi içeren nesneyi seçin, sağ tıklatın ve Hacim Kesiri'> Ölç ve Analiz Et'i seçin. Ardından, Uygula'yı tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada, yenidoğan fare beyinlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için temel bir protokol sunulmaktadır. Lugol'un çözeltisine daldırıldıktan sonra kafalar tarandı. Küçük boyutlarına rağmen, koku soğancıkları, korteks, orta beyin, beyincik ve arka beyin gibi ana beyin anatomik yapıları ayırt edilebilir (Şekil 1).

Bu görüntüler girdi olarak kullanılarak farklı analizler yapılabilir. İki farklı anatomik düzlemde bir dizi yer işareti ve yarı yer işareti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, mikro-BT kullanarak farelerin yenidoğan beyin dokularını kontrast madde ile taramak için özlü bir protokol tanıtılmıştır. Ek olarak, nicel ve nitel çıktılar elde etmek için basit prosedürler içerir. Bu yöntemlere dayanarak, daha fazla alternatif veya tamamlayıcı analiz yapılabilir.

Protokolde gösterildiği gibi, mikro-BT görüntüleri farklı şekillerde analiz edilebilir. Önceki çalışmalarda grubumuz, noktaların koordinatlarını sayısallaştırarak ve geometrik morfometrik teknikler uyg...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Wei Liu'ya teknik yardımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma ANPCyT PICT 2017-2497 ve PICT 2018-4113 tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
  &mikro; CT 35Scanco Medical AGScanco'nun   µ Artık CT 35. En küçük tarayıcıları artık  &mikro; CT 45 
AvizoGörselleştirme Bilimleri Grubu, VSG
C57BL / 6 FarelerBioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Konik tüplerDaiggerCH-CI4610-1856
Akı dolabıEscoAC2-458 
Cam beher GlasscoGL-229.202.10
Cam şişeSimaxCFB017
Cam huniHDAVI1108
HClCarlo Erba403872Bir akı kabini altında manipüle edin ve kişisel koruyucu ekipman kullanın (maske, cam ve eldiven)
I2Cicarelli804211I2KI hazırlarken, bir akı kabini altında manipüle edin ve kişisel koruyucu ekipman (maske, cam ve eldiven) kullanın
<CicarelliPA131542.1210Isub>2KI hazırlarken, bir akı kabini altında manipüle edin ve kişisel koruyucu ekipman (maske, cam ve eldiven) kullanın)
Manyetik karıştırmaArcano4925
NaOHCicarelli1580110Bir akı kabini altında manipüle edin ve kişisel koruyucu ekipman kullanın (maske, cam ve eldiven)
Orbital çalkalayıcıBiomintBM021
Paraformaldehit Biopack2000959400Bir akı dolabı altında manipüle edin ve kişisel koruyucu ekipman kullanın (maske, cam ve eldiven)
Paton spatulaGlasscoGL-377.303.01
PBSBiopack2000988800
Plastik Pastör pipetiDaigger9153
R R ProjesiR için paket jeomorfu protokolde kullanıldı (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Makas Belmed
Sodyum azidBiopack2000163500
TermometreDaigger7650

Kaynaklar

  1. Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
  2. Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660(2021).
  3. Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
  4. Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
  5. de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  6. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  7. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  8. Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227(2016).
  9. Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
  10. Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
  11. Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974(2015).
  12. Gignac, P. M., O'Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
  13. Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321(2013).
  14. Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
  15. Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184(2022).
  16. Turnbull, D. H., Mori, S. MRI in mouse developmental biology. NMR in Biomedicine. 20 (3), 265-274 (2007).
  17. Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615(2018).
  18. Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
  19. Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
  20. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  21. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  22. Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol's solution. Scientific Reports. 11, 19781(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fare Neonatal BeyniBeyin SegmentasyonuLugol zeltisi3B Beyin Rekonstr ksiyonuKontrast Madde G r nt lemeBeyin MorfolojisiG r nt lemeGeli imsel N rog r nt leme
Fare Yenidoğan Beyinlerinin Mikro-BT Görüntüleme ve Morfometrik Analizi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.