Yöntem makalesi

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

DOI:

10.3791/65181

⸱

21 Nisan 2023

 ,  , 
1Chinese Institute for Brain Research

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm omurgalılarda evrimsel olarak korunmuş bir orta beyin yapısı olan superior colliculus (SC), serebral korteksin ortaya çıkmasından önceki en karmaşık görsel merkezdir. Her biri belirli bir görsel özelliği kodlayan ~30 tip retinal ganglion hücresinden (RGC'ler) doğrudan girdiler alır. SC'nin sadece retinal özellikleri miras alıp almadığı veya SC'de ek ve potansiyel olarak de novo işlemenin meydana gelip gelmediği belirsizliğini koruyor. SC'deki görsel bilginin nöral kodlamasını ortaya çıkarmak için, burada uyanık farelerde iki tamamlayıcı yöntemle görsel yanıtları optik olarak kaydetmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bir yöntem, üst üste binen korteksi kesmeden tek hücre çözünürlüğünde kalsiyum aktivitesini görüntülemek için iki foton mikroskobu kullanırken, diğeri korteksi büyük ölçüde gelişmemiş bir mutant farenin tüm SC'sini görüntülemek için geniş alan mikroskobu kullanır. Bu protokol, hayvan hazırlama, viral enjeksiyon, başlık plakası implantasyonu, fiş implantasyonu, veri toplama ve veri analizi dahil olmak üzere bu iki yöntemi detaylandırır. Temsili sonuçlar, iki fotonlu kalsiyum görüntülemenin, tek hücre çözünürlüğünde görsel olarak uyarılmış nöronal tepkileri ortaya çıkardığını ve geniş alanlı kalsiyum görüntülemenin tüm SC boyunca nöral aktiviteyi ortaya çıkardığını göstermektedir. Bu iki yöntem birleştirilerek SK'deki nöral kodlama farklı ölçeklerde ortaya çıkarılabilir ve bu kombinasyon beynin diğer bölgelerine de uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Superior colliculus (SC) tüm omurgalılarda önemli bir görme merkezidir. Memelilerde, retinadan ve görsel kortekstendoğrudan girdi alır 1. Optik kayıt, korteks 2,3,4,5'e yaygın olarak uygulanırken, SC'deki uygulaması zayıf optik erişimler tarafından engellenmektedir 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. Bu protokolün amacı, SC'deki nöral aktivitenin optik kaydı için iki tamamlayıcı yöntem hakkında ayrıntılı bilgi sağlamaktır.

SC, kolliküler nöronlara optik erişimi sınırlayan korteks ve transvers sinüsün altında bulunur. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için bir yaklaşım, üst üste binen korteksi aspire etmek ve ön-lateral SC 7,9,10,13,14,19'u ortaya çıkarmaktır. Bununla birlikte, SC kortikal girdiler aldığından, böyle bir işlem SC nöronlarının görsel uyaranlara nasıl tepki verdiğini etkileyebilir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, korteksi sağlam bırakırken posterior-medial SC'nin yüzeysel tabakasını silikon bir tıkaç ile görüntülemek için alternatif bir protokolü burada detaylandırıyoruz 8,11. Spesifik olarak, tek hücreli çözünürlük elde etmek için, vahşi tip farelerin posterior-medial SC'sindeki kalsiyum tepkilerini görüntülemek için iki foton mikroskobu uyguladık. Ek olarak, geniş kapsama alanı elde etmek için, posterior korteksigelişmemiş bir mutant farenin tüm SC'sini görüntülemek için geniş alan mikroskobu uyguladık 20.

Bu protokolde açıklanan iki yöntem birbirini tamamlayıcı niteliktedir. Korteks kesilmeden iki fotonlu kalsiyum görüntüleme, sağlam kortikal girdilerle tek hücre çözünürlüğünde nöral aktiviteyi kaydetmek için uygundur. Geniş alanlı kalsiyum görüntüleme, uzamsal çözünürlükten ödün verirken tüm SC'deki nöral aktiviteyi kaydetmek için uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel prosedürler hayvan refahı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi ve Pekin'deki Çin Beyin Araştırmaları Enstitüsü'ndeki IACUC tarafından onaylandı.

NOT: Bu protokolün zaman çizelgesi aşağıdaki gibidir: 1) vantuzu yapın; 2) virüsü enjekte etmek; 3) kafa plakasını implante edin; 4) 3 hafta sonra, fişi implante edin; 5) Koşu bandında ~ 3 günlük bir iyileşme ve alışkanlıktan sonra, iki foton / geniş alan görüntüleme yapın.

1. Vantuz hazırlanması (Şekil 1A)

  1. Akrilik bir tabağa bir damla fosfat tamponlu salin (PBS, 1x) koyun ve ucu kılcallık ile doldurmak için 21 G düz bir iğne ile dokunun.
  2. İğnenin ucunu yarı saydam bir silikon yapıştırıcı ile kapatın ve yaklaşık ~10 dakika bekletin.
  3. Silikon yapıştırıcıyı makasla ~2 mm çapında bir diske kesin.

2. Fişlerin hazırlanması (Şekil 1B)

  1. 0,75 mm kalınlığında bir plastik şim stoğu hazırlayın ve ortasından 1 cm x 1 cm'lik bir kare kesin. İki akrilik blok hazırlayın. Şim stoğunu ve akrilik blokları alkolle temizleyin ve lens kağıdı ile silin.





  2. figure-protocol-1

  4. figure-protocol-2


Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1A,B, sırasıyla vantuz ve tapaların nasıl yapılacağını göstermektedir. Şekil 2 , fişin nasıl başarılı bir şekilde implante edileceğini göstermektedir. Tıkaç implante edildikten sonra, Şekil 2D'de gösterildiği gibi posterior-medial SC ortaya çıkar. Şekil 3 , iki foton mikroskobu kullanılarak görüntülenen örnek bir vahşi tip fareden SC nöronlarının kalsiyum tepkilerini göstermektedi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoldeki kritik adımlar
En kritik adım, 5.2 ve 5.3 adımlarındaki kraniyotomidir. İlk olarak, lambdanın 0,5 mm arkasındaki kemik kalındır ve içinde kan damarları vardır, bu da delme işlemi sırasında kanamaya neden olabilir. Kanamayı durdurmak için yeterli jel köpük hazırlanmalıdır. İkincisi, transvers sinüsün hemen üzerindeki kemiği çıkarırken iyi bir anjiorreksi olasılığı vardır. Sorun giderme için alternatif bir yaklaşım, ovalin içindeki kemiği inceltmek ve parça parça çıkarmaktır. Diğer bir püf ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32271060) tarafından desteklenmektedir. Y.-t.L. araştırmayı tasarladı, deneyi gerçekleştirdi, verileri analiz etti ve makaleyi yazdı. Deneyi Z.L. ve R.W. gerçekleştirdi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
16x objektifNikon
50 mm lensComputarM5018-MP2
5 mm lamelWarner instrumentsCS-5R
bant geçiren filtreChroma TechnologyHQ575/250 m-2p
butil siyanoakrilatVetbond, World Precision Instruments
göz bebeğini izlemek için kameraFLIRBFS-U3-04S2M-CS
kameraBasleracA2000-165 ve mikro; m
korona işleyiciElektro-Teknik ÜrünlerBD-20AC
dikroikRenk TeknolojisiT600 / 200dcrb ve nbsp;
galvanometrelerCambridge Technology
cam boncuk sterilizatörüRWDRS1502
mikromatkapRWD78001
mikromanipülatörSutter InstrumentsQUAD
fotoçoğaltıcı tüpHamamatsuR3896
rotorlu kodlayıcıUSdigitalMA3-A10-125-N
Kendiliğinden Kürlenen Diş Yapıştırıcı Reçine Çimentosu & nbsp;Süper Tahvil C & B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japonya
termostatik ısıtma yastığı ve nbsp;RWD69020
Ti: Safir lazerSpectra-PhysicsMai Tai HP DeepSee
yarı saydam silikon yapıştırıcı Kwik-Sil, Dünya Hassas Aletler koşu bandı
Xinglin Biyoloji
Virüs Suşları/
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6mVektör Çekirdeği, Çin Beyin Araştırmaları Enstitüsü, Pekin
Hayvanlar
C57BL/6J vahşi tipÇin Beyin Araştırmaları Enstitüsü'ndeki Laboratuvar Hayvanları Kaynak Merkezi, Pekin
Emx1-CreJackson Laboratuvarı 5628
Pals1flox/wtChristopher A. Walsh Lab
Software
ImageJNIH Image
LabviewUlusal Aletler
MATLABMatematik Çalışmaları
Geniş alan görüntüleme için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
  4. Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
  5. de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
  6. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
  7. Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
  8. Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
  9. Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773(2015).
  10. de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
  11. Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
  12. Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
  13. Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
  14. Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261(2018).
  15. Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
  16. Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
  17. Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
  18. Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
  19. Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
  20. Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
  21. Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80(2014).
  22. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
  23. Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
  24. Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
  25. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  26. Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Two Photon MicroscopyWidefield MicroscopyNeural CodingVisual ProcessingRetinal Ganglion CellsHeadplate ImplantationViral InjectionMouse Brain Imaging

İlgili makaleler