Civciv Embriyo Beynini, İnsan Glioblastoma Hücre Davranışının In Vivo ve Ex Vivo Analizleri için Bir Model Olarak Kullanma

Özet

Civciv embriyoları, insan glioblastoma (GBM) beyin tümörlerini ovo ve in vivo beyin dilimi ko-kültürlerinde incelemek için kullanılır. GBM hücre davranışı, ex vivo ko-kültürlerde hızlandırılmış mikroskopi ile kaydedilebilir ve her iki preparat da deneysel son noktada ayrıntılı 3D konfokal analiz ile analiz edilebilir.

Özet

Civciv embriyosu, omurgalı gelişiminin incelenmesi için, özellikle deneysel manipülasyonlar için ideal bir model sistem olmuştur. Civciv embriyosunun kullanımı, insan glioblastoma (GBM) beyin tümörlerinin in vivo oluşumunu ve tümör hücrelerinin çevreleyen beyin dokusuna invazivliğini incelemek için genişletilmiştir. GBM tümörleri, floresan olarak etiketlenmiş hücrelerin bir süspansiyonunun ovodaki E5 orta beyin (optik tektum) ventrikülüne enjekte edilmesiyle oluşturulabilir.

GBM hücrelerine bağlı olarak, kompakt tümörler ventrikülde ve beyin duvarında rastgele oluşur ve hücre grupları beyin duvarı dokusunu istila eder. Tümörlü sabit E15 tektasının kalın doku kesitleri (350 μm), konfokal z-stack görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu ile analiz edildiğinde istilacı hücrelerin sıklıkla kan damarları boyunca göç ettiğini ortaya çıkarmak için immünoboya ile boyanabilir. Canlı E15 orta beyin ve ön beyin dilimleri (250-350 μm), floresan olarak etiketlenmiş GBM hücrelerinin, yaklaşık 1 haftalık bir süre boyunca kan damarları boyunca da meydana gelebilen hücre invazyonunu analiz etmek için ex vivo ko-kültürler sağlamak için rastgele olmayan yerlere sokulabileceği membran ekleri üzerinde kültürlenebilir. Bu ex vivo ko-kültürler, canlı hücre davranışını gözlemlemek için geniş alan veya konfokal floresan hızlandırılmış mikroskopi ile izlenebilir.

Ko-kültürlü dilimler daha sonra sabitlenebilir, immünoboyalı olabilir ve istilanın kan damarları veya aksonlar boyunca gerçekleşip gerçekleşmediğini belirlemek için konfokal mikroskopi ile analiz edilebilir. Ek olarak, ko-kültür sistemi, farklı hücre tiplerinin ve renklerinin agregalarını farklı hassas yerlere yerleştirerek ve hücre hareketlerini gözlemleyerek potansiyel hücre-hücre etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir. İlaç tedavileri ex vivo kültürlerde yapılabilirken, bu tedaviler in ovo sistemi ile uyumlu değildir. Bu iki tamamlayıcı yaklaşım, yüksek oranda manipüle edilebilir omurgalı beyin ortamında insan GBM hücre davranışının ve tümör oluşumunun ayrıntılı ve kesin analizlerine izin verir.

Giriş

Kanser hücresi davranışlarının in vitro çalışmaları, in vivo ksenogreft modellerinde tümör oluşumu ve hücre invazyonu sırasında gözlenen daha karmaşık davranış sırasında çalışan potansiyel mekanizmaları incelemek için sıklıkla kullanılır. Örneğin, glioblastoma (GBM) ile, in vitro çalışmalar, L1CAM'in yeni bir civciv embriyo ksenograft beyin tümörü modeli 1,2,3,4,5'te tümör oluşumu ve beyin invazyonu sırasında potansiyel olarak nasıl çalıştığına dair mekanizmaları ortaya çıkarmıştır. İn vitro ve in vivo deneyler birbirlerini yararlı şekillerde tamamlasalar da, sonuçların nasıl ilişkilendirilebileceği konusunda önemli bir boşluk bırakırlar. Örneğin, bir çanaktaki GBM hücre hareketliliğinin mekanik analizleri oldukça yapay bir durumdur ve in vivo ksenogreft modelleri sadece tümör oluşumu ve hücre davranışının statik zaman noktası veya bitiş noktası analizlerini ortaya çıkarabilir. Kemirgenleri veya civciv embriyolarını kullanan in vivo çalışmalar, hücreler bu ksenogreft modellerinde beyin dokusunu istila ederken, hücre davranışını izlemek için kendilerini kolayca ödünç vermezler. Bununla birlikte, civciv embriyo ksenogreft modeli, yapışma proteini L1CAM'in insan T98G GBM hücrelerinin ^2,5 invaziv yeteneğinde uyarıcı bir rol oynadığını göstermiştir.

Bu soruna uygun bir çözüme, ex vivo model olarak adlandırılan organotipik bir beyin dilimi kültür modeli kullanılarak hem in vivo hem de in vitro yöntemlerle köprü kurularak ulaşılabilir. Bu ex vivo modelde, canlı beyin dokusu birkaç haftaya kadar birkaç yüz mikron kalınlığında tutulabilir, bu da kanser hücrelerinin implante edilmesini, zaman içinde gerçek dokudaki davranışlarını gözlemlemeyi ve daha sonra deneyin sonunda daha ayrıntılı bir belirteç analizi yapmayı mümkün kılar.

Popüler bir organotipik dilim kültürü yöntemi, yarı saydam veya şeffaf gözenekli bir zarın üzerine birkaç yüz mikron kalınlığında bir beyin dilimini kültürlemek, dokuyu havaya maruz bırakmak, ancak besin ortamının dokuyu zarın altından sürdürmesine izin vermek olmuştur (Stoppini ve ^ark.6'ya bakınız). Bu yöntemin farklı varyasyonları, farklı ortamlar veya farklı membran ekleri kullanmak da dahil olmak üzere farklı çalışmalar için kullanılmıştır. Farklı membran uçları arasında 30 mm çapında, 35 mm kültür kabında gözenekli (0,4 μm) membran kesici uç 6 ve 6 delikli plakalar için hücre kültürü ekleri (0,4 μm) bulunur⁷. Farklı ortamlar arasında% 50 MEM / HEPES +% 25 ısı ile inaktive edilmiş at serumu +% 25 Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS)⁸,% 50 azaltılmış serum ortamı +% 25 at serumu +% 25 HBSS⁹ ve diğerleri bulunur. Floresan olarak etiketlenmiş GBM hücreleri ile birlikte yarı saydam veya şeffaf bir membran kullanılırsa, bu tür kültürler ters çevrilmiş bir geniş alan veya konfokal floresan mikroskobu 10,11,12,13,14,15 kullanılarak aşağıdan görüntülenebilir.

Kemirgenler kullanılarak birçok in vivo ortotopik beyin tümörü ksenogreft ve ex vivo organotipik beyin dilimi kültürü modeli kurulmuş olsa da, yukarıda belirtildiği gibi, civciv embriyosu (Gallus gallus) bu amaçlar için yeterince kullanılmamıştır. Bununla birlikte, civciv embriyosunun hem insan hem de sıçan glioma invazyonu ^1,2,5 çalışması için in vivo ortotopik bir ksenogreft modeli olarak kullanılabileceği gösterilmiştir. Civciv embriyo beyinlerine ksenograflanmış hücreler, kemirgen modellerinde gözlemlenenlere benzer istila paternleri sergilemiş ve civciv embriyolarının GBM tümör hücresi analizi için in vivo bir model olarak kullanılmasını daha da desteklemiştir. Civciv embriyoları da ucuzdur, kemirgenlerden daha kolay korunabilir (yani, bir laboratuar inkübatöründeki yumurta kabuklarında) ve çalışması çok daha kolaydır, bu da onları kısa süreli in vivo GBM çalışmaları için çekici bir seçenek haline getirir. Yakın tarihli bir makale, dilimlerin en az 7 gün boyunca canlı olduğu normal beyin gelişimi sırasında aksonların oluşumu ve büyümesi için civciv embriyosu beyin dilimi kültürlerinin kullanımını açıklamıştır¹⁶. Bununla birlikte, bu tür civciv embriyo beyin dilimi kültürlerinin bir doku ortamında GBM hücre davranışının ex vivo analizi için kullanılması eksiktir. Bu makalede, hem insan GBM hücrelerinin hem de GBM kök hücrelerinin (GSC'ler) erken civciv embriyo beynine in vivo transplantasyonu ve GBM hücrelerinin canlı civciv embriyo beyin dilimi kültürlerine ex vivo olarak sokulması anlatılmaktadır. Ortaya çıkan tümörlerin bazı temsili örnekleri ve bu preparatlardan elde edilen hücre invazyon paternleri de verilmektedir.

Protokol

Bu çalışmayı yürütmek için Delaware Üniversitesi'nde herhangi bir izin veya onay gerekmemiştir.

1. Civciv optik tektumuna GBM hücre enjeksiyonu

1. GSC'lerin ve GBM hücrelerinin enjeksiyon için hazırlanması
   1. GSC ortamında kültür GSC'leri (Tablo 1). Kültür, GBM ortamında GBM hücre hatları oluşturmuştur (Tablo 1).
   2. Hücreleri steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile plakalar üzerinde durulayın ve 10 cm'lik bir kaba 1 mL tripsin çözeltisi yerleştirin. Hücreler ayrılmaya başlayana kadar bir hücre kültürü inkübatöründe 2-3 dakika bekletin.
   3. 10 cm'lik kalıba 10 mL uygun serum içeren kültür ortamı ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ayırın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
   4. Hücreleri 800 × g'da santrifüjleme ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca pelet haline getirin.
   5. Bir yan kol şişesine ve vakum pompasına tutturulmuş tek kullanımlık ince cam pipet kullanarak ortamı hücre peletinden aspire edin. Hücreleri uygun büyüme ortamında, mikrolitre başına 10.000 hücrelik bir konsantrasyona yeniden askıya alın ve bir mikrofüj tüpüne veya buz üzerindeki küçük vidalı tüpe yerleştirin.
   6. Hücreleri az miktarda steril% 1 Hızlı Yeşil FCF boyası ile karıştırın (5 μL boya / 100 μL hücre süspansiyonu oranı kullanın).
2. GBM hücrelerinin ovo'da E5 optik tektuma enjeksiyonu. Ek Şekil 1'e bakınız.
   1. Döllenmiş tavuk yumurtalarını nemlendirilmiş bir yumurta inkübatöründe, sivri ucu aşağı bakacak şekilde, 37.5 ° C'de ( inkübasyonun 1. günü embriyonik gün 0 [E0]) inkübe edin. Kuluçkanın 6. gününde (E5), yumurta kabuğunu% 70 etanol ile püskürterek sterilize edin.
   2. Bir yumurta mumcusu kullanarak, embriyonun üzerindeki hava boşluğunun çevresi boyunca bir kalemle iz bırakın ve ana hatlarıyla belirtilen alanı şeffaf bantla örtün.
   3. Kavisli makas kullanarak, izlenen alanın etrafını hafifçe kesin, embriyonik zarlara veya kan damarlarına kesmemeye dikkat edin ve yumurta kabuğunun üstünü atın.
   4. Hava boşluğu zarına birkaç damla salin veya hücre kültürü ortamı yerleştirin, böylece kolayca ayrılacaktır. İnce forseps kullanarak, hava boşluğu zarını embriyonun tepesine dikkatlice delin, çıkarın ve civciv embriyosunun kafasını bulun.
   5. Optik tektuma hücreler enjekte edilebilmesi için kafayı konumlandırmak üzere embriyoyu hemen çevreleyen şeffaf amniyon zarını kapmak için ince forseps kullanın. Bir elinizle, enjeksiyon işlemi sırasında kafayı yerinde tutmak için amniyonu tutmak için ince forsepsleri kullanın. Yumurta sarısı üzerindeki koryoallantoik membrandaki ekstraembriyonik kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin.
      NOT: Yukarıdaki prosedür, embriyoyu yakından çevreleyen berrak amniyon zarını verimli bir şekilde yakalayabilmek için biraz pratik gerektirir, çünkü yakalanıp çekilene kadar görünmezdir. Embriyoyu hemen çevreleyen berrak amniyonunu yakalamak için ince forseps kullanarak pratik yapın.
   6. Amniyon zarını ince forsepslerle kavrayarak kafayı sabit tutun. Bir cam mikropipet ve pnömatik bir pikopompa kullanarak, optik tektuma 5 μL uygun hücre kültürü ortamında yaklaşık 50.000 hücre enjekte edin (5 μL, doldurulmuş bir mikropipetin yaklaşık 1 / 2'sidir).
      NOT: Boya ile karıştırılmış GBM hücreleri ile enjekte edilen bir E5 embriyosunun görüntüsü için Cretu ve ^ark.1'e bakınız.
   7. Embriyonun üzerine birkaç damla 50 mg/mL ampisilin koyun.
   8. Yumurtaların üstündeki deliği şeffaf bantla örtün ve diseksiyon için E15'e kadar nemlendiricide bırakın.

2. E15 embriyolarından beyin bölgelerinin diseksiyonu

NOT: Fiksasyon için buradaki E15 beyinlerinin diseksiyonu, canlı beyin dilimleri için adım 8.2'de tarif edilene benzer, ancak buradaki diseksiyonun aseptik koşullar altında yapılması gerekmez.

1. Kabuğun üst kısmındaki bandı kesin ve embriyoya erişime izin verin.
2. Embriyonun boynundaki kafasını kesin ve kafayı steril kalsiyum ve magnezyum içermeyen Tyrodes (CMF Tyrode's) çözeltisi ile 10 cm'lik bir kaba yerleştirin. Ek Şekil 2'ye bakınız.
3. İnce forseps kullanarak, altta yatan dura mater ortaya çıkarmak için beyni kaplayan cildi soyun. Beynin sol ve sağ taraflarındaki oluşan kafatası kemiklerini çıkarın. Oluşan kafatası kemikleri henüz beynin çoğunluğunu kapsamaz.
4. Beynin merkezini kaplayan meninksleri yırtmak için yavaşça ince sivri forseps kullanın ve beyni ortaya çıkarmak için her iki tarafa da soyun.
5. Beyni aşağıdan almak ve yavaşça boşluğundan çıkarmak için kavisli forseps kullanın.
6. Beyni parçalarına ayırın: ön beyin, tecta, beyincik.
7. Üstteki pia mater'i ince forseps kullanarak tecta'dan çıkarın. Pia'nın tecta'dan kolayca ayrıldığını, ancak ön beyinden veya beyincikten ayrılmadığını unutmayın. Pia'yı ön beyinden dokunarak veya küçük bir filtre kağıdı parçası üzerinde yuvarlayarak çıkarın.
8. Disseke edilmiş beyin bölgelerini küçük bir kaba yerleştirin.
9. Fiksasyon için beyin bölgelerini 24 delikli bir plaka kuyusuna yerleştirin ve 0.1 M sodyum kokodilat tamponunda% 2 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin. 4 °C'de en az 24 saat bekletin.
10. Fiksasyondan sonra, agar'a gömmeden önce dokuyu en az 1 saat boyunca 3x PBS'de durulayın.

3. Hasat edilen beyin bölgelerinin gömülmesi ve dilimlenmesi

1. PBS'de% 3.5 agar ve% 8 sakkaroz çözeltisini eriyene kadar önceden ısıtın ve erime sıcaklığında tutun.
2. Kavisli forsepsleri bir kepçe olarak kullanarak, civciv embriyo beyninin optik tektumunu veya ön beyin bölgesini yavaşça alın ve agarın dış beyin yüzeyine yapışmasını sağlamak için ekstra sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdına hafifçe lekeleyin.
3. Steril bir transfer pipeti kullanarak, kalıbı agar çözeltisi ile doldurun.
   NOT: Küçük dikdörtgen metal titreşimli doku dilimleyici blokları gibi uygun boyutta bir nesnenin etrafında alüminyum folyo oluşturularak basit bir kalıp yapılabilir.
4. Beyin bölgesini agar'a yerleştirin ve agar'ın tamamen katılaşmasına izin verin.
5. Alüminyum folyoyu gömülü beynin etrafından çıkarın ve bir tıraş bıçağı veya neşter kullanarak yanların etrafındaki fazla agar'ı kesin.
6. Dilimleme tepsisinin paslanmaz çelik karesine bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin, agaroz bloğunu beyinle yapıştırıcının üzerine yerleştirin ve tutkalın 1 dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Tepsiyi titreşimli doku dilimleyici mandren mandren içine yerleştirin, sıkın ve tepsiyi agar bloğunun üstünü örtecek kadar PBS ile doldurun.
7. Beyin dilimlerini titreşimli bir doku dilimleyici üzerinde çelik bir tıraş bıçağı kullanarak 350 μm kalınlığında kesin.
8. Beyin dilimleri kesilip dilimleme tepsisine serbestçe süzülürken, dilimleri tepsiden çıkarmak ve çıkarmak için bir spatula kullanın. Bölümleri yavaşça spatuladan ve PBS ile etiketlenmiş 10 cm'lik bir Petri kabına kaydırın, böylece bölümler serbestçe yüzer.
   NOT: Beyin dilimini çevreleyen agar, beyin gömmeden önce fazla sıvıyı çıkarmak için filtre kağıdı ile yeterince lekelenmemişse ayrılabilir. Bu meydana gelirse, beyin dokusu katılaşmış agardan nazikçe çıkarılabilir ve fazla sıvının uygun şekilde lekelenmesinden sonra yeniden gömülebilir.

4. Tümör hücreleri ile immün boyama beyin dilimleri

1. Epifloresan ile donatılmış bir stereo mikroskop kullanarak, 10 cm'lik çanaktaki bireysel dilimleri tümör hücrelerinin varlığı veya yokluğu için tek tek tarayın.
2. İmmün boyama için yeterli miktarda fosfat tamponlu salin %0.1 Triton X-100 ve %5 normal keçi serumu (PBSTG) (bakınız Tablo 1) ile hazırlanın ve immünoboyalı dilimleri durulayın.
3. PBS ile beyin bölümlerini boyamak için kullanılacak 24 delikli bir plakada kuyuları yarıya indirin.
4. Beyin dilimlerinin etrafındaki agar köşelerini bir spatula veya neşter kenarı ile kesin ve yavaşça PBS içeren kuyucuklara yerleştirin.
5. PBS'yi aspire edin ve PBSTG'de 350 μL primer antikor boyama çözeltisi ile değiştirin (örneğin, PBSTG'de 2 μg / mL UJ127).
6. Soğuk bir odada 24 saat boyunca hafif ajitasyonla inkübe edin, böylece dilimin kuyu içinde serbestçe hareket ettiği görülür.
7. 24 saat sonra, birincil antikor çözeltisini çıkarın ve ajitasyonlu soğuk bir odada PBSTG ile 3 x 1 saat durulayın.
8. Durulama bittiğinde, PBSTG'de 350 μL/kuyucuk sekonder antikor boyama çözeltisinde inkübe edin (örneğin, PBSTG'de biyotin-GAM'ın 1/200 seyreltilmesi). Ajitasyon ile soğuk bir odada 20 saat inkübe edin.
   NOT: Üçüncül adımdan önce geliyorsanız ve bu adımda florokrom içeren ikincil antikor ile inkübe ediliyorsa, inkübasyon sırasında ışıktan korunmak için şimdi örtün ve ardından adım 4.11'e atlayın.
9. İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve PBSTG'de 3 x 1 saatini çalkalama ile soğuk bir odada durulayın.
10. PBSTG'yi çıkarın ve üçüncül çözeltide inkübe edin (örneğin, PBSTG'de Alexa Fluor 647 streptavidin'in 1:250 seyreltilmesi). İstenirse, karışıma 0.1 μg / mL bisbenzimid ekleyerek çekirdekleri bu adımda boyayın. Ajitasyon ile soğuk bir odada 20 saat inkübe edin.
11. Üçüncül çözeltiyi çıkarın ve PBSTG'de 3 x 1 saat boyunca soğuk bir odada ajitasyonla durulayın.
12. Mikroskop kızaklarına monte edilmeye hazır olana kadar PBS'de bırakın.

5. Mikroskop slaytlarına dilimlerin montajı

1. Bağlanacak bölümler olduğu kadar mikroskop slaytı hazırlayın.
2. Her slayt için, bir parafilm parçasının üzerine 10 mil (254 μm) kalınlığında vinil elektrik bandından oluşan 50 mm uzunluğunda bir şerit yerleştirin.
3. 1 cm x 1 cm kare delik delme kullanarak, elektrik bandının ve parafilmin ortasından bir delik açın.
4. Bandı parafilmden çekin ve mikroskop slaydının üzerine yerleştirin, slaytta bant etiketlemek için yer bırakın.
5. Bir mikropipet kullanarak, elektrik bandının ortasındaki kare deliğe bir veya iki damla solmaya karşı montaj ortamı yerleştirin.
6. İstenilen titreşimli doku dilimleyici bölümünü PBSTG'den kaldırmak için kavisli bir spatula kullanın ve temiz bir laboratuvar mendili veya filtre kağıdı parçası ile nemi iyice uzaklaştırın.
7. Dilimin kenarına montaj elemanı damlasına dokunun ve bölümü yavaşça montaj ortamına kaydırmak için başka bir spatula kullanın.
8. Bölümü birkaç damla daha mountant ile örtün ve bölümün ve mountantın üzerine dikkatlice 24 mm x 30 mm (#1,5 kalınlık) bir kapak kayması yerleştirin.
9. Yerinde tutmak için kapak kaymasının kenarlarını oje ile kapatın.

6. Sabit beyin dilimlerinin konfokal mikroskopisi

1. Uygun objektif lens ve filtre setlerini kullanarak monte edilmiş beyin dilimindeki floresan tümörleri bulmak için geniş alan floresansını kullanın.
   NOT: Bazı tümörler oldukça büyük olabilir ve 4x hedefi ile kolayca görülebilirken, tek hücreler 10x hedefi gerektirebilir.
2. Uygun bir objektif lens, lazer(ler), iğne deliği boyutu ve dedektör ayarlarını kullanarak konfokal mikroskopiye geçin. Bu protokolü takip etmek için, rutin görüntüleme için 20x hedefi (sayısal diyafram [N.A.] = 0.75) ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için 60x yağ hedefi (N.A. = 1.40) kullanın.
3. Optik bölümleri elde etmek için z ekseninin üst ve alt sınırlarını ve adım boyutunu (konfokal mikroskop üreticisinin talimatlarına göre özel durum için) ayarlayın. Optik bölümlerden oluşan bir z-yığını edinin.
4. Üreticinin talimatlarına göre, tümörün 3D hacim görüntüsünü oluşturmak için konfokal mikroskop yazılımını kullanın.

7. Küresel preparat

1. Poli(2-hidroksietil metakrilat) (poli-HEMA) plakaların oluşturulması
   1. % 95 etanol içinde 10 μg / mL poli-HEMA çözeltisi oluşturun ve 35 mm Petri kaplarını (veya hücre kültürü kaplarını) bu çözeltinin 1 mL'si ile kaplayın.
   2. Bulaşık yüzeyinin bir kaplamasını geliştirmek için bulaşıkları gece boyunca oda sıcaklığında ortaya çıkarılan bir rocker üzerinde oturtun.
      NOT: Çözücü buharlaşacak ve çanak üzerinde düzensiz görünebilecek yarı saydam bir kaplama bırakacaktır, ancak bu hücre sferoidleri yapma yeteneğini etkilemeyecektir.
   3. Kuruduktan sonra, açık bulaşıkları UV ışığı altında bir biyogüvenlik kabininde 1 saat boyunca sterilize edin. Sterilizasyondan sonra kapakları değiştirin. Kaplamalı tabaklar artık kullanıma hazırdır.
2. Hızlandırılmış mikroskopi için floresan DiD boyama
   NOT: Bu bölüm, canlı hızlandırılmış görüntüleme için hücre hareketliliğinin görselleştirilmesini optimize eden sferoidler yapmak için kullanılacak DiD floresan boya ile tek hücrelerin boyanması içindir.
   1. Hücreleri serumsuz bir kültür ortamında askıya alın.
   2. 5 μL DiD stoğu/mL hücre süspansiyonu ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
   3. Etiketli hücre süspansiyonunu 800 × g'da 5 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   4. Süpernatantı aspire edin ve durulamak için hücreleri sıcak ortamda yeniden askıya alın.
   5. Bu santrifüjleme işlemini tekrarlayın ve adımı iki kez daha durulayın.
      NOT: İsterseniz, bu işlemden hemen sonra küre yapmak için adım 7.3.6'ya atlayın.
3. Hücre sferoidleri yapımı
   1. % 0.25 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisini 37 ° C'ye ısıtın.
   2. GSC media^17'deki kültür GSC'leri (Tablo 1) ve U-118 kültür ortamındaki U-118 malign gloima (MG) hücreleri (bakınız Tablo 1). Bir adet 35 mm'lik sferoid tabağının hazırlanması için 10 cm'lik bir tabak kullanın. GSC'lere başlangıçta ve daha sonra her 3 günde bir bFGF (10 ng / mL nihai konsantrasyon) ve TGF-α (20 ng / mL nihai konsantrasyon) büyüme faktörleri ekleyin.
      NOT: Mevcut çalışmada kullanılan hücreler yeşil GSC15-2 / K72, yeşil GSC16-4 / K72, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry2x ve kırmızı U-118 / 1879 / mCherry2x idi. Bir plaka sferoid, membran ekleri üzerindeki iki adet 6 delikli beyin dilimi plakası için yeterli olmalıdır.
   3. Plakalardaki hücreleri steril PBS ile durulayın ve 10 cm'lik bir tabak üzerine 1 mL tripsin çözeltisi yerleştirin. Hücreler ayrılmaya başlayana kadar hücre kültürü inkübatörüne 2-3 dakika bekletin.
   4. 10 cm'lik kalıba 10 mL uygun serum içeren kültür ortamı ekleyerek tripsini etkisiz hale getirin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri ayırın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne yerleştirin.
   5. Hücreleri 800 × g'da santrifüjleme ile 4 ° C'de 5 dakika boyunca pelet yapın.
   6. Ortamı hücre peletinden aspire edin ve hücreleri 10 mL ortamda yeniden askıya alın.
   7. Her 35 mm'lik poli-HEMA kaplı kabın üzerine 2 mL hücre süspansiyonu yerleştirin ve çanak başına toplam 4 mL ortam elde etmek için 2 mL daha fazla uygun ortam ekleyin. GSC'leri kullanıyorsanız büyüme faktörleri ekleyin.
   8. Agregalar 100-200 μm'lik bir boyuta ulaşana kadar hücreleri bir hücre inkübatöründe inkübe edin, bu da kaplanan hücrelerin yoğunluğuna bağlı olarak 1-2 gün olabilir.

8. Canlı civciv embriyo beyin diseksiyonu ve titreşimli doku dilimleyici dilimleme

1. Diseksiyon için hazırlık
   1. Membran ekinin altında 1 mL beyin dilimi kültür ortamı (bkz. Tablo 1) bulunan 6 kuyucuklu bir polyester membran ekleme plakası hazırlayın.
   2. Çalışma alanını ve aletleri %70 etanol ile sterilize edin.
   3. Diseksiyon sırasında 6 kuyucuklu kesici uç plakasını buzun üzerine yerleştirin.
   4. 100 mL titreşimli doku dilimleyici dilimleme ortamı hazırlayın (Tablo 1) ve buzun üzerine yerleştirin.
   5. PBS'de% 4 düşük erimeli agaroz şişesini, bir sıvıya eriyene kadar (yaklaşık 50 ° C) bir su banyosuna yerleştirin.
   6. Titreşimli doku dilimleyici küvetini buzla doldurun.
2. Aseptik E14/15 civciv embriyosu beyin diseksiyonu
   1. Bir yumurta mumlayıcısı kullanarak, E14 veya E15 embriyosunun üzerindeki hava cebinin çevresi boyunca bir kalemle iz bırakın ve ana hatlarıyla belirtilen alanı şeffaf bantla örtün.
   2. Kavisli veya ince makas kullanarak, izlenen alanın etrafını hafifçe kesin, embriyo zarına veya kan damarlarına kesmemeye dikkat edin ve üst kabuk parçasını atın.
   3. Kavisli forseps kullanarak, embriyonun üstündeki hava boşluğu zarını çıkarın ve civciv embriyosunun kafasını bulun.
   4. Embriyonun kafasını kesin ve kafayı soğuk steril CMF çözeltisi ile 10 cm'lik bir kaba yerleştirin. Ek Şekil 2'ye bakınız.
   5. Steril ince forseps kullanarak, altta yatan dura mater ortaya çıkarmak için beyni kaplayan cildi soyun. Beynin sol ve sağ taraflarındaki oluşan kafatası kemiklerini çıkarın. Oluşan kafatası kemikleri henüz beynin çoğunluğunu kapsamaz.
   6. Beynin merkezini kaplayan meninksleri yırtmak için ince sivri forsepsleri (# 5 veya # 55) yavaşça kullanın ve beyni ortaya çıkarmak için her iki tarafa da soyun.
   7. İnce kavisli forsepsler kullanarak, beyni alt önden yukarı doğru çekin ve yavaşça boşluğundan dışarı çekin.
   8. Beyni üç ana bölüme ayırın: ön beyin, orta beyin (optik tecta), beyincik. Gerekirse bir civciv gelişim atlasına danışın.
   9. Üstteki pia mater'i ince forseps kullanarak tecta'dan çıkarın.
      NOT: Pia tecta'dan kolayca ayrılır, ancak ön beyin veya beyincikten ayrılmaz. Pia ön beyinden dokunarak veya steril gazlı bez üzerinde yuvarlanarak çıkarılabilir.
   10. Disseke edilmiş beyin bölgelerini buz üzerinde küçük steril bir kaba yerleştirin.
3. Beynin gömülmesi ve dilimlenmesi
   1. Kavisli forsepsleri bir kepçe olarak kullanarak, optik tektum veya ön beyin bölgesini yavaşça alın ve agarozun dış beyin yüzeyine yapışmasını sağlamak için ekstra sıvıyı çıkarmak için steril gazlı bez üzerinde hafifçe lekeleyin.
   2. Steril bir transfer pipeti kullanarak, kalıbı düşük erimeli agarozla doldurun. Uygun boyutta bir nesnenin etrafında alüminyum folyo oluşturarak basit bir kalıp hazırlayın. Küçük dikdörtgen metal titreşimli doku dilimleyici bloğu rutin olarak nesne olarak kullanılır. Ek Şekil 3'e bakınız.
   3. Beyin bölgesini hızlı bir şekilde agaroza yerleştirin ve buz üzerinde katılaşmasına izin verin (yaklaşık 4-5 dakika).
      NOT: Beyin, agaroz sertleşmeden önce kalıbın dibine batabilir. Bu meydana gelirse, agarın ayarlanmaya başlamasına izin vermek için 1 dakika bekleyin ve ardından beyin bölgesini agarozun içine yerleştirin. Beyin bölgesini doğrudan agarozun ortasında askıya almaya çalışın.
   4. Alüminyum folyoyu katılaşmış agarozdaki gömülü beynin etrafından çıkarın ve steril bir tıraş bıçağı veya neşter kullanarak yanların etrafındaki fazla agarozu kesin.
   5. Dilimleme kabının / tepsisinin paslanmaz çelik karesine bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı yerleştirin, agaroz bloğunu beyne yerleştirin ve tutkalın 1 dakika boyunca bağlanmasına izin verin. Çanağı/tepsiyi titreşimli mendil dilimleyici mandyerine yerleştirin, sıkın ve agaroz bloğunun üstünü örtmek için tepsiyi dilimleme ortamıyla doldurun.
   6. Titreşimli bir doku dilimleyici üzerindeki bölümleri, çelik bir tıraş bıçağından daha az canlı doku hasarına neden olduğu bildirilen bir safir bıçak kullanarak 250-350 μm'de kesin.
   7. Beyin dilimleri kesilip dilimleme tepsisine serbestçe yüzerken, dilimi tepsiden çıkarmak ve çıkarmak için steril bir spatula kullanın. Kesiti yavaşça spatuladan ve başka bir steril spatula kullanarak bir membran eki üzerine kaydırın.
      NOT: Normalde, istenirse her bir zar ekine iki veya üç beyin dilimi yerleştirilebilir. Beyin dilimini çevreleyen agaroz, beyin fazla sıvıyı çıkarmak için steril gazlı bezle yeterince lekelenmezse ayrılabilir. Gömmeden önce yeterli lekelemeden sonra bu hala meydana geliyorsa, dilimi çevreleyen agaroz olmadan yavaşça alın ve membran ekinin üzerine kaydırın.
   8. 6 delikli beyin dilimleri plakasını, hücre kültürü inkübatöründeki membran eklerine 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de yerleştirin.
   9. Kaplamadan sonraki gün, ortamı kesici ucun altından aspire etmek için steril bir Pasteur pipet kullanın (pipetin aşağıdaki ortama erişebilmesi için kesici uçların kenarlarında boşluklar vardır). Membran ekinin altındaki her bir oyuğa 1 mL taze dilim ortamı ekleyin. Bundan sonra her geçen gün medyayı değiştirmeye devam edin.
   10. Beyin dilimlerinin zar eklerine sıkıca yapışması ve biraz düzleşmiş gibi görünmesi için birkaç gün bekleyin. Bu, dilimlerin GBM hücrelerinin tanıtımı için canlı ve hazır olduğunun bir işaretidir.

9. Beyin dilimlerine GBM hücre girişi

1. Sferoid yöntem
   1. Hücre sferoidleri 150-200 μm boyuta ulaştıktan sonra, bir ila birkaç sferoidi kültür kabından çıkarmak için 5 μL'ye ayarlanmış 20 μL'lik bir mikropipet kullanın. Ek Şekil 3'e bakınız.
   2. Medyayı sferoidlerle istenen beyin dilimine nazikçe atın.
      NOT: Hücre sferoidleri pipet ucunda görünür olmalıdır. Şeffaf bir pipet ucu kullanmak, uçta görünmelerini kolaylaştıracaktır. Sıvı serbest bırakıldığında sferoid beyin diliminden düşerse, ince bir ahşap aplikatör çubuğuna yapıştırılmış etanol sterilize edilmiş bir kirpik, sferoidi beyin dilimine nazikçe geri itmek için kullanılmalıdır.
   3. Sferoidlerin beyin dilimlerinde 2-5 gün boyunca kültürlenmesine izin verin.
      NOT: Buradaki sınırlama, dilimdeki kan damarlarının ve beyin hücrelerinin nihai olarak bozulması gibi görünmektedir. Bozulmuş kan damarları, laminin için boyandığında dilimde süreksiz toplar olarak görünecektir.
2. Biyopsi punch yöntemi
   1. Beyin dilimlerinin zar eki üzerinde düzleşmiş gibi görünerek yapışmasına izin verin (kültürde 2-5 gün sürebilir).
   2. Hücre matrisini buz üzerinde çözün.
   3. Hücre kültürü biyogüvenlik kabininde, steril 1 mm çapında bir biyopsi zımbasını bir vakum aspiratör tüpüne bağlayın.
   4. Beyin diliminin merkezinde 1 mm'lik bir delik oluşturmak için biyopsi zımbasıyla beyin dilimine hafifçe dokunun.
      NOT: Biyopsi punchındaki doku, vakum tarafından punch içine aspire edilecektir.
   5. % 60-70% 'lik bir birleşik 10 cm'lik hücre kabını deneyerek ve 10 mL ortamda yeniden askıya alarak bir hücre matrisi süspansiyonu hazırlayın; daha sonra, bu süspansiyonun 1 mL'sini 100 μL matrisle karıştırın.
   6. 20 μL'lik bir mikropipet kullanarak, beyin dilimlerindeki her deliğe 1 μL hücre matrisi karışımı yerleştirin.
   7. Hücre karışımı yerleştirme işlemi bittikten sonra, gömülü hücrelere sahip beyin dilimleri tabağını inkübatöre geri yerleştirin ve matrisin katılaşmasına ve hücrelerin potansiyel olarak çevreleyen beyin dilimini istila etmesine izin verin.

10. Geniş alan floresan hızlandırılmış mikroskopi

1. Ortamın buharlaşmasını önlemek için 6 delikli plakanın kenarına çıkarılabilir bant yerleştirin ve gaz değişimi için bir tarafta küçük bir boşluk bırakın.
2. Plakaları, ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobu üzerinde ayarlanabilir otomatik bir aşamada özelleştirilmiş bir kültür odasına yerleştirin.
   NOT: Oda, bir gaz enjeksiyon kontrolörü kullanılarak %5 CO₂ ve %95 hava atmosferik koşullarında tutulmuş ve sıcaklık 37 °C'de bir sıcak hava sıcaklık kontrol cihazı ve sıcaklık kontrollü bir sahne eki ile muhafaza edilmiştir. Burada kullanılan sistemin ayrıntıları için Fotos et ^al.18'e bakınız.
3. Uygun mikroskop kontrol yazılımını kullanarak, 20 saat boyunca her 10 dakikada bir ilgi alanlarının floresan görüntülerini toplayan hızlandırılmış bir edinme programı oluşturun.
   NOT: Hücrelerde yeşil floresan etiket kullanılıyorsa (örneğin, yeşil floresan proteini [GFP]), fototoksisiteyi önlemek için hücreleri görselleştirmek için gereken minimum miktarda mavi uyarma ışığı kullanın. Kırmızı (örneğin, mCherry) ve uzak kırmızı (örneğin, DiD) etiketler, daha uzun dalga boyu uyarımı nedeniyle bu potansiyel soruna sahip görünmemektedir.

11. Hızlandırılmış mikroskopi sonrası immün boyamalı beyin dilimleri

NOT: Bu immün boyama protokolü, kan damarlarını laminin ve çekirdekleri bisbenzimid ile boyamak için optimize edilmiştir. İstenilen molekül (ler) için uygun antikorları kullanın.

1. Bir Pasteur pipet kullanarak ortamı membran ucunun altından aspire edin ve beyin dilimini örtmek için kesici ucun altındaki 0,1 M sodyum kokodilat tamponuna 1 mL %2 PFA ve kesici ucun üstüne 1 mL yerleştirin. Dilimlerin gece boyunca 4 ° C'de sabitlenmesine izin verin.
2. Fiksatifi membran ekinin altından ve beyin diliminde kalan herhangi bir fiksatiften çıkarın (fiksatif, membran ekinden aşağıdaki kuyuya sızma eğilimindedir).
3. Kesici ucu 35 mm'lik kuyudan dilimlerle çıkarın ve daha büyük bir plastik kaba yerleştirin.
4. Beyin dilimleri olduğu kadar çok kuyucuğa 350 μL PBS ekleyerek 24 delikli bir plaka hazırlayın (immün boyama sırasında bir dilim / kuyu).
   1. İnce bir spatula kullanarak, beyin dilimini zar ekinden ayırmadan agarozu beyin diliminin etrafından yavaşça çıkarın. Agarozun beyin diliminin dış kenarından kolayca ayrıldığından emin olun. Değilse, agarozu beyin dilimine bağlı bırakın.
   2. Keskin bir neşter kullanarak, altta yatan zarın bulunduğu dilim kesici ucun geri kalanından kurtulana kadar beyin diliminin etrafındaki zarı kesin. Zarı kapmak için ince forseps kullanarak zarı ekli beyin dilimi ile alın ve PBS'deki 24 delikli plakanın bir kuyusuna yerleştirin.
5. Dilimleri soğuk odada PBS ile 1 saatten fazla 3 kez durulayın, böylece dilim kuyu içinde hareket eder.
6. Durulama yaparken, birincil antikor çözeltisini hazırlayın.
   1. Anti-laminin'i PBSTG'de 2 μg/mL'ye seyreltin (bakınız Tablo 1).
7. PBS'yi kuyucuklardan çıkarın ve hafif ajitasyonla soğuk bir odada birincil antikor çözeltisinde gece boyunca inkübe edin.
8. En az 20 saatlik inkübasyondan sonra, birincil antikor çözeltisini aspire edin ve PBSTG'de bölümleri 1 saat boyunca 3x durulayın.
9. Durulama sırasında, ikincil antikor çözeltisini hazırlayın.
   1. Floresan-GAM'ı, PBSTG'de 1:200 seyreltme için gereken spesifik florokrom ile 0,1 μg/mL bisbenzimid konsantrasyonu ile seyreltin.
   2. PBSTG'yi çıkarın ve floresan sekonder antikor çözeltisinde ajitasyon ile soğuk bir odada gece boyunca inkübe edin.
   3. İkincil antikoru çıkarın ve PBSTG'de 1 saatten fazla 2x ve PBS'de 1 saatten fazla 1x'i durulayın.
   4. Mikroskop slaytlarına monte edilmeye hazır olana kadar PBS'de bırakın (bölüm 5) ve görüntüleyin.

Sonuçlar

Burada, optik tektuma in vivo enjeksiyonların yapılmasından (Şekil 1 ve Şekil 2), canlı beyin dilimlerinin kültürlenmesinden ve canlılıklarının değerlendirilmesinden (Şekil 3), ex vivo beyin dilimi kültürleri oluşturulmasından ve biyopsi punch yöntemi kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş hücrelerin implante edilmesinden (Şekil 4), poli-HEMA üzerinde hücrelerin kültürlenmesiyle hücre sferoidlerinin üretilmesinden elde edilen bazı temsili sonuçları gösteren çok sayıda şekil sunulmuştur (Şekil 5), hücre sferoidleri ile ex vivo beyin dilimi ko-kültürleri oluşturmak ve 4D konfokal hızlandırılmış mikroskopi kullanarak invaziv hücre davranışını kaydetmek (Şekil 6) ve sabit beyin dilimi preparatlarında kan damarlarına göre sferoidlerden invaziv hücre davranışını analiz etmek (Şekil 7 ve Şekil 8). Bu sonuçlar hiçbir şekilde kapsamlı değildir, bunun yerine civciv embriyo beynini insan GBM araştırması için bir ksenogreft modeli olarak kullanarak nelerin elde edilebileceğine dair iyi örnekler sunmaktadır.

Şekil 1, GFP'yi eksprese eden GSC'lerin enjeksiyonundan sonra optik tektumda in vivo olarak oluşan tümörlerin bazı temsili sonuçlarını göstermektedir. GSC'ler ventriküler yüzeye yapışır ve beyin duvarında invaziv tümörler oluşturur. GSC'ler açıkça kan damarlarının yakınında bulunur ve onlar boyunca göç ediyor gibi görünür. İn vivo GSC tümörlerinin sabit ve immün boyalı dilimlerinin dönen 3D hacimli render'larının filmleri Ek Video S1, Ek Video S2, Ek Video S3 ve Ek Video S4'te verilmiştir. Bu deneyde, beş özelliği tanımlamak için dört renk kullanıldı (yeşil GSC'ler, beyaz çekirdekler, beyaz kan damarları, mavi integrin alfa-6 ve kırmızı Sox2 veya kırmızı nestin).

Şekil 2, retroviral vektör transdüksiyonu nedeniyle mCherry'yi eksprese eden U-118 / L1LE hücreleri² ile karıştırılmış GFP'yi eksprese eden GSC'lerin enjeksiyonundan sonra optik tektumda in vivo olarak oluşan tümörlerin bazı temsili sonuçlarını göstermektedir. Bu deneyler, bu tümörlerin karışık hücreli bir süspansiyondan oluştuğu için, GSC'lerin periferde veya merkezde bulunacağı, U-118 hücrelerinin ise spesifik GSC hattına bağlı olarak bir iç çekirdek veya bir dış korteks içerecek şekilde sıralamanın gerçekleştiğini ortaya koymuştur.

Şekil 3 , ex vivo beyin dilimi kültürlerinin canlılık sonuçlarını göstermektedir. Kültürde 1 hafta sonra, laminin için fiksasyon ve immün boyama, her ikisi de beyin diliminin yaşayabilirliğini göstermek için burada kullanılan birçok sağlam kan damarını ve Sox2 ekspresyonunu ortaya çıkardı. Bu, civciv embriyosu beyin dilimlerinin yaklaşık 2 hafta boyunca membran ekleri üzerinde kültürlenebileceğini ve normal görünen kan damarları ve transkripsiyon faktörü ekspresyonu ile canlı kalabileceğini gösterdi.

Şekil 4 , biyopsi punch yöntemini kullanarak dilimlerde boşluklar oluşturduktan sonra kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin (matrisle karıştırılmış) ex vivo beyin dilimlerine "tıkaçları" nın verilmesinin sonuçlarını göstermektedir. U-118 hücreleri, bazen yoğun bir şekilde ve sıklıkla kan damarları boyunca beyin dokusunu açıkça istila etti. Bununla birlikte, hücre invazyonu, tanıtılan hücrelerin çevresi etrafında tek tip değildi. Kan damarları bazen, muhtemelen yumruk yönteminin eklenen travması veya kültürdeki sürenin uzunluğu nedeniyle, bazı dilimlerde hasarlı veya eksik görünüyordu. Bu, biyopsi punch / hücre tıkacı yönteminin, GBM hücrelerini kültürlü bir ex vivo beyin dilimindeki belirli yerlere sokmak için kullanılabileceğini gösterdi, bundan sonra hücreler beyin dilimini istila etti.

Şekil 5, kültürdeki canlı sferoidleri ve hızlandırılmış deneyler için ex vivo beyin dilimlerine sokulan canlı GBM hücre sferoidlerinin geniş alan floresansının birkaç örneğini göstermektedir. Sferoidlerden beyin dilimine hücre istilası filmleri Ek Video S5 ve Ek Video S6'da verilmiştir. Bu, hücre sferoidlerinin, GBM hücrelerini veya GSC'leri ex vivo beyin diliminin belirli yerlerine sokmanın bir başka başarılı yöntemi olduğunu ve invaziv hücre davranışının, bireysel hücrelerin çözünürlüğü zayıf olsa da, geniş alan floresan mikroskobu ile izlenebileceğini göstermiştir.

Şekil 6, canlı GSC16-4 / GFP ve U-118 / L1LE / mCherry hücre invazyonunun beyin dilimlerine konfokal hızlandırılmış deneylerinin statik görüntülerini göstermektedir. Konfokal z-stack görüntüleri, çok noktalı bir hızlandırılmış deneyde 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir elde edildi. Zaman içinde konfokal z-yığınları olarak alınan sferoidlerden beyin dilimlerine hücre istilası filmleri, Ek Video S7, Ek Video S8, Ek Video S9, Ek Video S10 ve Ek Video S11'de sunulmaktadır. Bu deney, konfokal hızlandırılmış görüntülemenin, bireysel hücre invaziv davranışını izlemek için geniş alan floresansından daha üstün olduğunu ortaya koymuştur. U-118 / L1LE hücreleri, bu koşullar altında GSC'lerden belirgin şekilde daha invazivdi. Bu, statik görüntülerde bile belirgindir, GSC'ler daha merkezi olarak konumlandırılmıştır ve U-118 hücreleri daha dağınıktır.

Şekil 7 , iki farklı ayrı etiketli sferoidin (U-118 / L1LE / mCherry sferoidleri ve GSC16-4 / GFP sferoidleri) beyin dilimlerine yerleştirildiği, birkaç gün boyunca büyütüldüğü ve daha sonra sabitlendiği, laminin için immünoboya uygulandığı ve konfokal mikroskopta optik kesitleme ile görüntülendiği ex vivo beyin dilimi / sferoid preparatlarının birkaç örneğini göstermektedir. Bu, her iki hücre tipinin de beyin dilimini istila ettiğini ve kan damarları boyunca seyahat ettiğini ortaya koydu. Farklı sferoid tipleri birbirleriyle temas edecek kadar yakın olduklarında, bir hücre tipinin diğer hücre tipinin sferoidine çok az istilası olduğu görülüyordu ve sferoidler ayrı kaldı.

Şekil 8 , iki farklı etiketli hücre tipi (GSC16-4 / GFP ile karıştırılmış U-118 / L1LE / mCherry) kullanılarak kültürde üretilen "karışık hücre tipi" sferoidlerin beyin dilimlerine yerleştirildiği, birkaç gün boyunca büyütüldüğü ve daha sonra sabitlendiği, laminin için immünoboya uygulandığı ve konfokal mikroskopta optik kesitleme ile görüntülendiği ex vivo beyin dilimi / sferoid preparatlarının birkaç örneğini göstermektedir. Bu, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin sferoidlerden göç ettiğini ve sferoidlerin merkezine yakın kümelerde kalma eğiliminde olan yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinden çok daha belirgin bir şekilde dağıldığını ortaya koydu. Ek olarak, U-118 / L1LE / mCherry hücreleri de DiD ile boyandı, böylece iki ayrı etiket (mCherry ve DiD) doğrudan sabit ex vivo preparatlarda karşılaştırılabildi. DiD etiketi, beyin dilimini istila eden tek hücrelerde bile hala tespit edilebilir; ancak, bu hücre içi punkta gibiydi.

Şekil 1: GSC'lerin in vivo olarak E5 optik tektumuna enjeksiyonundan kaynaklanan E15'teki tümörler. GSC'ler GFP ifadesi nedeniyle yeşildir. GSC15-2 hücreleri A, C ve E panellerinde ve GSC16-4 hücreleri B, D ve F panellerinde gösterilir. (A) Ventriküle yakın bir tümör ile optik tektumun düşük büyütmeli görünümü (V). Sox2 boyaması, OT hücrelerinin çekirdeklerinin çoğunu boyayan kırmızı renkte gösterilir. (B) A'ya benzer görüntü, ancak renk karıştırma ve görüntü pozlaması nedeniyle görüntüde sarı veya beyaz görünebilen kırmızı renkte nestin için boyanmış GSC16-4 hücreleri ile. OT çekirdekleri, bisbenzimid ile karşı boyama nedeniyle beyaz görünür. (C-F) 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak z-stack'lerden üretilen hacim render'larının farklı perspektifleri. Hücre çekirdekleri bisbenzimid boyaması nedeniyle beyaz görünür ve bazıları Sox2 için immün boyama nedeniyle C ve E panellerinde kırmızı görünür. D ve F panellerindeki kırmızı boyama, nestin için boyamadan kaynaklanmaktadır. Konfokal mikroskop yazılımında hacim işlemeleri için "Alpha Blending" nedeniyle, renklerin maksimum yoğunluklu bir projeksiyon kullanarak olduğu gibi karışmadığını ve en yaygın rengin daha az yoğun renge baskın olduğunu ve gizlediğini unutmayın. Kan damarları, laminin için immün boyama nedeniyle beyaza boyanır. GSC markörü integrin alpha-6 boyama mavi renkte gösterilir ve GSC yüzeylerinde noktasal görünür. Mikron ölçekleri, hacim işlemelerinin kenarları boyunca gösterilir. C-F panellerindeki ses oluşturma dönüşlerinin videoları Ek Video S1, Ek Video S2, Ek Video S3 ve Ek Video S4'te sunulur. Ölçek çubukları = 500 μm (A,B). Kısaltmalar: GSC'ler = glioblastoma kök hücreleri; OT = optik tektum; GFP = yeşil floresan proteini; BV = kan damarı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: E15'teki tümörler, E5 optik tektumuna enjekte edilen GSC'ler ve U-118 GBM hücrelerinin bir karışımından kaynaklanır. GSC'ler GFP ekspresyonu nedeniyle yeşildir ve U-118 / L1LE hücreleri mCherry ekspresyonu nedeniyle kırmızıdır. GSC15-2, A-D panellerinde ve GSC16-4, E ve F panellerinde gösterilir. (A) Ventrikülün yakınındaki karışık hücreli bir tümörün (ok) düşük büyütmeli konfokal tek z-düzlemi. Çekirdekler bisbenzimid ile beyaza boyanır. (B) Kırmızı U-118 hücrelerinin ventrikül yüzeyine yakın OT'ye invazyonu ile A'da gösterilen tümörün daha yüksek büyütülmesi (10x objektif). (C) OT duvarının derinliklerine gömülü tümörü (ok) gösteren A'dakinden biraz farklı bir optik kesit düzlemi. (D) C'deki tümörün çoklu z-düzlemlerinin maksimum projeksiyonu (20x objektif), tümör içindeki sıralanmış hücrelerin ayrıntılarını gösterir. (E) GSC16-4 hücrelerine sahip karışık bir tümörün tek z-düzlemi görüntüsü (20x objektif), tümör içinde ayrışmanın GSC15-2 hücrelerinden zıt bir düzende gerçekleştiğini ve yeşil GSC'lerin kırmızı U-118 hücrelerini çevreleyen ince ve eşit bir korteks oluşturduğunu göstermektedir. Tümörün OT duvarına bağlanma alanı bu z-düzleminde gösterilmemiştir. GSC korteksinin süreksizliğinin olduğu tümörün U-118 / L1LE hücrelerinin şişkin olduğu alanına dikkat edin (ok). L1CAM için immün boyama mavi renkle gösterilmiştir. (F) E'dekiyle aynı görüntü, ancak yalnızca yeşil GSC'leri ve mavi L1CAM boyamayı gösteriyor. Ölçek çubukları = 500 μm (A,C), 100 μm (B,D,E,F). Kısaltmalar: GSC'ler = glioblastoma kök hücreleri; OT = optik tektum; GFP = yeşil floresan proteini; V = ventrikül. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Ex vivo optik tektum dilimlerinin kültürde 1 hafta sonra yaşayabilirliği. E14 optik tektum dilimleri membran ekleri üzerinde 1 hafta süreyle kültürlendi ve daha sonra sabitlenerek immünoboya tabi tutuldu. A ve B'de gösterilenler, bisbenzimid (A) ile çekirdekler için boyanmış ve laminin (B) için immün boyanmış bir beyin diliminin konfokal görüntüleridir (10x objektif), laminin boyaması nedeniyle çeşitli konfigürasyonlarda optik olarak kesitlenmiş normal, sağlam kan damarlarını açıkça gösterir. (C) Çekirdeklerin ve laminin boyamasının her ikisinin de görülebildiği A ve B panellerinde gösterilene benzer bir konfokal görüntü. (D) Nükleer ve laminin boyamasının ayrıntılarını gösteren daha yüksek büyütmeli (60x petrol hedefi) konfokal bir görüntü. (E) Kırmızı renkte Sox2 transkripsiyon faktörü ve beyaz bisbenzimid ile toplam çekirdekler için boyanmış beyin diliminin konfokal z-yığınının (20x objektif) maksimum projeksiyon görüntüsü. Çekirdeklerin çoğunluğunun in vivo olarak gösterildiği gibi Sox2 boyaması sergilediğini unutmayın (bkz. Şekil 1). Ölçek çubukları = 100 μm (A,B,C,E), 25 μm (D). Kısaltma: P = pial yüzey. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: U-118/mCherry hücreleri, biyopsi punch yöntemi ile ex vivo beyin dilimine yerleştirilir. 1 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanılarak beyin dilimlerinde boşluklar oluşturuldu ve daha sonra matrisle karıştırılmış kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücreleri bir "tıkaç" olarak implante edildi. Birkaç gün sonra, beyin dilimleri sabitlendi, laminin için immünoboya yapıldı ve konfokal mikroskop analizi için slaytlara monte edildi. Panel A ve C, ortaya çıkan "tümörün" ve beyin dilimini istila eden çevreleyen hücrelerin düşük büyütmeli, konfokal, tek z düzlemi görüntülerini (4x objektif) gösterir. (B) Panel A'daki preparattan daha yüksek bir büyütmede (20x hedef) U-118 hücrelerinin (ok) yoğun istilasını gösteren bir z-yığınının hacimsel görüntüsü. (D) Resim, C panelinde gösterilen kapsamlı olarak istilacı hücrelerin alt kısmının benzer bir hacim görüntüsünü göstermektedir. Laminin boyama yeşil renkte gösterilmiştir, ancak net bir kan damarı belirgin değildir. (E) Resim, bir hücre tıkacının bir kısmını ve beyin dilimini istila eden hücre grubunu ve mavi renkte kan damarları için laminin boyamasını göstermektedir. (F) Panel E'de gösterilen istilacı hücrelerin daha yüksek bir büyütmesi ve hücrelerin kan damarları (oklar) boyunca hizalandığı açıkça görülebilir. Tüm paneller bisbenzimid ile beyaz nükleer karşı boyama gösterir. Ölçek çubukları = 500 μm (A,C), 100 μm (E,F). B ve D panelleri için ölçek, hacim oluşturma eksenleri boyunca gerçekleşir. Kısaltma: OT = optik tektum. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kültürdeki canlı hücre sferoidleri ve ex vivo beyin dilimlerinde canlı GBM hücrelerinin geniş alan floresan görüntüleri. A ve B panellerinde gösterilenler, U-118 / L1LE GBM hücrelerinin (A) ve GSC'lerin (B) sferoidler (oklar) olarak büyüyen faz kontrast görüntüleridir (ters mikroskopta 10x objektif kullanılarak). Panel A'nın arka planında gösterilen, hücre kültürü kabında meydana gelebilecek poli-HEMA kaplamanın odak dışı düzensizliğidir. Panellerde gösterilen C-F, ex vivo dilimlere invazyonun canlı davranışını izlemek için hızlandırılmış bir deney sırasında U-118 / L1LE hücre sferoidlerinin ve istilacı hücrelerin (oklar) geniş alan floresan görüntüleridir (özel bir hızlandırılmış mikroskop sistemi^18'de 20x'lik bir hedef kullanarak). C ve E panellerinde, hücreler uzak kırmızı floresan membran boyası DiD ile boyanır ve D ve F panellerinde hücreler kırmızı mCherry ekspresyonlarıyla görüntülenir. Ölçek çubukları = 100 μm. C ve D panellerinde gösterilen geniş alan floresan hızlandırılmış deneylerinin videoları, sırasıyla Ek Video S5 ve Ek Video S6'da bulunur. Kısaltmalar: GBM = glioblastoma; GSC'ler = GBM kök hücreleri; S = küresel. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4B hızlandırılmış çekimlerinin hacim oluşturma görüntüleri. Tüm panellerde, ayrı beyin dilimleri üzerindeki beş farklı karışık hücreli küresel engraftasyonun son nokta görüntüleri gösterilmektedir. A-E panelleri için, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımda konfokal z-stack görüntüleri elde edildi. Preparatlar, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip beyin dilimlerini içeriyordu. Konfokal görüntüler, beyin dilimleri, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan ekstra uzun çalışma mesafesi (ELWD) 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki membran ekleri üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim render'ları, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Bu konfokal hacimli render'ların zaman içindeki hızlandırılmış videoları, Ek Video S7, Ek Video S8, Ek Video S9, Ek Video S10 ve Ek Video S11'de sunulur. Kısaltmalar: GBM = glioblastoma; GSC'ler = GBM kök hücreleri; GFP = yeşil floresan proteini; NA = sayısal açıklık. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Farklı hücre tiplerindeki sferoidlerden invaziv GBM hücrelerine sahip sabit beyin dilimlerinin konfokal görüntüleri. Yeşil sferoidler GSC16-4/GFP hücrelerinden, kırmızı sferoidler ise U-118/L1LE/mCherry hücrelerinden oluşuyordu. A-F panellerinde gösterilenler, laminin (mavi) için fiksasyon ve immünoboyamadan önce birkaç gün boyunca çoklu kırmızı ve yeşil sferoidlerin kültürlendiği beyin dilimlerinin farklı görünümleridir. A-C panelleri, A'nın 4x objektifle alındığı aynı OT dilimindedir ve B ve C panelleri, panel A'da gösterilen sferoidlerin ikisinden beyin dilimini istila eden hücrelerin daha yüksek büyütme hacimli render'larıdır (20x objektif). Her iki hücre tipi de kan damarları boyunca dokuyu açıkça istila etti. Panel D, iki farklı sferoidin birbirine yakın yerleştirildiği farklı bir beyin diliminin hacim render'ını (20x objektif) gösterir ve her ikisinden de hücrelerin aralarında bulunan aynı kan damarı boyunca göç ettiği görülür (ok). Panel E, yeşil hücrelerin kan damarının dış yüzeyi boyunca göç ettiğini, kırmızı hücrenin ise kan damarının içinde (ok) göç ettiğini ortaya koyan yüksek büyütmeli (60x yağ hedefi) bir hacimdir. İç kısım, kırmızı hücrenin kan damarının mavi boyanmasıyla (ok) açıkça çevrelendiği ve yeşil hücrenin açıkça kan damarının dışında olduğu tek bir z-düzlemi optik bölümünü gösterir. İç kısımdaki ölçek çubuğu = 50 μm. Panel F, birbirine yakın iki farklı renkte sferoid içeren bir ön beyin diliminin hacimsel render'ını (10x objektif) gösterir. Varsa, bir küreden diğerine çok az hücre istilası meydana geldi ve aralarında keskin bir sınır vardı. A, B, C ve E panelleri ayrıca bisbenzimid ile beyaz nükleer karşı boyama göstermektedir. Ölçek çubuğu = 500 μm (A). B-F panelleri için ölçekler, hacim oluşturma eksenleri boyuncadır. Kısaltmalar: GBM = glioblastoma; GSC'ler = GBM kök hücreleri; GFP = yeşil floresan proteini; OT = optik tektum. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: DiD ile etiketlenmiş karışık hücreli sferoidlerden ve sferoidlerden invaziv GBM hücrelerine sahip sabit beyin dilimlerinin konfokal görüntüleri. Paneller A-D, yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinden ve kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinden oluşan karışık hücre sferoidleri içeren beyin dilimlerinin hacim görüntülerini gösterir. Çok sayıda kırmızı U-118 hücresi sferoidlerden dağıldı ve beyin dilimini her yöne istila etti, oysa yeşil GSC'ler dağılmadı ve sferoidlerin merkezi yerlerinde kaldı. E ve F panelleri, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry sferoidleri ile bir ex vivo dilim hazırlığı gösterir, ayrıca uzak kırmızı membran boyası DiD (mavi olarak gösterilir) ile etiketlenmiştir. Fiksasyondan sonra, dilim yeşil laminin için immünoboya tabi tutuldu. DiD etiketi kırmızı hücrelerde noktasal boyama (oklar) olarak görülebiliyordu ve sferoidlerden kan damarları boyunca dağılmış hücrelerde bile görülebiliyordu. Bibenzimid ile nükleer karşı boyama bu şekilde gösterilmemiştir, böylece diğer boyama daha net görülebilir. Ölçek çubukları = 100 μm (E,F). Kısaltmalar: GBM = glioblastoma; GSC'ler = GBM kök hücreleri; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ortam/çözüm	Kompozisyon
GSC medya	1:1 DMEM / F12,% 1 fetal sığır serumu (FBS), 15 mM HEPES tamponu, 2 mM L-glutamin, 100 μg / mL penisilin-streptomisin (kalem / strep), A vitamini içermeyen% 2 B27 takviyesi ve 2.5 μg / mL heparin karışımı.
GBM medya	DMEM (yüksek glikoz),% 10 FBS, kalem / strep ve 2 mM L-glutamin.
Fiksasyon tamponu	0,1 M sodyum kokodilat tamponunda %2 PFA
Gömme ortamı	PBS'de %3.5 agar ve %8 sakkaroz
cesaret	PBS'de %0,1 Triton X-100 + %5 normal keçi serumu (NGS)
U-118 MG hücre kültürü ortamı	DMEM +% 10 FBS + kalem / strep + L-glutamin
Beyin Dilimi Kültür Medyası	P MEM + % HBSS + % At Serumu + B27 + kalem/strep + L-glut + 15 mM HEPES tampon
titreşimli doku dilimleyici dilimleme ortamı	Orta 199 + kalem/strep + 15 mM HEPES tampon

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan ortam ve tamponların bileşimi.

Ek Şekil 1: E5 optik tektuma enjeksiyon. (A) Hava boşluğu üzerindeki yumurta kabuğunda bir delik açıldıktan ve hava boşluğu zarı tuzlu su veya ortam ile ıslatıldıktan sonra, zar ince forsepslerle çıkarılır. (B) Hücreleri optik tektuma enjekte etmek için, amniyon sıkıştırılır ve optik tektuma erişilebilecek şekilde kafayı konumlandırmak için ince forsepslerle tutulur.  Daha sonra mikropipet optik tektuma yerleştirilir ve hücreler içine basınç enjekte edilir. (C) Hücrelerin enjeksiyonundan sonra, bir şırınga ve ince iğne kullanılarak embriyonun üzerine birkaç damla ampisilin çözeltisi eklenir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: E15 beyin bölgelerinin diseksiyonu. (A) Kafa kesildikten sonra, E15 embriyo başı steril CMF çözeltisi içeren bir kaba yerleştirilir. (B) Beynin üstündeki deri daha sonra ince forsepsler kullanılarak çıkarılır. (C ) İki kafatası kemiği daha sonra iki ön beyin (FB) yarımküresinin üstünden çıkarılır. (D) Bağ dokusu dura daha sonra ön beyin (FB), optik tektum ve beyinciği çevreleyen nazikçe çıkarılır. (E) Tüm beyin daha sonra kavisli forseps kullanılarak beyin boşluğundan yavaşça çıkarılarak kafadan çıkarılır. (F ) Çıkarılan beynin tamamının ön beyin (FB), optik tektum (OT) ve beyincik (CB) ile dorsal görünümü gösterilmiştir. (G ) İzole edilmiş beyin daha sonra ince makas kullanılarak ön beyin (FB), optik tektum (OT) yarımküreleri ve beyincik (CB) içine diseke edilir. (H ) Hassas bağ dokusu pia, daha sonra ince forsepsler kullanılarak optik tektum (OT) yarımkürelerinden kolayca çıkarılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: E15 optik tektumunun gömülmesi ve dilimlenmesi ve hücre sferoidlerinin yerleştirilmesi. (A) Bir optik tektum yarımküre, kavisli forseps kullanılarak düşük erimeli agaroza batırılır. (B) Agaroz buz üzerinde sertleştikten sonra, optik tektum içeren blok kesilir ve dilimleme kabındaki/tepsisindeki paslanmaz çelik kaideye yapıştırılır. (C) Tutkal kuruduktan sonra, dilimleme kabı/tepsisi titreşimli doku dilimleyicinin aynasına yerleştirilir ve soğuk dilimleme ortamı ile doldurulur.  Dilimler daha sonra batık doku bloğundan safir bıçakla kesilir.  Kesilmiş dilimler tabağa / tepsiye yüzer ve bir spatula kullanılarak çıkarılabilir.  (D) Kesilmiş dilimler çanaktan/tepsiden çıkarılır ve çok kuyucuklu bir plakada altta yatan dilim kültürü ortamına sahip membran eklerine doğrudan yerleştirilir. (E) Hücre sferoidleri poli-HEMA kaplı tabaklarda yetiştirildikten sonra, 20 μL mikropipetör kullanılarak bir sferoid, çanaktan minimum miktarda ortamda çıkarılır. (F) İzole edilmiş sferoid daha sonra minimal ortamdaki doğrudan beyin dilimine yerleştirilir. (G) Sferoid, ortamın akışı nedeniyle beyin diliminden düşerse, tahta bir aplikatör çubuğuna yapıştırılmış bir kirpik kullanılarak beyin dilimine geri sürülebilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: E15'te küçük bir GSC15-2 tümörünün yüksek büyütme hacimli render videosu. GSC'ler GFP ifadesi nedeniyle yeşildir. Video Şekil 1C'ye karşılık gelir ve GSC15-2 hücrelerini gösterir. Videoda, 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak bir z-yığınından oluşturulan hacimli render'ın döndürülmesi gösterilmektedir. Hücre çekirdekleri bisbenzimid boyaması nedeniyle beyaz görünür ve bazıları Sox2 için immün boyama nedeniyle kırmızı görünür. Konfokal mikroskop yazılımında hacim işlemeleri için "Alpha Blending" nedeniyle, renklerin maksimum yoğunluklu bir projeksiyon kullanarak olduğu gibi karışmadığını ve en yoğun rengin daha az yoğun renge baskın olduğunu ve gizlediğini unutmayın. Kan damarları, laminin için immün boyama nedeniyle beyaza boyanır. GSC markörü integrin alpha-6 boyama mavi renkte gösterilir ve yeşil GSC yüzeylerinde punktat görünür. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S2: E15'te küçük GSC16-4 tümörünün yüksek büyütmeli hacimli render videosu. GSC'ler GFP ifadesi nedeniyle yeşildir. Video, Şekil 1D'ye karşılık gelir ve GSC16-4 hücrelerini gösterir. Videoda, 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak bir z-yığınından oluşturulan hacimli render'ın döndürülmesi gösterilmektedir. Hücre çekirdekleri bisbenzimid boyaması nedeniyle beyaz görünür ve bazı GSC'ler nestin için immün boyama nedeniyle kırmızı görünür. Konfokal mikroskop yazılımında hacim işlemeleri için "Alpha Blending" nedeniyle, renklerin maksimum yoğunluklu bir projeksiyon kullanarak olduğu gibi karışmadığını ve en yoğun rengin daha az yoğun renge baskın olduğunu ve gizlediğini unutmayın. Kan damarları, laminin için immün boyama nedeniyle beyaza boyanır. GSC markörü integrin alpha-6 boyama mavi renkte gösterilir ve yeşil GSC yüzeylerinde punktat görünür. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S3: E15'te küçük GSC15-2 tümörünün yüksek büyütme hacmine sahip görüntülerinin videosu. GSC'ler GFP ifadesi nedeniyle yeşildir. Video Şekil 1E'ye karşılık gelir ve GSC15-2 hücrelerini gösterir. Videoda, 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak bir z-yığınından oluşturulan hacimli render'ın döndürülmesi gösterilmektedir. Hücre çekirdekleri bisbenzimid boyaması nedeniyle beyaz görünür ve bazıları Sox2 için immün boyama nedeniyle kırmızı görünür. Konfokal mikroskop yazılımında hacim işlemeleri için "Alpha Blending" nedeniyle, renklerin maksimum yoğunluklu bir projeksiyon kullanarak olduğu gibi karışmadığını ve en yoğun rengin daha az yoğun renge baskın olduğunu ve gizlediğini unutmayın. Kan damarları, laminin için immün boyama nedeniyle beyaza boyanır. GSC markörü integrin alpha-6 boyama mavi renkte gösterilir ve yeşil GSC yüzeylerinde punktat görünür. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S4: E15'te küçük GSC16-4 tümörlerinin yüksek büyütme hacimli render'larının videosu. GSC'ler GFP ifadesi nedeniyle yeşildir. Video, Şekil 1F'ye karşılık gelir ve GSC16-4 hücrelerini gösterir. Videoda, 60x yağ daldırma hedefi kullanılarak bir z-yığınından oluşturulan hacimli render'ın döndürülmesi gösterilmektedir. Hücre çekirdekleri bisbenzimid boyaması nedeniyle beyaz görünür ve bazıları nestin için immün boyama nedeniyle kırmızı görünür. Konfokal mikroskop yazılımında hacim işlemeleri için "Alpha Blending" nedeniyle, renklerin maksimum yoğunluklu bir projeksiyon kullanarak olduğu gibi karışmadığını ve en yoğun rengin daha az yoğun renge baskın olduğunu ve gizlediğini unutmayın. Kan damarları, laminin için immün boyama nedeniyle beyaza boyanır. GSC markörü integrin alpha-6 boyama mavi renkte gösterilir ve yeşil GSC yüzeylerinde punktat görünür. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S5: Ex vivo beyin diliminde canlı GBM hücrelerinin videosu. Video, Şekil 5C'ye karşılık gelir ve ex vivo dilime invazyonun canlı davranışını izlemek için hızlandırılmış bir deney sırasında U-118 / L1LE hücre sferoidlerinin ve istilacı hücrelerin geniş alan floresan görüntülerini gösterir (özel bir hızlandırılmış mikroskop sisteminde 20x hedefi kullanarak). U-118 / L1LE hücreleri uzak kırmızı floresan membran boyası DiD ile boyandı. Görüntüler tek renkli bir kamera ile elde edildi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S6: Ex vivo beyin diliminde canlı GBM hücrelerinin videosu. Video, Şekil 5D'ye karşılık gelir ve ex vivo dilime invazyonun canlı davranışını izlemek için hızlandırılmış bir deney sırasında U-118 / L1LE hücre sferoidlerinin ve istilacı hücrelerin geniş alan floresan görüntülerini gösterir (özel bir hızlandırılmış mikroskop sisteminde 20x hedefi kullanarak). Hücreler kırmızı mCherry ekspresyonu ile görüntülendi. Görüntüler tek renkli bir kamera ile elde edildi. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S7: Hacim oluşturma videosu, canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4D hızlandırılmış görüntüleri. Video, Şekil 6A'ya karşılık gelir. Konfokal z-stack görüntüleri, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımlarla elde edildi. Hazırlık, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip bir beyin dilimiydi. Konfokal görüntüler, beyin dilimi, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan bir ELWD 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki bir zar eki üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim oluşturma, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Video en iyi şekilde, video oynatıcının normal yavaş hızında ilerlemesine izin vermek yerine, hücre hareketini gözlemlemek için video oynatıcıdaki video ilerleme kaydırıcısını manuel olarak ileri geri sürükleyerek gözlemlenir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S8: Hacim videosu, canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4D hızlandırılmış görüntülerinin görüntülerini oluşturur. Video, Şekil 6B'ye karşılık gelir. Konfokal z-stack görüntüleri, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımlarla elde edildi. Hazırlık, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip bir beyin dilimiydi. Konfokal görüntüler, beyin dilimi, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan bir ELWD 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki bir zar eki üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim oluşturma, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Video en iyi şekilde, video oynatıcının normal yavaş hızında ilerlemesine izin vermek yerine, hücre hareketini gözlemlemek için video oynatıcıdaki video ilerleme kaydırıcısını manuel olarak ileri geri sürükleyerek gözlemlenir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S9: Hacim videosu, canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4D hızlandırılmış görüntülerinin görüntülerini oluşturur. Video, Şekil 6C'ye karşılık gelir. Konfokal z-stack görüntüleri, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımlarla elde edildi. Hazırlık, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip bir beyin dilimiydi. Konfokal görüntüler, beyin dilimi, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan bir ELWD 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki bir zar eki üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim oluşturma, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Video en iyi şekilde, video oynatıcının normal yavaş hızında ilerlemesine izin vermek yerine, hücre hareketini gözlemlemek için video oynatıcıdaki video ilerleme kaydırıcısını manuel olarak ileri geri sürükleyerek gözlemlenir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S10: Hacim videosu, canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4D hızlandırılmış çekiminin görüntülerini oluşturur. Video, Şekil 6D'ye karşılık gelir. Konfokal z-stack görüntüleri, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımlarla elde edildi. Hazırlık, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip bir beyin dilimiydi. Konfokal görüntüler, beyin dilimi, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan bir ELWD 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki bir zar eki üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim oluşturma, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Video en iyi şekilde, video oynatıcının normal yavaş hızında ilerlemesine izin vermek yerine, hücre hareketini gözlemlemek için video oynatıcıdaki video ilerleme kaydırıcısını manuel olarak ileri geri sürükleyerek gözlemlenir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S11: Canlı GSC'lerin ve GBM hücrelerinin konfokal 4D hızlandırılmış görüntülerinin hacim oluşturma videosu. Video, Şekil 6E'ye karşılık gelir. Konfokal z-stack görüntüleri, 20 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir 10 μm adımlarla elde edildi. preparat, kırmızı U-118 / L1LE / mCherry hücrelerinin ve yeşil GSC16-4 / GFP hücrelerinin implante edilmiş karışık hücre sferoidlerine sahip bir beyin dilimini içeriyordu. Konfokal görüntüler, beyin dilimi, gerekli ekstra çalışma mesafesini sağlayan bir ELWD 20x objektif lens (0.45 NA) kullanılarak 6 delikli bir plastik hücre kültürü kabındaki bir zar eki üzerinde kültürlenirken alındı. Hacim oluşturma, belirgin bir 3D efekti veren konfokal mikroskop yazılımı "Alpha Blending" kullanılarak oluşturuldu. Mikron ölçekleri, hacim işlemenin kenarları boyunca gösterilir. Video en iyi şekilde, video oynatıcının normal yavaş hızında ilerlemesine izin vermek yerine, hücre hareketini gözlemlemek için video oynatıcıdaki video ilerleme kaydırıcısını manuel olarak ileri geri sürükleyerek gözlemlenir. Bu Videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Hücrelerin orta beyin (optik tektum) ventrikülüne enjeksiyonu için protokoldeki kritik adımlar, yumurtadaki koryoallantoik membrandaki kan damarlarına zarar vermemeyi veya enjeksiyondan önce ve enjeksiyon sırasında embriyoyu çevrelememeyi içerir, ancak embriyoyu hemen çevreleyen amniyon zarı, hücreleri orta beyne enjekte ederken kafayı konumlandırmak için hafifçe çekilebilir ve tutulabilir. Amniyon nispeten serttir ve beynin ortasındaki büyük, yuvarlak yapı olan optik tektuma diğer eliyle hücrelerin enjeksiyonu için kafayı konumlandırmak ve bir elle sabit tutmak için ince forsepslerle çekilebilir. Genel olarak, enjekte edilen embriyoların canlılığı, bilinmeyen faktörlere bağlı olarak% 25 ila% 75 arasında değişmektedir ve pratik olarak hayatta kalan her embriyo, optik tektumda en az küçük bir tümör içerir. Canlı beyin dilimleri üretmedeki kritik adımlar, fazla sıvı dokusunun lekelenmesini içerir, böylece agaroz dilimleme sırasında beyne yapışır ve zar ekine yerleştirilene kadar doku ve dilimleri soğuk tutar. Farklı hücre tipleri sferoidleri farklı şekilde (hız ve boyut olarak) oluşturduğundan, poli-HEMA plakalarındaki kaplanmış hücre yoğunluğu ve sferoidlerin toplanmasından önceki sürenin uzunluğu her hücre tipi için optimize edilmelidir.

Buradaki çalışma, beyin dilimi canlılığının resmi bir uzunlamasına çalışmasına tabi tutulmamıştır. Yang ve ark. burada kullanılanlara benzer civciv embriyo beyin dilimi kültürleri kullanmış ve dilimlerin en az 7 gün boyunca iyi yaşayabilirliğini göstermiştir¹⁶. Önceki çalışmalar, OT dokusu suboptimal ortamda tutulduğunda, dokuda, buradaki çalışmadaki dilimlerde meydana gelmeyen birçok piknotik çekirdeğin ortaya çıktığını göstermiştir. Ek olarak, dilimler optimal olmayan koşullarda dejenere olduğunda, kan damarları parçalanır ve laminin-pozitif kürelerin sıraları olarak görünür (gösterilmemiştir). Bu nedenle, buradaki canlılık elektrofizyoloji veya aktif kaspaz-3 ekspresyonu gibi yöntemlerle kontrol edilmemiş olsa da, suboptimal kültür koşulları altında görülen hücre ölümü göstergelerinin hiçbiri burada ortaya çıkmamıştır.

OT, in vivo beyin tümörü deneyleri için odaklanmıştır, çünkü en büyük ventriküle sahip en kolay enjekte edilen bölgedir. Embriyonun yumurta sarısının üstünde erişilebilir kalacak kadar küçük olduğu son gün olan E5'te, tüm beyin bölgeleri ince bir ventrikül bölgesinden başka bir şey olmadığı için enjeksiyonlar bir ventrikül içine yapılmalıdır. Bununla birlikte, bu enjeksiyonlar, beyin parankimini istila eden hücrelere sahip gömülü tümörlerde başarılı bir şekilde sonuçlanır. Bazen, ortaya çıkan tümörler ön beyinde veya beyincikte bulunur, ancak bu yaygın değildir. E15 optik tektumunun Ex vivo dilimleri öncelikle buradaki deneyler için kullanılmıştır, böylece ex vivo ko-kültür sonuçları in vivo enjeksiyon deneyleri ile ilişkilendirilebilir. Bununla birlikte, ön beyin dilimleri de uygundur ve optik tektuma kıyasla daha geniş bir yüzey alanına ve çok ince bir ventriküle sahiptir, bu da ön beyni in vivo enjeksiyonlarla ilişkili olmayan ex vivo ko-kültürler için daha uygun hale getirebilir.

Burada, in vivo enjeksiyonların, ardından doku fiksasyonu, titreşimli doku dilimleyici kesitleme ve laminin ve diğer belirteçler için immün boyamanın, kan damarlarına yakın beyin dokusundaki GBM hücrelerinin ve GSC'lerin yüksek çözünürlüklü görüntüleriyle sonuçlandığı gösterilmiştir. Tümör hücreleri ve kan damarları arasındaki ilişkileri belirleme yeteneği, konfokal yazılımı ve üreticinin talimatlarını kullanarak konfokal optik bölümlerin z-yığınlarından 3D hacim render'ları oluşturarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. GFP, mCherry ve DiD etiketli hücrelerin geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak hızlandırılmış görüntüleme mümkündü; Bununla birlikte, yüksek oranda floresan sferoidlere yakın olan göç eden hücreler bazen sferoidden gelen "parıltı" ile gizlenmiştir. Bu istenmeyen etki, geniş alan görüntüleri toplamak için pozlama sürelerini dikkatlice ayarlayarak bir miktar en aza indirilebilir. Zaman içinde konfokal z-yığınları (4D) kullanılarak hızlandırılmış görüntüleme, sferoidlerden gelen odak dışı parıltıyı ortadan kaldırdı ve koyu bir arka plana sahip keskin bir şekilde tanımlanmış göç eden hücrelerle sonuçlandı. Bu, protokolde tanımlanmamıştır, ancak beyin dilimleri 6 delikli bir plastik plakadaki şeffaf zar ekleri üzerindeyken gerçekleştirilen geniş alan hızlandırılmış görüntülemeye benzer şekilde gerçekleştirilmiştir. Konfokal hızlandırılmış görüntüleme, bireysel hücrelerin ve davranışlarının belirgin şekilde daha net görüntüleriyle sonuçlanmasına rağmen, 20 saatlik bir süre boyunca 10 dakikalık aralıklarla 10 z-düzlemi / noktalı z-yığınlarını toplayan çok noktalı bir hızlandırılmış deney, tarama kafası galvanometrelerinin yaygın bir kullanımıdır. Bu, galvanometrelerin ömrünü önemli ölçüde azaltabileceğinden, bu yöntem akıllıca kullanılır.

Civciv embriyo sistemi, GBM hücre davranışını araştıran hem in vivo enjeksiyon hem de ex vivo ko-kültür deneyleri için çok uygun olmasına rağmen, bu model sistemin birkaç sınırlaması vardır. Herhangi bir ksenogreft sisteminde olduğu gibi, insan hücrelerinin implante edildiği ortam insan beyni değildir, ancak GBM hücre davranışı, kemirgen modellerinde ve insan hastalarında bunu taklit ediyor gibi görünmektedir. E5 üzerinde in vivo enjeksiyon deneyleri yapıldıktan sonra, tümörlerin normalde E15'e kadar 10 gün boyunca oluşmasına izin verilir. Bu açıkça tümörigenez ve hücre invazyonunun tüm yönlerini incelemek için yeterli zaman değildir. Bununla birlikte, burada beyin parankiminde katı tümörlerin oluştuğu, hücrelerin tümör içinde etkileşime girdiği ve kendilerini yeniden düzenlediği ve önemli beyin invazyonunun hem kan damarları boyunca hem de bu nispeten kısa süre içinde yaygın olarak meydana geldiği gösterilmiştir. İn vivo civciv embriyo sisteminin bir diğer sınırlaması, civciv embriyo gelişimi sırasında çalışan büyük yumurta sarısı ve ekstraembriyonik dolaşım sistemi nedeniyle ilaç veya diğer tedaviler için uygun olmamasıdır. Topikal sıvı ilaç tedavileri, embriyodan çok daha büyük yumurta sarısı kütlesine difüzyon nedeniyle beyinde oldukça değişken ve bilinmeyen bir konsantrasyona neden olacaktır. Benzer şekilde, ilaçların çok hassas ekstraembriyonik dolaşım sistemine intravenöz enjeksiyonu, kan damarlarından sızacak veya yayılacak ve ayrıca beyinde bilinmeyen konsantrasyonlara neden olacaktır. Bu, ex vivo dilim kültürü yönteminin benimsenmesinin ana nedenlerinden biridir - böylece sadece hücre davranışı hızlandırılmış mikroskopi ile gözlemlenebilir ve izlenemez, aynı zamanda bir çanak^4'teki GBM hücre davranışını değiştirmede başarılı olan tedavilerin daha alakalı bir beyin dokusu ortamında test edilebilmesi için.

Civciv embriyosu ortotopik beyin tümörü model sisteminin geliştirilmesi, GBM tümör oluşumu ve invaziv hücre davranışının incelenmesi için mevcut sistemlere ve araçlara önemli bir katkı olarak görülmektedir. Döllenmiş tavuk yumurtalarının çoğu alanda kolayca bulunabilmesi muhtemeldir, kemirgenlere kıyasla ucuzdurlar, hayvan bakım maliyeti yoktur, embriyolar çok esnek ve enfeksiyona karşı dirençlidir (yani, çoğu iş bir tezgah üstünde yapılır), embriyolar oldukça manipüle edilebilir ve kabuksuz kültür^19'da yetiştirilebilir ve civciv embriyoları omurgalı hayvanlar olarak kabul edilmez ve bu nedenle NIH kılavuzları tarafından IACUC onayı gerektirmez (kurumsal gereksinimler) değişebilir). Bu nedenle, bu çoklu avantajlar, civciv embriyo sistemini, sorularını ve deneylerini sınırlamalarına girenlerle sınırlarsa çok çekici kılar. Civciv embriyosunu kullanan başkaları tarafından çoklu GBM hücre çalışmaları yapılmıştır, ancak bunlar neredeyse sadece embriyonun koryoallantoik zarını (CAM) 20,21,22,23,24,25,26,27,28,29 ve uzuv tomurcuğu ^30'u kullanmıştır, beyin değil. E2^31'de civciv beynine medulloblastom implante eden bir rapor da var. Kuşkusuz, civciv embriyosunun ortotopik bir ksenogreft model sistemi olarak kullanılması, burada açıklandığı gibi, insan GBM tümör biyolojisi için CAM kullanan çalışmalardan çok daha anlamlı sonuçlar vermelidir.

Bu çalışmalar, insan GBM hücresi ve GSC davranışı çalışmaları için civciv embriyosu beyin tümörü model sistemini tam olarak kullanmaya başlamış olsa da, başkalarının kullanımları genişleteceği ve daha fazla potansiyel uygulama bulacağı umulmaktadır. Bu sistemin sadece GBM tümör oluşumunu ve hücre davranışını düzenleyen mekanizmaları ortaya çıkarmakla kalmayacağını, aynı zamanda spesifik ilaçların ve maddelerin spesifik hastaların hücreleri üzerinde klinik öncesi test edilmesine izin vereceğini de hayal edebiliriz. Örneğin, beyin dilimi kültürleri önceden ayarlanmışsa, tümör hücreleri, cerrahi tümör rezeksiyonlarından parçalar veya hasta kaynaklı GBM organoidleri³² doğrudan ex vivo ko-kültüre yerleştirilebilir ve çeşitli tedaviler birkaç gün içinde değerlendirilebilir. Benzer şekilde, ayrışmış hasta hücreleri, tümör oluşturma ve beyin parankimini istila etme yeteneklerini değerlendirmek için doğrudan ovo'daki E5 orta beyinlerine enjekte edilebilir. Bu nedenle, buradaki yöntemlerin ve temsili sonuçların açıklamalarının, beyin kanseri araştırmaları için oldukça az kullanılan bu sistemin kullanımını kolaylaştıracağı ve teşvik edeceği umulmaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 cm x 1 cm kare delikli kağıt zımba	Birabira	N/A
1 mm biyopsi zımba	kalemi Robbins Instruments	20335
6 kuyulu yerleştirme plakası (Corning Transwell)	Millipore Sigma	CLS3450
9" Tek Kullanımlık Pastör Pipetleri	Fisher Scientific	13-678-20C
15 mL santrifüj tüpleri	Fisher Scientific	05-539-12
24 kuyulu plaka	Corning Costar	3526
50 mL santrifüj tüpleri	Fisher Scientific	05-539-9
Agar	Fisher BioReagents	BP1423-500	sabit beyinleri gömmek için
Alexafluor 488-konjuge GAM IgG	Jackson İmmünoresearch	115-605-146
Alexafluor 647-konjuge GAM IgG	Jackson İmmünoresearch	115-545-146
Alüminyum folyo	ReynoldsWrap	N/A
Ampisilin	Sigma Aldrich	A-9518
anti-integrin alfa-6 monoklonal antikor GOH3	Santa Cruz Biyoteknoloji	sc-19622
anti-L1CAM monoklonal antikor UJ127	Santa Cruz Biyoteknoloji	sc-53386
anti-laminin monoklonal antikor	Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası	3H11
anti-nestin monoklonal antikor 10c2	Santa Cruz Biyoteknoloji	sc-23927
anti-Sox2 monoklonal antikor E-4	Santa Cruz Biyoteknoloji	sc-365823
A vitamini içermeyen B27 takviyesi	GIBCO	17504-044
bisbenzimid (Hoechst 33258)	Sigma-Aldrich	B2883	nükleer leke
Hücre kültürü inkübatörü	Forma		standart nemlendirilmiş CO2< / sub> inkübatörü
Santrifüj	Beckman Coulter
Konfokal mikroskop	Nikon Instruments	C2si +	Özel yapım hücre inkübatör odası ile
Konfokal mikroskop objektif lensleri	Nikon Instruments		Plan Apo lensler, S Plan Fluor hariç ELWD Konfokal zaman atlamalı görüntüleme için 20x 0,45 NA objektif lens
Konfokal mikroskop yazılımı	Nikon Instruments	NIS Elements	Sürüm 5.2
Kavisli foreceps	World Hassas Aletler	504478
Kavisli makas	Güzel Bilim Araçları
Kavisli spatula	Fisher Scientific	14-375-20
Siyanoakrilat yapıştırıcı	Krazy Tutkal	KG-585 12R
D-Glikoz	Millipore Sigma	G8270
DiD uzak kırmızı floresan boya	Invitrogen	V22887	Vybrant DiD
DMEM	Sigma Aldrich	D5671
DMEM / F12	Sigma Aldrich	D8437
DMSO	Sigma Aldrich	D4540
Dulbecco'nun Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)	Sigma Aldrich	P5493-1L
yumurta kuluçka makinesi	Humidaire
elektrik bandı (10 mil kalınlık / 254 &mikro; m)	Scotch	N/A
Etanol 200 kanıt	Decon Laboratories	2701
Hızlı yeşil FCF boya	Avokado Araştırma Kimyasalları	16520
FBS	İkizler Biyo-ürünler	900-108
filtre kağıdı	Fisher Scientific
Gazlı	Bez Dynarex	3353
Cam Kılcal Damarlar mikroenjeksiyon için	World Precision Instruments	TW100-4
Gliserol Fisher	BioReagents	BP228-1
GSC'lerini (insan glioblastoma kök hücreleri)	Uygulanamaz		GSC ortamında Galileo laboratuvarında hasta GBM örneklerinden izole edildi ve daha sonra lentiviral vektörü kodlayan bir GFP ile transdüksiyon yapıldı. Kullanılan hücreler 10 ile 30 numaralı pasaj arasındaydı.
Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Corning	21-020-CV
Hemasitometre	Hausser bilimsel
Heparin	Fisher Scientific	BP2524-100
HEPES tamponu	Sigma Aldrich	H0887
At Serumu (HI)	Gibco	26050-088
İnsan FGF-2	BioVision	4037-1000
İnsan TGF-&alfa;	BioVision	4339-1000
Ters faz kontrast mikroskobu	Nikon Instruments	TMS,	kültürlenmiş hücrelerin rutin görüntülenmesi için
KCl	Fisher Scientific	BP366
KH2< / sub>PO4< / sub>	Fisher Scientific	P284
Laboratuvar filmi	Parafilm
Labquake Shaker	LabIndustries	T400-110
L-Glut:Kalem:Strep	Gemini Biyo-ürünler	400-110
Canlı beyinleri gömmek için	düşük eriyik agaroz	Fisher Scientific	BP1360
Matrix	Corning Matrigel	354234
Orta 199	GIBCO	11150-059
MEM	Corning	10-010-CV
Metal vibratom bloğu
Mikropipet uçları (20, 200, 1.000 & mikro; L)	Fisherbrand
Mikropipetleyiciler (20, 200, 1.000 ve mikro; L)	Gilson
Mikroskop Kapak Camı (no. 1.5 kalınlık)	Fisherbrand	12544A
NaCl	Fisher Scientific	S271
NaH < sub > 2 < / sub > PO < sub > 4 < / sub> + H < sub > 2 < / sub>O	Fisher Scientific	S369
NaHCO3< / sub>	Fisher Scientific	BP328
Normal keçi serumu	Millipore Sigma	526-M
N-propil gallat	Sigma Aldrich	P3130	medya montajı için
Parafilm	Parafilm
Paraformaldehit	Elektron Mikroskobu Bilimleri	15710
PBS	Sigma Aldrich	P5493-1L
Kalem
Düz Mikroskop slaytları	Fisherbrand	12-550-A3
Plastik 35 mm Petri kabı	Becton Dickinson	351008
pnömatik pikopompa	Dünya Hassas Aletler	PV830
Poli (2-hidroksietil metakrilat)   (poli-HEMA)	Sigma Aldrich	P-3932
sabit beyin dilimlerini kesmek için	çift kenarlı	PACE
safir bıçak	Canlı beyin dilimlerini kesmek için	Delaware Elmas Bıçaklar
Neşter	TruMed	1001
Sodyum kakodilat tamponu 0.2 M pH 7.4 Elektron	Mikroskobu Bilimleri	11652
Numune odası vibratom	ısmarlama
Stereo Diseksiyon Mikroskobu	Nikon Instruments	SMZ1500	Epifloresan
düz foreceps	ile donatılmıştır Dünya Hassas Aletler	500233
düz makas	Güzel Bilim Araçları
Sucrose	Mallinckrodt	7723
Hızlandırılmış floresan mikroskop (geniş alan floresan)	Nikon Instruments	TE2000-E	Özel yapım hücre inkübatör hazneli (bkz. Fotos ve diğerleri, 2006)
Doku kültürü kabı polistiren 100 mm	Thermo Fisher Hücre	kültürü için	130182
Doku kültürü kabı polistiren 60 mm	Becton Dickinson	353004	Hücre kültürü için
Transfer pipeti	American Central Scientific Co.	FFP011
Şeffaf bant	Scotch
Triton X-100	Sigma Aldrich	T-8787
Tripsin (% 0.25) + 2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
U-118 MG insan GBM hücre hattı	ATCC	HTB-15	Hücreler, L1CAM adezyon proteininin tüm ektodomain dizisini kodlayan bir lentiviral vektör ve daha sonra lentiviral vektör ile dönüştürüldü pUltra sıcak kodlama mCherry.  Geçiş numaraları bilinmemektedir.
Vakum pompası	Cole-Parmer	EW-07532-40	"Hava Harbiyeli"
Canlı ve sabit beyin dilimlerini kesmek için	titreşimli doku dilimleyici	Vibratom	3000

medya monte etmek için) , tıraş bıçağı - bilimsel