Method Article

Omurilik Yaralanmasının Bir Fare Modelinde Lokomotor Disfonksiyonu Ölçmek için MouseWalker'ı Kullanma

DOI:

10.3791/65207

⸱

March 24th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2iNOVA4Health, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, 3Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MouseWalker (MW) araç kutusunu kullanarak serbestçe yürüyen farelerin lokomotor modelini nicel olarak tanımlamak için ilk video kayıtlarından ve izlemeden niceleme sonrası analize kadar uzanan deneysel bir boru hattı sağlanmıştır. MW sisteminin yararlılığını göstermek için farelerde omurilik kontüzyon yaralanması modeli kullanılmıştır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yürüme ve koşma gibi karmaşık ve yüksek derecede koordine edilmiş motor programlarının yürütülmesi, spinal ve supra-spinal devrelerin ritmik aktivasyonuna bağlıdır. Torasik omurilik yaralanmasından sonra, yukarı akış devreleri ile iletişim bozulur. Bu da, sınırlı iyileşme potansiyeli ile koordinasyon kaybına yol açar. Bu nedenle, ilaçların veya tedavilerin uygulanmasından sonra iyileşme derecesini daha iyi değerlendirmek için, omurilik yaralanmasının hayvan modellerinde yürüyüş, uzuv koordinasyonu ve lokomotor davranışın diğer ince yönlerini ölçmek için yeni, daha ayrıntılı ve doğru araçlara ihtiyaç vardır. Kemirgenlerde serbest yürüme davranışını nicel olarak değerlendirmek için yıllar içinde çeşitli testler geliştirilmiştir; Bununla birlikte, genellikle adım adım yürüme stratejileri, ayak izi kalıpları ve koordinasyon ile ilgili doğrudan ölçümlerden yoksundurlar. Bu eksiklikleri gidermek için, hayal kırıklığına uğramış bir toplam iç yansıma (fTIR) geçitini izleme ve niceleme yazılımı ile birleştiren MouseWalker'ın güncellenmiş bir sürümü sağlanmıştır. Bu açık kaynaklı sistem, çeşitli grafik çıktıları ve kinematik parametreleri çıkarmak için uyarlanmıştır ve sağlanan çıktı verilerini analiz etmek için bir dizi post-niceleme aracı olabilir. Bu makale ayrıca, halihazırda kurulmuş davranış testleriyle birlikte bu yöntemin, omurilik yaralanmasını takiben lokomotor eksiklikleri nicel olarak nasıl tanımladığını göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dört ekstremitenin etkili koordinasyonu, dörtlü hayvanlara özgü değildir. İnsanlarda ön ayak-arka bacak koordinasyonu, yüzme ve yürürken hız değişiklikleri gibi çeşitli görevleri yerine getirmek için önemini korumaktadır1. Çeşitli ekstremite kinematik2 ve motor programı 1,3,4'ün yanı sıra propriyoseptif geri besleme devreleri5, insanlar ve diğer memeliler arasında korunur ve omurilik yaralanması (SCI) gibi motor bozukluklar için terapötik seçenekleri analiz ederken göz önünde bulundurulmalıdır 6,7,8.

Yürümek için, ön ayaklardan ve arka bacaklardan birkaç omurga bağlantısının düzgün bir şekilde bağlanması ve ritmik olarak aktive edilmesi gerekir, bu da beyinden girdiler ve somatosensoriyel sistemden geri bildirim gerektirir 2,9,10. Bu bağlantılar, sırasıyla 1,9,10 olan ön ayaklar ve arka bacaklar için servikal ve lomber seviyede bulunan merkezi desen üreteçleri (CPG'ler) ile sonuçlanır. Genellikle, SCI'den sonra, nöronal bağlantının bozulması ve inhibitör bir glial skar12 oluşumu, lokomotor fonksiyonun iyileşmesini sınırlar ve sonuçlar, yaralanma şiddetine bağlı olarak toplam felçten bir grup ekstremitenin kısıtlı fonksiyonuna kadar değişir. SCI'den sonra lokomotor fonksiyonu hassas bir şekilde ölçmek için kullanılan araçlar, iyileşmeyi izlemek ve tedavilerin veya diğer klinik müdahalelerin etkilerini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir6.

SCI'nin fare kontüzyon modelleri için standart metrik tahlil, açık alan arenasında gövde stabilitesini, kuyruk pozisyonunu, plantar adımlamayı ve ön ayak-arka bacak koordinasyonunu dikkate alan parametrik olmayan bir skor olan Basso fare ölçeği (BMS) 13,14'tür. BMS çoğu durumda son derece güvenilir olsa da, doğal değişkenliği hesaba katmak ve önyargıyı azaltmak için hayvan hareketinin tüm açılarını gözlemlemek için en az iki deneyimli puanlayıcı gerektirir.

SCI'dan sonra motor performansını nicel olarak değerlendirmek için başka testler de geliştirilmiştir. Bunlar arasında dönen bir silindir15 üzerinde harcanan zamanı ölçen rotarod testi; kaçırılan korkulukların sayısını ölçen yatay merdiven ve pozitif merdiven16,17; ve bir hayvanın dar bir kirişi geçerken aldığı süreyi ve yaptığı başarısızlık sayısını ölçen ışın yürüme testi18. Motor eksikliklerin bir kombinasyonunu yansıtmasına rağmen, bu testlerin hiçbiri ön ayak-arka bacak koordinasyonu hakkında doğrudan lokomotor bilgi üretmez.

Yürüme davranışını spesifik ve daha kapsamlı bir şekilde analiz etmek için, adım döngülerini ve yürüme stratejilerini yeniden yapılandırmak için başka testler geliştirilmiştir. Bir örnek, bir hayvanın mürekkepli pençelerinin bir beyaz kağıt19 sayfası üzerine bir desen çizdiği ayak izi testidir. Uygulanmasında basit olmasına rağmen, adım uzunluğu gibi kinematik parametrelerin çıkarılması hantal ve yanlıştır. Ayrıca, adım döngüsünün süresi veya bacak zamanlı koordinasyon gibi dinamik parametrelerin eksikliği, uygulamalarını sınırlar; Gerçekten de, bu dinamik parametreler yalnızca şeffaf bir yüzeyden geçen kemirgenlerin kare kare videolarını analiz ederek elde edilebilir. SCI çalışmaları için araştırmacılar, adım döngüsünü yeniden yapılandırmak ve her bir bacak ekleminin açısal varyasyonlarını ölçmek de dahil olmak üzere bir koşu bandı kullanarak yanal bir görünümden yürüme davranışını analiz ettiler 4,20,21. Bu yaklaşım son derecebilgilendirici 6 olsa da, belirli bir uzuv kümesine odaklanmaya devam eder ve koordinasyon gibi ek yürüyüş özelliklerinden yoksundur.

Bu boşlukları doldurmak için Hamers ve meslektaşları, hayal kırıklığına uğramış toplam iç yansıma (fTIR)22 kullanan optik bir dokunmatik sensöre dayanan nicel bir test geliştirdiler. Bu yöntemde, ışık iç yansıma yoluyla camdan yayılır, pençeye basıldığında dağılır ve son olarak yüksek hızlı bir kamera tarafından yakalanır. Daha yakın zamanlarda, bu yöntemin MouseWalker adı verilen açık kaynaklı bir sürümü kullanıma sunuldu ve bu yaklaşım bir fTIR yürüyüş yolunu bir izleme ve niceleme yazılım paketi23 ile birleştiriyor. Bu yöntemi kullanarak, kullanıcı adım, uzamsal ve yürüyüş kalıpları, ayak izi konumlandırma ve ön ayak-arka bacak koordinasyonunun yanı sıra ayak izi desenleri (mürekkepli pençe testi6'yı taklit ederek) veya vücut eksenine göre duruş aşamaları gibi görsel çıktılar da dahil olmak üzere çok sayıda nicel parametre çıkarabilir. Daha da önemlisi, açık kaynaklı doğası gereği, MATLAB komut dosyası paketi güncellenerek yeni parametreler çıkarılabilir.

Burada, MouseWalker23 sisteminin daha önce yayınlanan derlemesi güncellenir. En iyi video kalitesini, izleme koşullarını ve parametre alımını elde etmek için gereken tüm adımlarla birlikte nasıl ayarlanacağına dair bir açıklama sağlanır. MouseWalker (MW) çıktı veri kümesinin analizini geliştirmek için ek post-niceleme araçları da paylaşılır. Son olarak, bu aracın kullanışlılığı, omurilik yaralanması (SCI) bağlamında, genel lokomotor performans, özellikle adım döngüleri ve ön ayak-arka bacak koordinasyonu için ölçülebilir değerler elde edilerek gösterilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm elleçleme, cerrahi ve ameliyat sonrası bakım prosedürleri, Instituto de Medicina Moleküler İç Komitesi (ORBEA) ve Portekiz Hayvan Etiği Komitesi (DGAV) tarafından Avrupa Topluluğu yönergelerine (Direktif 2010/63/EU) ve Portekiz hayvan bakımı yasasına (DL 113/2013) uygun olarak 0421/000/000/2022 lisansı kapsamında onaylanmıştır. Bu çalışmada 9 haftalık dişi C57Bl/6J fareler kullanıldı. Çalışmada kullanılan hayvan sayısının en aza indirilmesi ve hayvanların acılarının azaltılması için tüm çabalar gösterilmiştir. MATLAB betiği ve MW yazılımının bağımsız sürümü açık kaynaklıdır ve GitHub'da mevcuttur.
depo (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). MW yazılımı MATLAB R2012b'de geliştirilirken, MATLAB R2022b'de çalışacak şekilde uyarlanmıştır. Şekil 1 , MW'nin analiz iş akışını göstermektedir.

1. MouseWalker (MW) aparatının kurulumu

  1. MW cihazını daha önce23'te açıklandığı gibi monte edin veya deneysel tasarımın özel ihtiyaçlarına uyarlayın (kurulum hakkında daha fazla ayrıntı için Malzeme Tablosu ve Ek Şekil 1'e bakın).
    NOT: Yürüyüş alanı, sıçanlar gibi daha büyük hayvanları barındıracak şekilde genişletilebilir.
  2. Hayvanların yürüdüğü pleksiglasın temiz ve çizilmez olduğundan emin olun. Pürüzsüz bir temizleme bezi kullanın ve pleksiglas zarar verebilecek yüksek konsantrasyonlarda amonyak veya etanol gibi organik çözücülerin kullanımını en aza indirin (% 3 hidrojen peroksit,% 7 etanol veya pleksiglas için uyumlu ve uygun herhangi bir dezenfektan önerilir). Gerekirse, pleksiglas değiştirin.
  3. Yüksek hızlı kamerayı, fTIR sinyallerinin kaydedilmesine yardımcı olduğu için büyük miktarda ışık yakalamak için hızlı bir lens ve geniş bir diyafram açıklığı (yani, daha küçük F-stop değerleri) ile ayarlayın (bkz.
    NOT: Lens, özellikle görüntünün kenarlarında optik bozulmalar oluşturmamalıdır. Optik bozulmalar, bilinen bir desen (örneğin, çizgiler veya kareler) kaydedilerek ve ardından ImageJ / FIJI24'teki blokların boyutunu ölçerek test edilebilir (çizgi aracını kullanın ve ardından Analiz > Ölç'e tıklayın). Örneğin, 1 cm boyutundaki bir karenin hem görüntünün merkezinde hem de kenarlarında aynı piksel boyutlarına sahip olması gerekir. Varyasyonlar %5'ten küçük olmalıdır.
  4. Çok renkli LED ışık şeridini arka plan ışık kutusundan aydınlatın.
  5. Beyaz LED ışık şeridini geçit ışık kutusundan aydınlatın.
    NOT: Renkli bir LED, ayak izi / gövde / arka planın ayırt edilmesini kolaylaştırmak için25 de kullanılabilir.
  6. Oda ışıkları kapalıyken, arka plan ışık kutusunun ve geçitin ışık yoğunluğunu doğrulayın. Gerekirse, bir potansiyometre veya yarı opak plastik kullanarak yoğunluğu ayarlayın. Bunlar, piksel yoğunluğunun aşağıdaki sırayla artması için optimize edilmelidir: hayvanın vücudu < arka planı < ayak izleri.
    1. Hayvanın vücudunun / arka planının / ayak izlerinin piksel yoğunluğunu kontrol etmek için, ImageJ / FIJI24'teki görüntü dizisini açın ve Analiz > Ölç'e tıklayın. Ayak izi sinyali aşırı doygun olmamalıdır, çünkü bu, ayak izinin sınırlarının tanımlanmasını önleyecektir (örneğin, ayak parmakları ve ayak pedleri) (Ek Şekil 2).
  7. Video kayıt yazılımındaki geçitin görüntü kontrastını ayarlayın. Kontrast iki şekilde ayarlanabilir: LED şerit üzerindeki aydınlatmayı karartarak veya artırarak ya da kamera lensi diyafram açıklığını ayarlayarak.
  8. Lensi aynı yükseklikte ve 45° yansıtıcı aynanın merkezinde ve yürüme yoluna dik (90°) olacak şekilde doğru şekilde konumlandırın. Bu, sol-sağ geçit boyunca sürekli orantılı bir görüntü oluşturacaktır.
    NOT: Birden fazla kayıt oturumunda kamera konumunu (mesafe, yükseklik ve yön) değiştirmekten kaçının. Gerekirse, tripodun yerleştirilmesi gereken zemini işaretleyin. Bu, görüntü özelliklerini koruyacaktır.
  9. Lensi pleksiglas yüzeyine odaklayın. Bu, pleksiglas yüzeyine dokunan zarar vermeyen bir nesne kullanılarak test edilebilir.
    NOT: Daha düşük F-stop lens değerlerinde, alan derinliği küçülür ve böylece odaklama zorlaşır.
  10. Kaydedilen videoların piksel yoğunluğunu değiştirebileceğinden, test sırasında tüm ayarların değişmeden kaldığından emin olun.

2. Video edinme

  1. Testten önce farelerin odaya ve aparata aşina olduklarından emin olun. Alışkanlık için en az 1 gün tasarruf edin (gün 0). Aşırı eğitimden kaçınmak için, MW testini diğer davranış testlerinden farklı bir günde (tercihen ertesi gün) gerçekleştirin.
  2. Video kayıt yazılımında, yürüyüş yolunun en az 50 cm'sinin görünür olduğundan emin olun.
  3. Geçit bölgesini kesmek için kayıt ayarlarını yapın. Bu, video boyutunu küçültecek ve video alımını optimize edecektir.
  4. Her oturumdan önce normal bir cetvelin fotoğrafını veya kısa bir videosunu çekin. Santimetre başına düşen piksel sayısı daha sonra videoları kalibre etmek için "ayarlar penceresinde" kullanılacaktır.
  5. Video edinimini başlatın ve yaralanmaları önlemek için kuyruğun tabanını kavrayarak hayvanı yürüyüş yolunun kenarına yerleştirin. Hayvanların platformun en uç noktasına doğru ilerlemesini sağlayın. Düzgün yürüyüş geçişleri sağlamak için video kayıtlarını en az 100 kare / sn ile gerçekleştirin.
    1. Gerekirse, geçit duvarına hafifçe dokunarak veya parmaklarınızı çırparak / çırparak hayvanları hareket etmeleri için motive edin. Bununla birlikte, sonuçları etkileyebileceğinden fiziksel dürtmeden kaçının.
    2. Videoları doğrudan TIFF (LZW sıkıştırma ile), JPEG veya PNG formatında görüntü dizileri olarak kaydedin. Fotoğraf makinesinin ham bir MOV dosyası olarak kaydetmesi durumunda, dosyayı ImageJ / FIJI24'te açıp Dosya > > Görüntü dizisi olarak kaydet'e tıklayarak (veya LosslessCut25 gibi başka bir yazılım kullanarak) videoları görüntü dizilerine dönüştürün.
      NOT: Çoğu hayvan yürüyüş yoluna konduktan hemen sonra yürümeye başlar; Bu nedenle, hayvanı yerleştirmeden önce video edinimine başlanması önerilir.

3. MW izleme yazılımı için videoların hazırlanması

  1. Her bir farenin yeterince eksiksiz çalışmasını filme alın. Koşula göre filme alınacak hayvan sayısı ve tamamlanan koşu sayısına her deneysel tasarıma göre karar verilmelidir. Tam bir çalışma, farenin uzun süre durmadan geçitin 50 cm'sinin tamamını yürüdüğü zamandır (bu deneyde, üç tam çalışma seçilmiştir).
    NOT: Görüntü alma yazılımına bağlı olarak, videoların en küçük YG'ye göre kırpılması gerekebilir. Bu, izleme ve çıktı oluşturma hızını artıracaktır.
  2. ImageJ/FIJI24'te, Image > Stack > Tools (Görüntü Yığınla Araçları) > Make a Substack (Alt Yığın Oluştur) seçeneğine tıklayarak farenin ekranda bulunduğu kareleri seçin. MW'daki izleme, baş ve kuyruğun tüm çerçevelerde görünür olmasını gerektirir. Bununla birlikte, daha sonra her çalıştırmayı temsil edecek tek bir video kaydından birkaç alt yığın oluşturmak mümkündür.
  3. Dosya > Görüntü dizisi olarak kaydet'e tıklayarak her alt yığını ayrı ayrı farklı klasörlere kaydedin>. MW yazılımı daha sonra bir çalıştırmayı analiz etmeye her başladığında her dizinde otomatik olarak bir alt klasör oluşturur.

4. İzleme

  1. MATLAB'ı açın, MW komut dosyasını içeren klasörü çalışma dizinine ekleyin ve ana komut satırında "MouseWalker.m" dosyasını çalıştırın.
    NOT: MATLAB altında MW yazılımının kullanılması, izleme hata mesajlarının MATLAB'ın ana konsolunda görüntülenmesine ve istenen çıktı verilerinin seçilmesine olanak tanır ("MouseEvaluate.m" ana komut dosyasını açarak ve çıktıları 1 veya 0 olarak değiştirerek: excel dosyası, ayak izi grafikleri, duruş izleri ve yürüyüş desenleri).
  2. Video klasörünü "Giriş dizini" olarak yükleyin. Çıktı klasörünü de seçebilirsiniz; ancak, MW yazılımı "Giriş dizini" içinde otomatik olarak "Sonuçlar" adlı yeni bir klasör oluşturduğundan bu bir gereklilik değildir.
  3. "<<", "<", ">>" ve ">" oklarını kullanarak video karelerinin MW yazılımına doğru yüklenip yüklenmediğini kontrol edin.
  4. Tüm kalibrasyon ve eşik parametrelerinin bulunduğu "Ayarlar penceresine" gidin. Bu ayarlar, diğer faktörlerin yanı sıra arka planın ve ayak izlerinin piksel yoğunluğunun yanı sıra gövdenin ve ayak izlerinin minimum boyutuna bağlı olarak değişebilir ( Ek Şekil 2'deki örneğe bakın). Önizleme düğmesine tıklayarak bazı parametreleri değiştirmenin etkisini test edin.
    1. Eşik parametrelerini ayarladıktan sonra vücut parçalarını ayırt etmeye yardımcı olmak için "gövde + ayak + kuyruk", "yalnızca gövde", "yalnızca ayaklar" ve "yalnızca kuyruk" gibi farklı çizim stillerini kullanın.
    2. Parlaklık veya boyut ölçümlerini almak için sağ taraftaki paneldeki araçlardan yararlanın (sırasıyla "parlaklık" ve "cetvel" düğmelerini kullanarak). Fotoğraf makinesi mesafesi aynı kaldığı sürece tüm ayarlar "varsayılan" olarak kaydedilebilir.
  5. Eşik parametrelerini ayarladıktan sonra videonun otomatik izleme için hazır olup olmadığını kontrol edin. İlk kareye gidin ve izlemeye başlamak için Otomatik'e tıklayın. Bu adım gerçek zamanlı olarak takip edilebilir ve videonun boyutuna ve bilgisayarın performansına bağlı olarak birkaç dakika sürer.
    1. Otomatik izleme gövde özelliklerini yanlış etiketliyorsa, otomatik izlemeyi iptal edin, yeni ayarlar girin ve işlemi yeniden başlatın.
  6. İzleme tamamlandıktan sonra, manuel düzeltme gerekip gerekmediğini kontrol edin. Düzeltmek için, orta paneli kullanarak seçin veya seçimini kaldırın ve sağ ön (RF), sağ arka (RH), sol ön (LF) ve sol arka (LH) pençe ayak izlerinin, baş, burun, gövde (iki bölüme ayrılmıştır) ve kuyruk konumlarının (dört bölüme ayrılmıştır) konumunu belirtin. Kaydet düğmesine basarak değişiklikleri kaydedin.
    NOT: Tüm düğmelerin ve çoğu komutun bir tuş kısayolu vardır (ayrıntılar23 için ilgili kılavuza bakın). Video kaydırmayı ve klavye kısayollarının yürütülmesini kolaylaştırmak için, programlanabilir düğmelere sahip bir donanım denetleyicisi ve Contour ShuttlePro V2 gibi bir mekik tekerleği kullanılabilir.
  7. İzlenen videodan çıktı dosyalarını oluşturmak için Değerlendir'e tıklayın. Seçilen istenen çıktıya bağlı olarak (bkz. adım 4.1), bu adım birkaç dakika sürebilir.
  8. Tüm grafik çıktı veri grafiklerinin "Sonuçlar" klasörüne kaydedildiğini kontrol edin. Tüm pençe konumlarının tutarlı olup olmadığını kontrol edebileceğiniz "Duruş izleri" gibi bazı grafik çıktıları inceleyerek izlemenin doğruluğunu doğrulayın.
    1. Bir hata tespit edilirse, izlemeyi manuel olarak düzeltin (mümkünse; aksi takdirde, "Sonuçlar" klasörünü ortadan kaldırın ve otomatik izlemeyi yeni ayarlarla tekrar gerçekleştirin) ve Değerlendirme komutunu tekrar tıklayın.
  9. MW yazılımı tarafından oluşturulan tüm nicel ölçümlerin bir Excel elektronik tablosuna kaydedildiğini ve "1. Info_Sheet". Formül sınırlamaları için excel seçeneklerinin komut dosyasıyla eşleştiğinden emin olun. Ondalık ayırıcı "," olmalı ve bin ayırıcı ";" olmalıdır.
  10. Tüm çalıştırmalardaki ölçümleri analiz için yeni bir dosyada toplamak üzere "MouseMultiEvaluate.m" betiğini kullanın.
    1. Başlamak için, tüm videoların klasör yollarını içeren bir .txt dosyası oluşturun (ör. "Videofiles.txt"). Her satırın tek bir videoya karşılık geldiğinden emin olun.
    2. Ardından, komut satırına "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" yazın. Çalışma dizininde "ResultSummary.xls" adlı bir excel dosyası oluşturulur (GitHub deposundaki bir örneğe bakın).
      NOT: Şekil 2 , MW yazılımı tarafından kaydedilen bir hayvanın videolarından elde edilen grafik çıktıları temsil etmektedir.

5. Kinematik veri analizi iş akışı

  1. Sağlanan Python betiklerini kullanarak işlenecek verileri içeren adım 4.10'da oluşturulan excel sayfasını aşağıdaki önkoşullara göre düzenleyin.
    1. İlk sütun başlığında, deneysel koşulu belirtin. Grup/koşul adından sonraki her satırı adlandırın (aynı gruplardan bireylerin aynı ada sahip olması gerekir). İlk grup kontrol veya taban çizgisi olmalıdır (bu yalnızca ısı haritası çizimi için zorunludur, adım 5.6).
    2. İkinci sütunda, hayvan kimliğini belirtin. Bu zorunludur, ancak bu bilgiler arsa üretimi için kullanılmayacaktır.
    3. Üçüncü sütundan sonra, analiz için kullanılacak motor parametrelerini seçin. İlk satırın parametrenin adı olduğundan emin olun (bu adlar daha sonra grafiklerde görünecektir).
  2. Anaconda Navigator'ı açın ve sağlanan Python betiklerini açmak için Spyder'ı çalıştırın.
    NOT: Tüm komut dosyaları Python 3.9.13 ile geliştirilmiştir, Anaconda Navigator 2.1.4'te Spyder 5.2.2 ile yürütülmüştür ve Malzeme Tablosu ve GitHub deposunda (video örneği, excel örnek dosyası ve SSS belgesi gibi ek materyallerin dahil edildiği) mevcuttur. Komut dosyalarını Anaconda Navigator dışında yürütmek mümkündür; ancak, bu grafik kullanıcı arayüzü daha kullanıcı dostudur.
  3. Ham veri grafiklerini oluşturmak için "Rawdata_PlotGenerator.py" kullanın. Bu, her parametrenin bir hız fonksiyonu olarak görselleştirilmesine izin verecektir.
    1. Spyder'da "Rawdata_PlotGenerator.py" ı açın ve Oynat düğmesine tıklayarak kodu çalıştırın.
    2. Analiz edilecek Excel dosyasını ve otomatik pencerede sayfa adını seçin. Sayfa adı değiştirilmemişse, "Sheet1" yazın.
    3. Ham veri grafikleri, çizim konsolunda (sağ üst panel) görünecektir. Grafikleri kaydetmek için, çizim konsolundaki Resmi kaydet veya Tüm görüntüleri kaydet düğmesine tıklayın.
  4. Veri analizi için artıkları hesaplamak üzere "Residuals_DataAnalysis" betiğini kullanın. Bu komut dosyası, tüm motor parametreleri için artıkların hesaplamalarını içeren bir CSV dosyası oluşturur.
    NOT: MW tarafından çıkarılan ölçülen yürüyüş parametrelerinin çoğu hıza göre değişir (örneğin, dönüş hızı, adım uzunluğu, duruş süresi, duruş düzlüğü ve yürüyüş indeksleri). Bu nedenle, temel deney için hıza karşı her bir parametrenin en uygun regresyon modelinin gerçekleştirilmesi ve ardından bu regresyon modeliyle ilişkili olarak her bir deney grubu için artık değerlerin belirlenmesi önerilir. Veriler daha sonra artık normalleştirilmiş satır26'dan fark olarak ifade edilir.
    1. Spyder'da "Residuals_DataAnalysis.py" ı açın ve Oynat düğmesine tıklayarak kodu çalıştırın.
    2. Analiz edilecek Excel dosyasını ve otomatik pencerede sayfa adını seçin. Sayfa adı değiştirilmemişse, "Sheet1" yazın.
    3. CSV dosyasını verilerle aynı klasöre kaydedin. Denetimin (veya temelin) Excel dosyasındaki ilk grup olması zorunludur.
  5. Ana bileşen analizi (PCA) gerçekleştirmek için "PCA_PlotGenerator.py" komut dosyasını kullanın.
    NOT: Bu denetimsiz boyutsallık azaltma yöntemi, verilerin 27,28,29 daha özlü bir temsilini oluşturmak için kullanılır (Şekil 3A, B). PCA komut dosyası aşağıdaki adımları içerir. Veriler önce merkezleme ve ölçeklendirme ile önceden işlenir, daha sonra PCA algoritması değişkenler arasındaki korelasyonları belirlemek için kovaryans matrisini hesaplar ve ana bileşenleri tanımlamak için kovaryans matrisinin özvektörlerini ve özdeğerlerini hesaplar. İlk iki veya üç ana bileşen, verilerin sırasıyla 2B veya 3B grafiklerde gösterilmesi için seçilir. Grafiklerdeki her nokta bir hayvana karşılık gelir ve farklı bir soyut değişkeni temsil eder. Renk kodlu noktalar, belirli grupları ayırt etmek için kullanılır. Bu nedenle, nokta kümeleri, ilgili bireyler tarafından paylaşılan benzer yürüyüş modellerini yansıtır.
    1. Spyder'da "PCA_PlotGenerator.py" ı açın ve Oynat düğmesine tıklayarak kodu çalıştırın.
    2. Analiz edilecek Excel dosyasını ve otomatik pencerede sayfa adını seçin. Sayfa adı değiştirilmemişse, "Sheet1" yazın.
    3. PCA 2B ve 3B grafiklerin çizim konsolunda (sağ üst panel) göründüğünden emin olun. Her renk farklı bir grubu temsil eder ve gösterge grafiğin yanında görünür. Grafiği kaydetmek için, çizim konsolunda Resmi kaydet'e tıklayın.
  6. Bir ısı haritası oluşturmak için "Heatmap_PlotGenerator.py" kullanın. Isı haritası üretecinin, her motor parametresi27 için taban çizgisi grubu (veya kontrol grubu) ile diğer gruplar arasındaki istatistiksel farkları gösteren bir tablo oluşturduğundan emin olun (Şekil 4). Her sütun bir grubu gösterir ve her satır belirli bir motor parametresiyle ilişkilidir.
    NOT: İstatistiksel analiz, tek yönlü bir ANOVA ve ardından Tukey'in post hoc testi (normal dağılımlar için) veya Kruskal-Wallis ANOVA ve ardından Dunn'un post hoc testi (normal olmayan dağılımlar için) ile gerçekleştirilmiştir. Aykırı değerler analizin dışında bırakıldı. P değerleri, kırmızı ve mavi tonları sırasıyla kontrole (veya taban çizgisine) göre bir artış veya azalış gösteren bir renk koduyla temsil edilir. Renk tonu istatistiksel anlamlılığı temsil eder, koyu renkler daha yüksek bir önem gösterir ve daha açık renkler daha düşük bir önem gösterir. P < 0.001'e karşılık gelir; ** P < 0,01'e karşılık gelir; ve * P < 0,05'e karşılık gelir. Beyaz, varyasyon olmadığını gösterir.
    1. Spyder'da "Heatmap_PlotGenerator.py" yi açın ve Oynat düğmesine tıklayarak kodu çalıştırın.
    2. Analiz edilecek Excel dosyasını ve otomatik pencerede sayfa adını seçin. Sayfa adı değiştirilmemişse, "Sheet1" yazın.
    3. İkinci otomatik pencerede veri türünü seçin: ham veriler veya artık veriler. Bir seçenek belirlenmezse, artık veriler varsayılan değerdir.
    4. Isı haritası çizim konsolunda (sağ üst panel) görünecektir. Grafiği kaydetmek için, çizim konsolunda Resmi kaydet'e tıklayın.
      Not: denetimin (veya temel) Excel dosyasındaki ilk grup olması zorunludur.
  7. Kutu grafiklerini oluşturmak için "Boxplots_PlotGenerator.py" kullanın. Bu araç, her grup için tüm motor parametreleri için değerlerin dağılımını temsil eden kutu grafiklerinin oluşturulmasına izin verecektir (Şekil 5, Şekil 6 ve Şekil 7).
    NOT: Her kutu orta çizgi olarak medyanı içerir ve kutuların alt ve üst kenarları sırasıyla% 25 ve% 75 çeyreği temsil eder. Bıyıklar, aykırı değerler hariç olmak üzere tüm veri kümesinin aralığını temsil eder. Aykırı değerler, sırasıyla %25 ve %75'lik çeyreklerin altında veya üstünde çeyrekler arası aralığın 1,5 katı olan herhangi bir değer olarak tanımlanır.
    1. Spyder'da "Boxplots_PlotGenerator.py" yi açın ve Oynat düğmesine tıklayarak kodu çalıştırın.
    2. Analiz edilecek Excel dosyasını ve otomatik pencerede sayfa adını seçin. Sayfa adı değiştirilmemişse, "Sheet1" yazın.
    3. İkinci otomatik pencerede veri türünü seçin: ham veriler veya artık veriler. Bir seçenek belirlenmezse, artık veriler varsayılan değerdir.
    4. Kutu grafikleri çizim konsolunda görünecektir (sağ üst panel). Grafikleri kaydetmek için, çizim konsolundaki Resmi kaydet veya Tüm görüntüleri kaydet düğmesine tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standart BMS sistemi, SCI14'ten sonraki brüt motor açıklarını tanımlar. Öznel doğası nedeniyle, diğer nicel testler genellikle hareketin daha ayrıntılı ve ince bir değerlendirmesini üretmek için BMS ile birlikte gerçekleştirilir. Bununla birlikte, bu testler adım döngüleri, basamak paternleri ve ön ayak-arka bacak koordinasyonu hakkında spesifik bilgiler gösterememektedir; bu, omurga devresinin işlevini nasıl koruduğunu ve eksik bir SCI'ye nasıl uyum sağladığını anlamada son derece önemlidir. Bu b...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, MouseWalker yönteminin potansiyeli, SCI sonrası lokomotor davranışı analiz ederek gösterilmiştir. Adımlama, ayak izi ve yürüme modellerinde aksi takdirde diğer standart testler tarafından kaçırılacak belirli değişiklikler hakkında yeni bilgiler sağlar. MW paketinin güncellenmiş bir sürümünü sağlamanın yanı sıra, veri analiz araçları da sağlanan Python betikleri kullanılarak açıklanmaktadır (bkz. adım 5).

MW, büyük bir veri kümesi ve yüksek boyutlu bir lokomotor süreci yansıtan bir kine...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Laura Tucker ve Natasa Loncarevic'e el yazması hakkındaki yorumları ve Instituto de Medicina Moleküler João Lobo Antunes Kemirgen Tesisi tarafından verilen destek için teşekkür eder. Yazarlar, Prémios Santa Casa Neurociências - Omurilik Yaralanması Araştırmaları için Melo e Castro Ödülü (MC-36/2020) tarafından L.S. ve C.S.M.'ye finansal destek sağlamak istiyor. Bu çalışma Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 ve UIDP/04462/2020) ve LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) tarafından C.S.M. L.S.'ye CEEC Bireysel Baş Araştırmacı sözleşmesi (2021.02253.CEECIND) ile desteklenmiştir. A.F.I., FCT'den (2020.08168.BD) doktora bursu ile desteklenmiştir. A.M.M., FCT'den doktora bursu ile desteklenmiştir (PD/BD/128445/2017). I.M., FCT'den doktora sonrası bir burs ile desteklenmiştir (SFRH / BPD / 118051 / 2016). D.N.S., FCT'den doktora bursu ile desteklenmiştir (SFRH / BD / 138636 / 2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< güçlü>45º Ayna 
2 alüminyum ekstrüzyon (2 x 2 cm), 16 cm yükseklik, her iki tarafta 1Misumi
2 alüminyum ekstrüzyon (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45& derece; , her iki tarafta 1Misumi
1 alüminyum ekstrüzyon (2 x 2 cm), 83 cm uzunluğundaMisumi
87 x 23 cm aynaGenel cam tedarikçisi ve nbsp;
Siyah karton dolgu Genel kırtasiye tedarikçisiAynadaki yansımayı sınırlamak için biri 69 x 6 cm, diğeri 69 x 3
Arka plan arka ışığı
109 x 23 cm pleksiglas (0,9525 cm kalınlığında)Geneldonanım tedarikçisi
2 yanal alüminyum ekstrüzyon (4 x 4 cm), 20 cm uzunluğunda, her iki tarafta 1adet Misumi
çok renkli LED şeritGenel donanım tedarikçisi
pleksiglası kaplamak için beyaz opak kağıtGenel kırtasiye tedarikçisi
fTIR Destek tabanı ve direkleri
2 alüminyum ekstrüzyon (4 x 4 cm), 100 cm yükseklikMisumi
60 x 30 cm metrik breadboardEdmund Optics # 54-641
M6 12 mm vidalarEdmund Optik 
M6 altıgen somun ve wahersEdmund Optics 
fTIR Yürüyüş Yolu 
109 x 8,5 cm pleksiglas (1,2 cm kalınlığında)Genel donanım tedarikçisi109 x 8,5 cm pleksiglas (1,2 cm kalınlığında)
109 cm uzunluğunda 1,6 cm yükseklik x 1,9 cm derinlikte kıvrımlı Base-U-kanal alüminyum (pleksiglası tutmak için)Genel donanım tedarikçisi
2 yanal alüminyum ekstrüzyon (4 x 4 cm) 20 cm uzunluk, her iki tarafta 1adet Misumi
Siyah karton dolgu Genel kırtasiye tedarikçisi, parlak kenarlardan kaçınarak pleksiglasın sınırlarını kapatmak için her iki tarafta 2 dolgu maddesi kullandık
M6 12 mm vidalarEdmund Optics 
Yüksek hızlı kamera (tripod üzerinde)
Blackfly S USB3FLIR#BFS-U3-32S4M-CBu bir tavsiyedir. Gereksinim, saniyede en az 100 kare kaydetmektir
Infinite Horizon Impactor 
Infinite Horizon Impactor Hassas Sistemler ve Enstrümantasyon, LLC.#0400
Lens
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mmNikon#1929Bu lens önerilir, ancak diğer lensler de kullanılabilir. fTIR sinyallerini yakalamak için geniş bir diyafram açıklığı (yani daha küçük F-stop değerleri) içerdiğinden emin olun
Software
MATLAB R2022bMathWorks
Python 3.9.13 Python Yazılım Vakfı
Anaconda Navigator 2.1.4Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5 Spyder Projesi Katkıda Bulunanlar
Walkway wall 
100 x 15 cm'lik 2 büyük dikdörtgen akrilikHerhangi bir brikolaj marketi
6-10 uzunluk x 15 cm yüksekliğinde 2 Trapez akrilik lateralHerhangi bir brikolaj marketi
GitHub Materials
Klasör adıURL
Boxplotshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/BoxplotsBoxplots oluşturmak için Script
Dokümanlarhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/DocsEk belgeler
Isı Haritasıhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/HeatmapsIsı haritası oluşturmak için komut dosyası
Matlat komut dosyasıhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20ScriptMouseWalker matlab komut dosyası
PCAhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plotsTemel Bileşen Analizi gerçekleştirmek için Komut Dosyası
Ham veri Grafiklerihttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20PlotsHam veri grafikleri oluşturmak için komut dosyası
Artık Analizhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_AnalysisHam verilerden artıkları hesaplamak için kod
cm olmak üzere 2 kullandık

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
  2. Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
  3. Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
  4. Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
  5. Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
  6. Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
  7. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  8. Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
  9. Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
  10. Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741(2020).
  11. Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
  12. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
  13. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  14. Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  15. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  16. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204(2009).
  17. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  18. Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
  19. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  20. Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
  21. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  22. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  23. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50(2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002(2021).
  26. Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204(2014).
  27. Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541(2022).
  28. Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
  29. vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
  30. Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
  31. Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
  32. Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
  33. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  34. Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
  35. Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356(2020).
  36. Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MouseWalker SystemSpinal Cord InjuryLocomotor DysfunctionGait QuantificationMouse ModelMotor CoordinationKinematic AnalysisBehavioral AssaysOpen Source ToolsFootprint Patterns

Related Articles