Genç farelerde kronik tetrod kayıtları için hafif tahrikli bir implant

Beyin, çocukluk ve ergenliğin kritik gelişim pencerelerinde büyük ölçekli değişikliklere uğrar ^1,2,3. Otizm ve şizofreni de dahil olmak üzere birçok nörolojik ve psikiyatrik hastalık, ilk olarak çocuk ve ergen beyin gelişiminin bu döneminde davranışsal ve biyolojik olarak kendini gösterir ^4,5,6. Erken gelişim boyunca meydana gelen hücresel, sinaptik ve genetik değişiklikler hakkında çok şey bilinmesine rağmen, devre veya ağ seviyesindeki süreçlerin bu zaman penceresi boyunca nasıl değiştiği konusunda nispeten az şey bilinmektedir. Daha da önemlisi, nihayetinde karmaşık davranışların, hafızanın ve bilişin altında yatan devre düzeyinde beyin fonksiyonu, hücresel ve sinaptik fonksiyonun öngörülemez, ortaya çıkan bir özelliğidir 7,8,9,10. Bu nedenle, ağ düzeyinde beyin fonksiyonunu tam olarak anlamak için, nöral aktiviteyi sağlam bir sinir devresi seviyesinde doğrudan incelemek gerekir. Ek olarak, nöropsikiyatrik bozuklukların ilerlemesi boyunca beyin aktivitesinin nasıl değiştiğini belirlemek için, hastalığın davranışsal fenotiplerinin ortaya çıktığı spesifik zamansal pencere sırasında ağ aktivitesini geçerli bir hastalık modelinde incelemek ve gözlemlenen değişiklikleri yetişkinliğe kadar devam ettikçe izlemek çok önemlidir.

En yaygın ve güçlü bilimsel model organizmalardan biri, davranışsal ve / veya anımsatıcı fenotiplerin yaşa bağlı başlangıcı ile nörogelişimsel bozuklukları modelleyen çok sayıda benzersiz genetik suşa sahip faredir 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . İnsanların ve farelerin beyinleri arasındaki kesin gelişimsel zaman noktalarını ilişkilendirmek zor olsa da, morfolojik ve davranışsal karşılaştırmalar, p20-p21 farelerinin 2-3 yaş arası insan yaşlarını temsil ettiğini ve p25-p35 farelerinin 11-14 yaş arasındaki insan yaşlarını temsil ettiğini, farelerin muhtemelen 20 yaşındaki bir insan yetişkininin gelişimsel eşdeğerine p60³ ile ulaştığını göstermektedir^{. 22}. Bu nedenle, genç beynin nasıl geliştiğini daha iyi anlamak ve beynin sinir ağlarının otizm veya şizofreni gibi hastalıklarda nasıl işlevsiz hale geldiğini belirlemek için, 20 günlük ila 60 günlük yaşlar arasındaki farelerde beyin aktivitesini in vivo olarak doğrudan izlemek ideal olacaktır.

Bununla birlikte, farelerde erken gelişim boyunca beyin aktivitesini izlemede temel bir zorluk, genç farelerin küçük boyutu ve göreceli zayıflığıdır. Beyin gelişiminin uzunlamasına çalışmaları için gerekli olan elektrotların kronik implantasyonu, ince elektrot tellerini ve arayüz kartlarını^23,24 korumak için tipik olarak büyük, hacimli bir muhafaza gerektirir ve implantlar^, kemikleşmenin azalması nedeniyle genç farelerde daha ince ve daha az sert olan fare kafatasına sıkıca tutturulmalıdır. Bu nedenle, in vivo kemirgen fizyolojisi ile ilgili hemen hemen tüm çalışmalar, göreceli büyüklükleri, güçleri ve kafatası kalınlıkları nedeniyle yetişkin deneklerde gerçekleştirilmiştir. Bugüne kadar, in vivo juvenil kemirgen beyin fizyolojisini araştıran çoğu çalışma, vahşi tip genç sıçanlarda gerçekleştirilmiştir; bu, bir insan bozukluğunun serbestçe davranan bir modelinde genç beyin fonksiyonunu deneysel olarak izleme yeteneğini mutlaka sınırlar 25,26,27,28,29,30.

Bu makalede, gelişimsel olarak kritik bir zaman penceresinde (p20 ila p60 ve ötesi) genç farelerin uzun vadeli (4 veya daha fazla haftaya kadar) in vivo beyin fonksiyonlarını kronik olarak incelemek için yeni implant yuvası, cerrahi implantasyon prosedürü ve ameliyat sonrası iyileşme stratejisi açıklanmaktadır. İmplantasyon prosedürü, elektrotların genç farelerin kafataslarına güvenilir, kalıcı bir şekilde yapıştırılmasını sağlar. Ayrıca, mikro sürücü tasarımı hafiftir, çünkü bu mikro sürücü tamamen monte edildiğinde ~ 4-6 g ağırlığındadır ve implantın ağırlığını dengelemek için gereken minimum dengeleme nedeniyle, tipik davranışsal paradigmalar sırasında genç farelerin davranışsal performansını etkilemez.

Bu çalışma, Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (protokol 2015-100867) tarafından onaylanmış ve hem kurumsal hem de Ulusal Sağlık Enstitüsü kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan C57 / Bl6 erkek ve dişi fareler p20'ye implante edildi (implantasyon sırasında ağırlık 8.3-11.1 g).

1. Mikro sürücü tasarımı ve yapımı

1. Mikro sürücünün dijital olarak tasarlanması ve yazdırılması (Şekil 1)
   1. Mikro sürücü modeli şablonlarını (https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive) indirin.
   2. Hedef beyin bölgelerinin stereotaksik yerlerini uygun bir stereotaksik atlasta tanımlayın.
   3. Üç boyutlu bilgisayar destekli tasarım (3D CAD) yazılımını kullanarak, şablon mikro sürücü kanülünü yükleyin (Şekil 1B).
   4. Gerekirse, istenen beyin bölgelerini hedeflemek için mikro sürücülü kanül modelindeki çıkış kanülü çıkış konumlarını değiştirin.
      NOT: Her kanül deliği ekstrüzyonu, tetrodun doğrudan hedefe yönelik kanül deliğinden çıkmasını sağlamak için en az 2 mm uzunluğunda olmalıdır. Mikro sürücülü kanül şablonu, anterior singulat korteksi (yarım küre başına bir tetrod), hipokampal alan CA1'i (yarım küre başına dört tetrod) ve hipokampal alan CA3'ü (yarım küre başına iki tetrod) iki taraflı olarak hedeflemek üzere tasarlanmıştır ve hipokampal alan CA1'in üzerindeki beyaz cevherde yer alan yarım küre başına bir referans tetrod bulunur.
   5. Gerekirse, mikro sürücü gövdesini (Şekil 1A) elektronik arabirim kartının (EIB) bağlanmasına uyacak şekilde değiştirin.
   6. Mikro sürücü gövdesini, kanülü, koniyi ve kapağı bir 3D yazıcıda yüksek çözünürlükte (ideal olarak 25 μm'den daha iyi bir çözünürlükle) yazdırın ve basılı malzemeleri üreticinin protokollerine göre hazırlayın. Yüksek sertlikte yazıcı reçineleri kullanın.
2. Özel vidaların ve ataşmanların montajı (Şekil 2A, B)
   1. 3B CAD yazılımını kullanarak vidalı bağlantı modellerini yükleyin (Şekil 1E).
   2. Vida ataşmanlarını bir 3D yazıcıda yüksek çözünürlükte yazdırın (ideal olarak en az 25 μm çözünürlükte) ve basılı malzemeleri üreticinin protokollerine göre hazırlayın. Yüksek sertlikte yazıcı reçineleri kullanın.
   3. Vida ataşmanlarını her bir tetrod ilerleyen vidaya yapıştırın (Şekil 1F) (tetrod ilerleyen vidalar, mikro tahrik yapımından önce bir makine atölyesinde özel olarak üretilir).
      1. Her vidaya, biri sırtın üstünde diğeri aşağıda olmak üzere iki vida ataşmanı takın. Her vidalı ataşmanın tabanının sırta temas ettiğinden emin olun. Vida ataşmanlarını jel siyanoakrilat ile birlikte tutun.
      2. Yapıştırıldıktan sonra, vida ataşmanlarının vidanın uzunlamasına ekseninde hareket etmediğinden, ancak minimum dirençle serbestçe döndüğünden emin olun.
3. Mikro sürücü gövdesinin montajı (Şekil 2C, D)
   1. İnce, keskin makas kullanarak, büyük poliimid boruları (dış çap: 0.2921 mm, iç çap: 0.1803 mm) ~ 6 cm uzunluğunda bölümler halinde kesin.
   2. Büyük poliimid bölümlerini mikro sürücü kanülü üzerindeki çıkış deliklerinden geçirin, böylece her tüp kanülün tabanının ötesine birkaç milimetre kadar uzanır.
   3. Temiz bir 30 G iğne kullanarak, az miktarda sıvı siyanoakrilat uygulayarak poliimid'i kanüle yapıştırın. Siyanoakrilatın poliimid tüpün içine girmesine izin vermemeye dikkat edin.
      NOT: Sıvı siyanoakrilatın tahrik gövdesinin üst kısmından kanüle damlatılması bu işlemi hızlandırabilir, ancak kılavuz deliklerinin daha sonra ince uçlu bir matkapla yeniden temizlenmesini gerektirecektir.
   4. Büyük poliimid tüplerini mikro sürücü kanülünün üstünden mikro sürücü gövdesindeki uygun büyük poliimid deliklerinden geçirin.
   5. Mikro sürücü kanülünü ve mikro sürücü gövdesini bitişik olana ve kanül/gövde bağlantı tırnakları birbirine kenetlenene kadar yavaşça birlikte itin. İşlemdeki poliimid tüpleri bükülmemeye veya zarar vermemeye dikkat edin.
      NOT: Her bir poliimid tüpü, kanülün altından mikro sürücü gövdesinin üstünden sorunsuz bir şekilde geçmelidir. Hafif bükülme normaldir, ancak poliimid tüpünün aşırı bükülmesi tetrodu çarpıtabilir ve doğrudan beyne geçmesini önleyebilir.
   6. Mikro sürücü gövdesini ve mikro sürücü kanülünü siyanoakrilat kullanarak birbirine yapıştırın.
   7. Yeni, keskin bir tıraş bıçağı kullanarak, kanül çıkış deliklerinin altından ekstrüzyon yapan büyük poliimid tüp uçlarını kesin. Kesimin tam olarak kanülün tabanında olduğundan emin olun, tüpleri ve kanül tabanını birbiriyle aynı hizada yapın.
   8. Keskin makas kullanarak, tahrik gövdesinin iç kenarının hemen üstündeki büyük poliimid boruyu ~ 45° açıyla kesin.
4. Monte edilmiş özel vidaların takılması (Şekil 2E)
   1. Montajlı her özel vidayı mikro sürücü gövdesinin dış deliklerine vidalayın. Vidalı kılavuz direğin vidalı ataşmanlardaki büyük delikten geçtiğinden emin olun. Daha fazla ilerlemeyene kadar her vidayı tamamen ilerletin. Vidaların mineral yağ veya aks gresi ile önceden yağlanması önerilir.
   2. Son derece keskin makas kullanarak, küçük poliimid boruları (dış çap: 0.1397 mm, iç çap: 0.1016) ~ 4 cm uzunluğunda bölümler halinde kesin.
   3. Küçük poliimid bölümleri, mikro sürücüye zaten monte edilmiş olan büyük poliimid borudan geçirin. Aşırı küçük poliimid borunun, her büyük poliimid tüpün üstünden ve altından çıkıntı yaptığından emin olun.
   4. Küçük poliimid tüpleri, siyanoakrilat yoluyla vida ataşmanlarına yapıştırın, herhangi bir siyanoakrilatın büyük veya küçük poliimid tüplere girmesine izin vermemeye dikkat edin.
   5. Yeni, keskin bir tıraş bıçağı kullanarak, kanül deliklerinin dibinden ekstrüzyon yapan küçük poliimid tüp uçlarını kesin. Kesimin tam olarak kanülün tabanında olduğundan ve kesimin temiz olduğundan, poliimid tüp deliğini engelleyen hiçbir şey olmadığından emin olun.
   6. Keskin makas kullanarak, küçük poliimidin üst kısmını, vida ataşmanının üstünden birkaç milimetre yukarıda ~ 45 ° 'lik bir açıyla kesin. Kesimin temiz olduğundan ve poliimid tüp deliğini hiçbir şeyin engellemediğinden emin olun.
5. Tetrodların yüklenmesi
   1. Tetrodları (~ 6 cm uzunluğunda) daha önce tarif edilen yöntemleri kullanarak hazırlayın³¹.
   2. Seramik veya kauçuk uçlu forseps kullanarak, küçük poliimid tüplerinden birinden bir tetrodu dikkatlice geçirin ve küçük poliimid tüpün üstünden ~ 2 cm çıkıntı bırakın.
   3. Tetrodü, sıvı siyanoakrilat yoluyla küçük poliimid tüpünün üstüne yapıştırın, işlem sırasında küçük ve büyük poliimid tüplerini birbirine yapıştırmamaya dikkat edin.
   4. Vidayı sürücünün üst kısmına yakın olana kadar geri çekin.
   5. Sürücünün altından çıkıntı yapan tetrod telini tutun ve kanülden çıktığı noktada yavaşça bükün.
   6. Vidayı sürücüye tamamen geri itin.
   7. Çok keskin makas kullanarak, tetrod telini kıvrımın hemen üstünde kesin. Mikroskop altında, kesimin temiz olduğundan ve dört tetrodun metalinin açığa çıktığından emin olun.
   8. Tetrod kanül içine sabitlenene kadar vidayı geri çekin.
   9. Tüm vidalar için 1.5.2-1.5.8 adımlarını tekrarlayın.
   10. AYB'yi küçük mücevher vidalarıyla AYB destek platformuna takın.
   11. Her tetrodun her elektrodunu AYB üzerindeki uygun porta bağlayın.
6. Mikro sürücünün ameliyat için hazırlanması
   1. Daha önce tarif edilen yöntemleri kullanarak elektriksel empedansı azaltmak için tetrodları elektriksel olarak plakalayın³¹.
   2. Kaplamadan sonra, her bir tetrodun kanül içine yerleştirildiğinden emin olun, böylece tetrodun ucu her kanül deliğinin tabanıyla aynı hizada olur.
   3. Mikro sürücü konisini tamamlanan mikro sürücünün etrafında kaydırın. Koni bağlantı direğini kapak bağlantı noktasına kaydırarak mikro sürücü kapağını mikro sürücü konisine takın.
   4. Koniyi, kapak kapalıyken EIB konektörlerinin EIB bağlantı geçiş deliklerinden serbestçe geçeceği şekilde yönlendirin ve koniyi, koninin tabanının etrafına yerleştirilmiş siyanoakrilat ile yerine yapıştırın, herhangi bir siyanoakrilatın kanül çıkış deliklerinden herhangi birine girmesine izin vermemeye dikkat edin. Kapağı çıkarın.
   5. Cerrahi implantasyondan sonra vücut sıvılarının poliimid deliklerine girmesini önlemek için her kanül deliğini steril mineral yağ ile dikkatlice doldurun.
   6. Kanülün tabanını steril petrol jölesi ile dikkatlice kaplayın. Bu, kimyasal ajanların (örneğin, diş çimentosu) ameliyat sırasında maruz kalan beyne girmesini önlemek için bir bariyer görevi görecektir.
   7. Eşit ağırlıkta bir denge dengesi hazırlamak için tamamen monte edilmiş mikro sürücüyü, kapağı ve dört kemik vidasını tartın.
   8. İsteğe bağlı olarak, ameliyattan önce, sürücü kafatası ile aynı hizada olduğunda, tetrodları hedef beyin bölgelerine ulaşmak için uygun bir mesafede ekstrüde edin.
      NOT: Cerrahi implantasyondan önce, implantı etilen oksitte (500-1200 mg / L, 2-4 saat) gaz sterilizasyonu yoluyla sterilize edin.  Tüm kemik vidaları ve cerrahi aletler otoklav ile sterilize edilmelidir (121°C, 30 dakika).

2. Cerrahi implantasyon

1. Fareyi anestezi altına almak ve stereotaksik cihaza monte etmek
   1. Fareyi hareket ettirmek için yeterli alana sahip küçük bir kutuya yerleştirin ve fareyi% 3 -% 4 izofluran ile uyuşturun.
      NOT: Diğer anestezik ajanlar kullanılabilir, ancak yavru fare deneğinin yaşı, boyutu ve ağırlığı nedeniyle dikkatli olunmalıdır.
   2. Fare yanıt vermediğinde (kuyruk sıkışmasına yanıt yok, dakikada ~ 60 nefes havalandırma hızı), kutudan çıkarın ve stereotaksik cihaza hızla monte edin.
   3. Hızlıca, stereotaksik maskeyi farenin burnunun üzerine yerleştirin ve% 1-3 izofluranda anesteziyi koruyun. İlk cerrahi insizyondan önce, sürekli salınımlı buprenorfin (0.05-0.5 mg / kg deri altı) veya karprofen (5-10 mg / kg deri altı) gibi anti-enflamatuar ajanlar gibi veteriner onaylı herhangi bir ağrı kesici uygulayın.
   4. Kulaklık çubuklarını kullanarak farenin kafasını stereotaksik aparatına tamamen sabitleyin. Farenin kulak kanallarına gereksiz baskı uygulamadan kafatasının düz ve hareketsiz olduğundan emin olun. Genç kafatası kemiklerinin sınırlı kemikleşmesi nedeniyle, kafa fiksasyonu sırasında kalıcı hasara neden olmak mümkündür.
2. Fareyi ameliyata hazırlamak ve kafatasını açığa çıkarmak
   1. Her göze az miktarda sentetik gözyaşı jeli yerleştirerek ve her gözü otoklavlanmış bir folyo yamasıyla kaplayarak farenin gözlerini koruyun.
      NOT: Sentetik gözyaşları gözleri nemli tutarken, folyo herhangi bir ışık kaynağının uzun süreli hasara neden olmasını önleyecektir. Daha kalın sentetik gözyaşı solüsyonları, diğer potansiyel olarak toksik cerrahi çözeltilerin (etanol, diş akriliği, vb.) gözlere yanlışlıkla sokulmasına engel teşkil edebileceğinden tercih edilir.
   2. Steril pamuk uçlu çubuklar kullanarak, saçları kafa derisinden çıkarmak için cerrahi bölgeye epilasyon kremi sürün. Kremi gözlerin yanına getirmemeye dikkat edin. Saçı çıkardıktan sonra, cerrahi alanı sabitlemek için kafa derisinin üzerine steril bir örtü yerleştirin.
   3. Steril pamuk uçlu çubuklar kullanarak, kafa derisini üç ardışık povidon-iyot (% 10) çözeltisi ve ardından izopropil alkol (% 100) ile temizleyin.
   4. Steril bir neşter veya ince makas kullanarak, kafa derisini çıkarın.
   5. Steril pamuk uçlu çubuklar ve steril tuzlu su çözeltisi (% 0.9 NaCl) ve hidrojen peroksit çözeltileri kullanarak kafatasını iyice temizleyin.
   6. Bregma'yı tanımlayın ve stereotaksik aparatı kullanarak, kafatasındaki hedef kayıt yerlerini kalıcı bir işaretleyici ile dikkatlice işaretleyin.
3. Kanül deliğinin açılması ve kemik ankrajlarının takılması
   1. Kayıt bölgelerinin üzerini kaplayan kafatasını çıkarın. # Bu yaşta kafatasının inceliğinden dolayı kafatasını neşter bıçağı ile kesin; Bu, altta yatan duraya zarar verebilecek bir matkap kullanma zorunluluğunu ortadan kaldırır. Steril tuzlu su çözeltisi (% 0.9 NaCl) veya steril mineral yağ uygulamasıyla açıkta kalan durayı nemli tutun. Bu aşamada durayı çıkarmayın veya delmeyin, çünkü genç farelerde tetrodların gelecekteki adımlarda geçmesi için yeterince incedir.
   2. Dört kemik vidası için pilot delikleri dikkatlice açın.
      1. Kemik vidalarını, kafatasının kemiğin en kalın olduğu ve kemik vidalarının mikro sürücü implantından yeterince uzakta olduğu aşırı lateral ve rostral veya kaudal kısımlarına yerleştirin. Kemik vidaları için steril, ince mücevher vidaları kullanın (örneğin, UNM 120 dişli, 1,5 mm kafa).
      2. Bir kemik vidasını, toprak görevi görecek ve adım 2.4.6'da AYB'ye tutturulacak ince, oldukça iletken bir tel ile sıkıca sarın.
   3. Bir neşter bıçağı kullanarak veya bir matkap ucu kullanarak dikkatlice kafatasını kemik vida deliği konumlarının yakınında puanlayın. Puanlama, sıvı siyanoakrilatın adım 2.3.5'te bağlanması için yeterince pürüzlü bir yüzey sağlamak için önemlidir.
   4. Steril bir tornavida ve steril vidalı kelepçe kullanarak, her steril kemik vidasını yerine geçirin ve altta yatan durayı delmemeye dikkat edin.
   5. Steril bir 30 G iğne kullanarak, her kemik vidasının etrafına sıvı siyanoakrilat yerleştirin. Bu, kemik vidalarının takıldığı kafatasını etkili bir şekilde kalınlaştırır. Herhangi bir siyanoakrilatın kayıt bölgelerinin üzerindeki açıkta kalan duraya girmesine izin vermemeye dikkat edin.
4. Mikro sürücünün indirilmesi ve takılması (Şekil 2G)
   1. Tamamlanan mikro sürücüyü, fare kafatasına dikkatlice indirilmek üzere stereotaksik aparata monte edin. Mikro sürücü kanülünün indirildiğinde uygun koordinatlarda olacağından emin olun.
   2. Mikro sürücüyü yavaşça indirin, sadece dorsal / ventral yönde hareket edin. Beyne girişlerini görselleştirmek için kanül deliklerinden (adım 1.6.6) zaten ilerlemiş olan tetrodlarla mikro sürücüyü indirin; Tetrodlar fareye dokunduğunda herhangi bir medial / lateral veya rostral / kaudal hareket, tetrodları bükebilir ve son hedeflerini kaçırmalarına neden olabilir.
   3. Mikro sürücü tamamen indirildikten sonra, kanülün tabanının kafatası / dura ile temas ettiğinden emin olun. Petrol jölesi ve / veya mineral yağ tabakası, maruz kalan durayı örtmek için bir bariyer görevi görecektir. Gerekirse, aşırı maruz kalan durayı örtmek için steril petrol jölesi veya steril kemik mumu ekleyin.
   4. Mikro sürücüyü stereotaksik aparatla yerinde tutarken, mikro sürücü tabanını implante edilmiş kemik vidalarına yapıştırmak için kafatasını diş çimentosu ile kaplayın.
      NOT: Diş çimentosu tüm kemik vidalarını tamamen kaplamalı ve mikro tahrik kanülü üzerindeki diş çimentosu ankraj çıkıntısını örtmelidir.
   5. Diş çimentosu ayarlanırken, fareye zarar verebilecek veya mikro sürücüye zarar verebilecek keskin köşeleri veya kenarları önlemek için dikkatlice şekillendirin. Mikro sürücüyü tutmak için yeterli diş çimentosu bulunduğundan emin olun, ancak gereksiz ağırlık ekleyecek aşırı diş çimentosunu ortadan kaldırın.
   6. Topraklama telini mikro sürücüden dikkatlice geçirin ve AYB üzerindeki uygun yuvaya takın.
   7. Diş çimentosu tamamen ayarlandıktan sonra, mikro sürücüyü stereotaksik aparattan dikkatlice ayırın. Kapağı mikro sürücüye yerleştirin.
   8. Steril pamuk uçlu çubuk ve steril salin ile fareyi temizleyin.
   9. Steril pamuk uçlu çubukla, implant bölgesinin yakınında maruz kalan herhangi bir kafa derisine ince bir antibiyotik merhem tabakası uygulayın.
   10. Folyoyu farenin gözlerinden çıkarın.
   11. Fare temiz bir kafese taşınırken mikro sürücünün ek ağırlığını desteklemeye dikkat ederek fareyi stereotaksik cihazdan çıkarın.

3. Ameliyat sonrası iyileşme

1. Anında kurtarma
   1. Ameliyattan önce, Şekil 2G'de gösterildiği gibi 0.75 çapında bir PVC boru bağlayarak karşı denge sistemini hazırlayın. Sistemin bir kolu kafesin kapağına açılan deliklerden geçer, ikinci kol kafes kapağının üstüne dayanır ve üçüncü kol kafesin üstüne ve ötesine uzanır. En üstteki kol kapaklıdır.
   2. Mikro sürücüyü dikkatlice karşı denge sistemine takın (Şekil 2G-I) ve mikro sürücünün ve kemik vidalarının ağırlığıyla aynı olan bir denge ağırlığı kullanın. Karşı balans sisteminin üç kolu üzerinden AYB'ye bağlı bir konektörden güçlü bir iplik veya olta, en üstteki kolun üzerinde asılı olan karşı balans ağırlığına kadar çalıştırın.
   3. Karşı dengenin mikro sürücü EIB'ye güçlü bir şekilde bağlı olduğundan ve fareye kafesin tamamına tam erişim sağlamak için yeterli çizgi olduğundan emin olun.
   4. Rehidrasyon ve iyileşmeyi sağlamak için kafeste nemlendirilmiş normal kemirgen chow ile birlikte besin açısından zengin jel sağlayın.
   5. Cerrahi anesteziden tamamen iyileşene kadar fareyi izleyin.
2. Uzun süreli iyileşme
   1. Kayıt ekipmanına takılı değilken her zaman, mikro sürücünün karşı denge sistemi tarafından desteklendiğinden emin olun. Zaman içinde karşı ağırlığı azaltın, ancak fareye beklenmedik bir şekilde gerilmesini veya kemik vidalarına tork gelmesini önlemek için asla tamamen çıkarmayın.
   2. İmplant ve karşı denge sisteminin zarar görmesini önlemek için, deney süresince fareyi diğer farelerle doğrudan etkileşim olasılığı olmadan barındırın.
   3. Ameliyattan sonra en az 3 gün boyunca besin açısından zengin jel sağlayın, bu noktada tek başına katı yiyecekler yeterli olacaktır.
      1. Karşı denge sisteminin genel gider gereksinimleri nedeniyle, havai tel örgüde yiyecek ve su sağlamayın; Yiyecekleri kafes zeminine yerleştirin ve kafesin yanından su sağlayın. Bozulmayı önlemek için, yiyecekleri tamamen günlük olarak değiştirin.
   4. Her gün, farenin kafesin tamamına serbestçe erişebildiğinden ve karşı dengenin mikro sürücüye sağlam ve güçlü bir şekilde takıldığından emin olun.

Yukarıda açıklanan protokol, farelerde aynı anda birden fazla beyin bölgesinden yerel alan potansiyel sinyallerini ve tek birimleri kaydetmek için kullanıldı ve aynı farelerde p20'den p60'a kadar günlük kayıtlar yapıldı. Burada iki fareden elde edilen temsili elektrofizyolojik kayıtlar ve son kayıt yerlerini gösteren deney sonrası histoloji bildirilmiştir.

Mikro sürücünün p20 farelere cerrahi implantasyonu
Bir mikro sürücü (Şekil 1) inşa edildi (Şekil 2) ve yukarıda açıklandığı gibi cerrahi olarak bir p20 fareye implante edildi. Ameliyattan hemen sonra, fare karşı denge sistemine bağlandı (Şekil 2G-I) ve iyileşmesine izin verildi. Fare tamamen hareketli olduğunda, mikro sürücü in vivo elektrofizyoloji kayıt sistemine takıldı. Mikro sürücüyü kayıt ekipmanına bağlayan kablolar farenin üzerine asıldı. Elektrofizyolojik kayıtlar (32 kHz) tüm kanallarda 1 saat boyunca elde edilirken, fare ev kafesinde doğal davrandı. Kaydın ardından, fare kayıt sisteminden çıkarıldı, karşı denge sistemine yeniden bağlandı ve suya ve chow'a serbest erişim ile vivaryuma geri döndü.

Nöral aktivitenin günlük kaydı
Elektrofizyolojik kayıtlar, p20-p60'ın kritik gelişimsel pencereleri boyunca aynı beyin bölgesinin kronik olarak izlenmesini sağlamak için birkaç hafta boyunca günlük olarak elde edildi. Kronik kayıtlar boyunca örnek ham yerel alan potansiyelleri (LFP) Şekil 3A, C'de gösterilmiştir. İzole edilmiş tek birimler aynı anda çoklu tetrodlardan elde edildi (Şekil 3B). Benzer dalga formlarına sahip birimler birden fazla gün boyunca tanımlandı (Şekil 3B, orta ve sağ), ancak kayıt elektrodunun potansiyel sürüklenmesi nedeniyle, aynı birimin günler boyunca tanımlandığını kesin olarak iddia etmek mümkün değildi. P20'ye implante edilen ve birkaç hafta boyunca günlük olarak kaydedilen ayrı bir farede, dorsal bölge CA1'i hedefleyen bir tetrod üzerinde nöral aktivite incelendi. Kaydın her gününde büyük genlikli dalgalanmalar ve iyi izole edilmiş tek birimler tanımlanmıştır (Şekil 4). Bu veriler, kararlı, yüksek kaliteli in vivo elektrofizyolojik kayıtların erken gelişim boyunca aynı fareden olabileceğini göstermektedir.

Kayıt bölgelerinin histolojik olarak doğrulanması ve kronik implantasyonun gelişimsel etkisi
Son kayıt gününü takiben, fare izofluran anestezisi ile iyice uyuşturuldu, ardından ölümcül bir pentobarbital sodyum enjeksiyonu yapıldı ve kayıt bölgelerinde küçük lezyonlar üretmek için elektrot uçlarından bir akım geçirildi. Fare beyninin deney sonrası histolojik kesitlenmesi, son kayıt bölgelerinin görselleştirilmesine izin vermiştir (Şekil 5A, B). Ayrı bir kohortta, üç erkek ve üç dişi fare, yukarıda tarif edildiği gibi cerrahi olarak p20'ye implante edildi. Eşit sayıda çöp arkadaşı implante edilmeden bırakıldı ve aynı barınma koşullarında tutuldu. Fareler p62'de kurban edildi (implante edilen kohort için ameliyattan 6 hafta sonra). Kafatasları dikkatlice temizlendi ve lambda'daki bregma-lambda mesafesinin (Şekil 5C, sol üstte) ve lambda'daki dış maksimal kafatası genişliğinin (Şekil 5C, sağ üst) dış ölçümleri alındı. Kafatasının orta çizgisi boyunca bir kesi yapıldı ve kütle ölçümü için beyni eksize etmek için kafatasının yarısı çıkarıldı (Şekil 5C, sağ altta). Bregma'daki kafatası boşluğunun yüksekliği sağlam kafatası yarısından ölçüldü (Şekil 5C, sol altta). İmplante edilmiş ve implante edilmemiş kohortlar arasında hiçbir ölçü anlamlı olarak farklı değildi (Wilcoxon rank-sum testi), p20'den başlayan uzun süreli implantasyonun kafatasının veya beyin hacminin doğal gelişimi üzerinde brüt bir etkisi olmadığını göstermektedir.

Resim 1: Mikro sürücü bileşenleri. (A) mikro sürücü gövdesinin, (B) kanülün, (C) koninin, (D) kapağın, (E) vida ataşmanlarının ve (F) tetrod ilerleyen vidanın üç boyutlu görüntüleri. Her bileşenin kritik özellikleri belirtilmiştir. Ölçüm ayrıntıları, https://github.com/Brad-E-Pfeiffer/JuvenileMouseMicroDrive/'de bulunan model dosyalarından çıkarılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 2: Mikro sürücü yapısı . (A) Yan ve (B) üst ve alt vida ataşmanları bağlı olarak tetrod ilerleyen vidanın üstten görünümü. (C) Gövde ve kanül takılı mikro sürücünün yan ve (D) üstten görünümü ve her kanül deliğinden geçen ve kanülün dibine kesilmiş büyük poliimid boru. (E) Mikro sürücünün vidalar ve küçük poliimid boru ile yandan görünümü. Küçük poliimid tüplerin üst kısımları, tetrod yüklemesinden hemen önce kesilir. (F) Stereotaksik cihaza bağlı tamamlanmış mikro sürücü. Normalde mikro sürücüyü çevreleyen koruyucu koni, görselleştirme amacıyla çıkarılmıştır. Bazı vidalı ataşmanların bu mikro sürücü için siyah bir reçine içinde basıldığını unutmayın. (G) Karşı denge destek sistemi. (H) Yan ve (I) karşı denge destek sistemi takılı bir fare kafesinin üstten görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Temsili elektrofizyolojik kayıtlar. Bir p20 fare, yukarıda açıklandığı gibi bir mikro sürücü ile implante edildi. P21'den başlayarak ve bundan sonraki 2 hafta boyunca her gün, fare kayıt cihazına bağlandı ve nöral aktivite en az 1 saat boyunca kaydedildi. (A) İki taraflı (L = sol; R = sağ) anterior singulat korteks (ACC), hipokampal alan CA3 (CA3) ve hipokampal alan CA1 (CA1). Veriler her gün toplandı; Netleştirmek için, yalnızca tek günlere ait veriler görüntülenir. Tüm izler ev kafesinde hareketsizlik dönemlerinde alındı. Ölçek çubuğu: 1 mV, 2 s. (B) Panel A'daki kayıtlar için hipokampal alan CA3 (solda) ve CA1'den (sağda) izole edilmiş temsili tek birimler. Her elektrot üzerindeki tüm ham dalga formları siyah renkte gösterilir; ortalama kırmızı renktedir. Ölçek çubuğu: 50 μV, 0,2 ms. (C) p20'ye implante edilmiş ikinci bir fare için p60'taki son kayıt gününe kadar her 10. gün için temsili ham LFP izleri. Veriler her gün toplandı; Netleştirmek için, yalnızca her 10. güne ait veriler görüntülenir. Tüm izler ev kafesinde hareketsizlik dönemlerinde alındı. Ölçek çubuğu: 1 mV, 2 sn. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. Kronik kayıtların stabilitesi. Bir p20 fare, yukarıda açıklandığı gibi bir mikro sürücü ile implante edildi. P21'den başlayarak ve daha sonra 4 hafta boyunca, fare kayıt cihazına bağlandı ve nöral aktivite en az 1 saat boyunca kaydedildi. Dorsal hipokampal CA1'i hedef alan tetrodlardan elde edilen veriler gösterilmiştir. (A) p21, p30 ve p40'ta tanımlanan dalgalanma olayları için ham (üstte) ve dalgalanma filtreli (altta) LFP. Dalgalanma olaylarını tanımlamak için, ham LFP 125 Hz ile 300 Hz arasında bant geçişi filtrelendi ve dalgalanma olayları, dalgalanma bandı gücünde ortalamanın üzerinde 3 standart sapmadan daha büyük geçici artışlar olarak tanımlandı. Her dalgalanmanın başlangıcı ve bitişi, dalgalanma bandı gücünün ortalamaya geri döndüğü nokta olarak tanımlandı. Tanımlanan dalgalanmalar kırmızı renkle gösterilir. Ölçek çubuğu: 100 ms, yukarıdan aşağıya: 1.000 μV, 140 μV, 1.800 μV, 180 μV, 9.000 μV, 1.200 μV, 10.000 μV, 1.000 μV. (B) Panel A'daki kayıtlar için CA1 hedefli tetroddan her gün temsili tek bir birim. Her elektrot üzerindeki tüm ham dalga formları siyah renkte gösterilir; ortalama kırmızı renktedir. Ölçek çubuğu 0,2 ms, yukarıdan aşağıya: 50 μV, 100 μV, 100 μV. (C) B panelindeki tek birimler için tüm ani artışların otokorelogramı. Bu veriler, birkaç hafta boyunca hipokampal piramidal tabaka içinde kararlı elektrot yerleşimini göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Temsili histoloji ve kafatası gelişimi üzerindeki etkisi. Bir p20 fare, yukarıda açıklandığı gibi bir mikro sürücü ile implante edildi. P60'taki son kayıt gününü takiben, kayıt bölgelerinde elektrolitik lezyonlar üretildi ve beyin% 4 paraformaldehit ile perfüze edildi. Kayıt alanlarını belirlemek için 50 μm kesitler üretildi. (A) Hipokampusun CA1 ve CA3'ündeki lezyonlar. Ok ucu CA3 kayıt sitesini gösterir; çift ok ucu CA1 kayıt sitesini gösterir. Ölçek çubuğu: 0.5 mm. (B) Bilateral AKK'daki lezyonlar. Ok uçları ACC kayıt sitelerini gösterir. Ölçek çubuğu: 0,5 mm. (C) P20'de (gri) bir mikro sürücü ve implante edilmemiş çöp arkadaşları (beyaz) ile implante edilen p62 farelerinin kafatası boyutu ve beyin kütlesi ölçümleri. Wilcoxon rank-sum testinin p-değeri her ölçüm için raporlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.