Method Article

Yüksek Polarize İnsan Retinal Pigment Epitel Kültürlerinde Geliştirilmiş Lipofussin Modelleri ve Dış Segment Fagositoz Kapasitesinin Ölçülmesi

DOI:

10.3791/65242

⸱

April 14th, 2023

 ,  , 
1Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, 2Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yüksek oranda farklılaşmış ve polarize olmuş insan retinal pigment epitelyal (RPE) kültürlerinde bir lipofussin birikim modelini ve RPE'nin toplam OS tüketimini/bozulma kapasitesini saptamak için geliştirilmiş bir dış segment (OS) fagositoz testini tanımlamaktadır. Bu yöntemler, önceki lipofussin modellerinin ve klasik nabız kovalama dış segment fagositoz testlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinal pigment epiteli (RPE) tarafından fotoreseptör dış segmentlerin günlük fagositozu, lipofussin adı verilen hücre içi yaşlanma pigmentinin birikmesine katkıda bulunur. Lipofusin toksisitesi, en yaygın kalıtsal retinal dejenerasyon olan Stargardt hastalığında iyi bilinmektedir, ancak gelişmiş dünyada geri dönüşümsüz körlüğün önde gelen nedeni olan yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD) daha tartışmalıdır. İnsanlarda lipofussin toksisitesini belirlemek zor olmuştur ve Stargardt'ın hayvan modelleri sınırlı toksisiteye sahiptir. Bu nedenle, lipofussin üretimini, klirensini ve toksisitesini daha iyi anlamak için insan RPE'sini in vivo olarak taklit eden in vitro modellere ihtiyaç vardır. Bugüne kadar hücre kültürü lipofussin modellerinin çoğunluğu hücre hatlarındaydı veya RPE'yi tüm fotoreseptör dış segmentinin parçaları / uçları yerine karmaşık lipofuscin karışımının tek bir bileşeni ile beslemeyi içeriyordu, bu da daha eksiksiz ve fizyolojik bir lipofuscin modeli oluşturuyordu. Burada tarif edilen, lipofussin benzeri materyalin (sindirilemeyen otofloresan materyal veya UAM olarak adlandırılır) yüksek oranda farklılaşmış primer insan doğum öncesi RPE'sinde (hfRPE) ve indüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı RPE'de birikmesini indükleyen bir yöntemdir. UAM, RPE tarafından fagositoz yoluyla alınan ultraviyole ışıkla işlenmiş OS parçalarının tekrar tekrar beslenmesiyle kültürlerde birikmiştir. UAM'nin lipofuscin in vivo olarak yaklaştığı ve ondan farklı olduğu anahtar yollar da tartışılmaktadır. Bu lipofussin benzeri birikim modeline eşlik ederek, UAM granüllerinin geniş otofloresan spektrumunu eşzamanlı antikor boyamasından ayırt etmek için görüntüleme yöntemleri tanıtılmıştır. Son olarak, UAM'nin RPE fagositoz kapasitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek için, dış segment fragmanı / uçlarının alımını ve parçalanmasını ölçmek için yeni bir yöntem tanıtılmıştır. "Toplam Tüketim Kapasitesi" olarak adlandırılan bu yöntem, klasik dış segment "nabız kovalamaca" testlerinde bulunan RPE fagositoz kapasitesinin potansiyel yanlış yorumlarının üstesinden gelir. Burada tanıtılan modeller ve teknikler, lipofussin üretimi ve klirens yollarını ve varsayılan toksisiteyi incelemek için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinal pigment epiteli (RPE), fotoreseptör dış segment uçlarının veya fragmanlarının günlük alımı ve bozulması da dahil olmak üzere üstteki fotoreseptörler için kritik destek sağlar (bu protokol boyunca, OS kısaltması, tüm dış segmentlerden ziyade OS uçları veya fragmanları anlamına gelir). Post-mitotik RPE'deki bu günlük alım sonunda fagolizozomal kapasiteyi aşırı yükler ve lipofussin adı verilen sindirilemeyen, otofloresan hücre içi materyalin birikmesine yol açar. İlginç bir şekilde, birkaç çalışma RPE lipofuscin'in OS fagositoz 1,2 olmadan birikebileceğini de göstermiştir. Lipofuscin, görsel siklus retinoidlerinden türetilen çapraz bağlı adduktlar da dahil olmak üzere birçok bileşene sahiptir ve 80 yaşın üzerindekiler için RPE hücre hacminin yaklaşık% 20'sini işgal edebilir3.

Lipofuscin'in toksik olup olmadığı sıcak bir şekilde tartışılmıştır. Stargardt hastalığı, fotoreseptörlerin ve RPE'nin otozomal resesif dejenerasyonudur ve ABCA4'teki bir mutasyon, fotoreseptör dış segmentlerinde bulunan görme döngüsü retinoidlerinin yanlış işlenmesini tetikler. Yanlış retinoid işleme, bis-retinoid N-retinylidene-N-retinilethanolamine (A2E) dahil olmak üzere bis-retinoid türlerinin anormal çapraz bağlanmasına ve oluşumuna yol açar. Çalışmalar A2E toksisitesi için çoklu mekanizmalar göstermiştir 4,5. Lipofuscin, klinik görüntüleme sırasında fundus otofloresan sinyallerine katkıda bulunur ve hem Stargardt'ın hastaları hem de hayvan modelleri, retinal dejenerasyondan önce fundus otofloresansının arttığını gösterir, bu da lipofussin seviyeleri ile toksisite arasında bir korelasyon olduğunudüşündürmektedir 6,7. Bununla birlikte, yaşla birlikte, lipofuscin tüm insanlarda RPE dejenerasyonunu tetiklemeden birikir. Ayrıca, RPE dejenerasyonunun sadece yaşlı hastalarda meydana geldiği yaşa bağlı makula dejenerasyonunda (AMD), hastalığın erken ve orta formlarına sahip olanlar, yaşa uygun hastalıksız insanlardan daha az fundus otofloresan sinyaline sahiptir8. Bu klinik bulgular histolojik düzeyde de doğrulanmıştır 9,10.

RPE lipofussin birikiminin hayvan modelleri de lipofussin toksisitesi hakkında bazı belirsizlikler bırakmıştır. ABCA4 nakavt faresi, pigmentli bir arka plan üzerinde retinal dejenerasyon göstermezken, albino bir arka planda veya mavi ışığa maruz kaldığında11,12 gösterir. Ayrıca, ABCA4 nakavtı yoluyla elde edilen lipofuscinin toksisitesi, AMD13'te görüldüğü gibi, doğal yaşlanma ile ortaya çıkan daha yavaş biriken lipofusinden farklıdır.

Lipofussin birikiminin in vitro modelleri, lipofussin birikiminin RPE sağlığı üzerindeki etkilerini incelemek için bir alternatif sunmaktadır. Bu tür modeller, tek retinoid bileşenlerin beslenmesinden işletim sisteminin beslenmesine kadar lipofuscin bileşenlerinin manipüle edilmesine izin verir ve hayvan RPE'sinden ziyade insanda çalışmaya izin verir. Son birkaç on yılda, RPE lipofuscin'i kültürde modellemek için birçok yöntem geliştirilmiştir. Diğer gruplarla birlikte, Dr. Boulton'un grubu, 4 ila 85yaşları arasındaki donörlerden 4 ila 7 insan birincil RPE hücresinin geçişinde üç aya kadar günlük olarak sığır OS'yi besledi. Alternatif olarak, otofajinin inhibisyonu da pasajlarda lipofussin birikimine yol açmıştır 3 ila 7 birincil insan RPE kültürleri15. Bununla birlikte, oldukça farklılaşmış, pasaj 1, primer insan prenatal RPE (hfRPE) kültürlerinde sub-ölümcül lizozomal inhibisyon, günlük olarak tekrarlanan OS ilavesiyle bile lipofuscin'i indükleyememiştir16.

Daha indirgemeci bir yaklaşım olarak, diğerleri kültürlere, özellikle bis-retinoid A2E 4,17'ye tek lipofuscin bileşenlerini beslemişlerdir. Bu tür çalışmalar, bireysel lipofussin bileşenleri için potansiyel doğrudan toksisite mekanizmalarını tanımladıkları için değerlidir, örneğin lizozomal kolesterol ve seramid homeostazı18'i içerir. Aynı zamanda, A2E19'un toksisitesi hakkında tartışmalar vardır ve doğrudan hücrelere beslenmesi, fotoreseptör OS'nin fagositozunu içeren lipofussin birikimi için tipik yolu atlatır. Boulton ve Marshall, lipofuscin'in tüm bileşenlerini RPE kültürlerine ulaştırma girişiminde, lipofuscin'i insan gözlerinden saflaştırdı ve bunu hem fetal hem de yaşlı insan donörlerinden türetilen 4 ila 7 insan birincil RPE kültürüne besledi20. Yenilikçi olsa da, bu yöntem tekrarlanan deneyler için sınırlı bir lipofuscin kaynağını temsil eder.

OS'nin RPE kültürlerine tekrar tekrar beslenmesi birçok sistemde lipofussin üretirken, oldukça farklılaşmış birincil RPE kültürlerinde bunu başaramaz16. Foto-oksitleyici OS, in vivo lipofussin oluşumu sırasında doğal olarak ortaya çıkan bis-retinoid oluşumu gibi çapraz bağlanma reaksiyonlarını indükler. Bu, RPE kültür sistemlerinde lipofussin benzeri granül oluşumunu hızlandırabilir, hatta lipofussin birikimine karşı oldukça farklılaşmış ve dirençli olanlarbile16. Burada, Wihlmark'ın yayınlanmış protokol21'inden modifiye edilmiş, oldukça farklılaşmış hfRPE ve insan iPSC-RPE'sinde lipofussin benzeri granül birikimini indükleyen bir yöntem tanıtılmıştır. Bu yöntem, in vivo lipofuscinogenez için olduğu gibi aynı kaynağı (fotoreseptör OS) ve yolu (fagolizozomal OS alımı) kullanan lipofussin benzeri granülleri indükleme avantajına sahiptir. Ayrıca, insan RPE'sini in vivo22,23,24 çoğaltmak için yapılan birçok çalışmada oldukça farklılaşmış ve doğrulanmış insan RPE kültürleri üzerinde yapılır. Bu lipofussin benzeri granüller sindirilemeyen otofloresan materyal (UAM) olarak adlandırılır ve bu protokolde UAM'yi in vivo lipofuscin ile karşılaştıran veri ve tartışma sağlar. Yüksek oranda farklılaşmış insan RPE'sinde UAM yüklü kültürleri oluşturma ve değerlendirme yöntemlerinin yanı sıra, RPE OS fagositozunu değerlendirmek için güncellenmiş bir yöntem de tanıtılmıştır. OS fagositozunu ölçmek için Western blotting, immünositokimya ve FACS25,26,27 dahil olmak üzere birçok mükemmel nabız kovalama yöntemi tanıtılmıştır. Bununla birlikte, işletim sistemi nabız kovalamacasının başlarında, zayıf işletim sistemi alımına yol açan koşullar, içselleştirilmiş işletim sisteminin hızlı bir şekilde bozulmasını teşvik eden koşullarla birleştirilebilir. Burada sunulan yöntem, RPE ("Toplam Tüketim Kapasitesi") tarafından tamamen tüketilen/bozulan tanıtılan işletim sisteminin toplam miktarını ölçer ve bu belirsizliğin ortadan kaldırılmasına yardımcı olur. "Toplam Tüketim Kapasitesi" yöntemi kullanılarak OS fagositoz oranları üzerindeki etkiler de dahil olmak üzere, bu protokolleri kullanan lipofussin toksisitesi hakkındaki bilgilerin, lipofuscin'in in vivo toksisitesine ışık tutmak için kullanılması beklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan dokusunun edinimi ve kullanımını içeren mevcut protokol, Michigan Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (HUM00105486) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Foto-oksitlenmiş dış segment uçlarının ve parçalarının hazırlanması

NOT: Koyulaştırılmış sığır retinaları satın alınmış ve buz üzerinde sevk edilmiştir (bkz. Bu retinalardan, işletim sistemi daha önce yayınlanmış bir protokol23'ü takiben saflaştırıldı.

  1. UV lambası ile çapraz bağlama dış segmenti
    1. Slaytları sterilize etmek için politetrafloroetilen kaplı slaytları (bakınız Malzeme Tablosu) 10 dakika boyunca %70 etanol içine tamamen bir biyogüvenlik kabinine daldırın. Slaytların steril 100 mm'lik bir hücre kültürü kabında hava ile kurumasını bekleyin.
    2. Her slaytı yeni bir 100 mm hücre kültürü kabına yerleştirin ve her dikdörtgene 200 μL serum içeren hücre kültürü ortamı (eldeki RPE kültürleri için tipik olarak hangi ortam kullanılırsa kullanılsın) ekleyin, ardından 100 mm'lik hücre kültürü kabına (kapaksız) ampul doğrudan slayta bakacak şekilde elde taşınan 254 nm UV ışığı (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin, ve 20 dakika boyunca pozlayın. Bu çalışma için özel olarak kullanılan medya ve medyanın bileşenleri için spesifik ürün numaraları daha önce22,23 yayınlanmıştır. Bu medya, bu protokol boyunca "RPE medyası" olarak adlandırılır.
      NOT: Ortamın UV ile işlenmesi cam yüzeyi bloke eder ve sonraki adımlarda işletim sisteminin yapışmasını önler.
    3. 37 ° C'de dondurulmuş OS alikotlarını çözün (elde veya su banyosu yoluyla ). Gerekli işletim sistemi miktarı uygulamaya bağlıdır. Genel olarak, slayttaki dikdörtgen başına 500 μL'ye kadar 2 x 108 OS/mL işlenebilir.
    4. Çözüldükten sonra, işletim sistemini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2400 x g'de döndürün. Peletin kazara kaybolmasını önlemek için biyogüvenlik kabinindeki süpernatantı vakum yerine pipet kullanarak derhal aspire edin.
    5. Peletleri steril PBS ile nazikçe askıya alın.
      NOT: Yeniden askıya alınan hacmi ve beklenen konsantrasyonu takip edin. Örneğin, peletin 500 μL PBS ile 1 x 108 OS/mL'lik 1 mL'lik bir tüpten yeniden askıya alınması 2 x 108 OS/mL verir. Politetrafloroetilen kaplı kızakta dikdörtgen başına maksimum hacim ve konsantrasyon 500 μL, 2 x 108 OS/mL'dir.
    6. Slaytlardaki ortamı aspire edin ve slaytın her dikdörtgenine 500 μL'ye kadar 2 x 108 OS/mL PBS çözeltisi yerleştirin. El tipi UV ışığını, ampul doğrudan işletim sistemine bakacak şekilde hücre kültürü kabının üzerine (kapaksız) yerleştirin. İşletim sistemi çözümünü 40 dakika boyunca 254 nm ışığa maruz bırakın.
      NOT: 40 dakikalık maruz kalma sırasında, UV lambasını ve kabını bir havlu veya emici ped ile örtün, biyogüvenlik kabini kanadını kapatın ve üfleyiciyi kapatın. Bu, herhangi bir önemli buharlaşmanın meydana gelmesini önleyecektir. Bu protokolde kullanılan UV lambası bir araştırmacı tarafından kullanılamıyorsa, uygun miktarda çapraz bağlamanın elde edilmesini sağlamak için iki alternatif vardır. Birincisi, adım 1.2'de özetlenen kantitatif UV maruziyetini, adım 1.2'de özetlenen cihazla veya 1.2'de söz konusu cihazla aynı nicel radyant maruziyeti sağlayabilen başka bir cihazla takip etmektir. Diğer bir alternatif, OS'yi Şekil 1C'de görülen Coomassie boyası üzerindeki çapraz bağlanma derecesini indükleyen bir süre UV ışınlamasına maruz bırakmaktır.
    7. İşlenmiş OS PBS çözeltisini steril mikrosantrifüj tüplerinde toplayın, kaplanmış slaydın dikdörtgenini 200-500 μL PBS (2-3x) ile yeniden yıkayın ve her yıkamayı mikrosantrifüj tüpünde toplayın. İşiniz bittiğinde, neredeyse tüm işletim sistemlerinin slayttan çıkarıldığını doğrulamak için bir doku kültürü odası mikroskobu altındaki slayda bakın.
    8. OS PBS çözümünü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2400 x g'de döndürün, PBS'yi biyogüvenlik kabininde bir pipettörle aspire edin ve RPE kültürleri için kullanılacak 500 μL standart ortamda yeniden askıya alın (örneğin, bölüm 1.1.2'de tanımlanan "RPE ortamı"). Resüspansiyon hacmi, istenen foto-oksitlenmiş OS (OxOS) konsantrasyonuna göre ayarlanabilir.
    9. Süspansiyonun 10 μL'sini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, 50-100x'i daha fazla hücre kültürü ortamıyla seyreltin ve OS'leri bir hemositometre ile sayın.
    10. İşletim sistemi sayısına bağlı olarak, OxOS süspansiyonunu son stok konsantrasyonuna kadar seyreltin. 24 kuyulu Transwell'lerde (yüzey alanı 0,33cm2; bakınız Malzeme Tablosu) yüksek olgun RPE kültürlerini beslemek için, 2 x 107 OS/mL'lik bir nihai ortam konsantrasyonu önerilir.
      1. Bunu başarmak için, OxOS'u standart RPE kültür ortamında askıya alınmış 5,6 x 107 OS/mL konsantrasyonda 25 μL alikotlara dağıtın. 25 μL'lik bir aliquot'u çözdükten sonra, tüm aliquot'u 45 μL standart RPE kültür ortamı ile karıştırarak her bir OxOS Transwell beslemesi için 70 μL'lik nihai ortam hacmi ve 2 x 107 OS/mL'lik OS konsantrasyonu sağlayın.
    11. OxOS'u alıntılamadan önce, OS alımını ve lipofussin birikimini kolaylaştıran fagositoz köprüleme ligandlarını (Protein S ve MFG-E8, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. 24 kuyucuklu bir Transwell'deki köprüleme ligandlarının çalışma konsantrasyonları, insan saflaştırılmış Protein S için 4 μg / mL ve insan rekombinant MFG-E8 için 1.5 μg / mL'dir. Böylece, 5.6 x 107 OS / mL'de 25 μL OxOS alikotları için, Protein S için stok konsantrasyonu 11.2 μg / mL'dir ve MFG-E8 için 4.2 μg / mL'dir.
      NOT: Köprüleme ligand konsantrasyonları, 24 kuyucuklu Transwell'lerde hfRPE kültürleri için optimize edilmiştir ve 0.33cm2 kuyu başına yaklaşık 320.000 hücre sayısına sahiptir. Ligand konsantrasyonlarının diğer RPE tipleri ve hücre yoğunlukları için ayarlanması gerekebilir, çünkü fagositoz reseptör mevcudiyetini aşan ligandlar paradoksal olarak OS alımını bloke edebilir28.
    12. Alikotları sıvı azotta dondurun.
      NOT: Birden fazla donma-çözme, işletim sistemi bütünlüğü için son derece zararlıdır.
  2. UV çapraz bağlayıcı cihazla dış segment çapraz bağlama
    NOT: Sırasıyla 1.1.2 ve 1.1.6 adımlarının yerini alan aşağıdaki adımlar dışında adım 1.1'i izleyin:
    1. (adım 1.1.2'nin yerini alır) Her slaytı yeni bir 100 mm hücre kültürü kabına yerleştirin ve her dikdörtgene 200 μL serum içeren hücre kültürü ortamı (örneğin -"RPE ortamı" veya başka bir ikame) ekleyin, ardından slaytları bir Ultraviyole Çapraz Bağlayıcı cihazına yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu), cam yüzeyi bloke etmek ve sonraki adımlarda işletim sisteminin yapışmasını önlemek için 3-6 J /cm2'lik bir radyant maruziyette 254 nm UV ile muamele edin.
    2. (adım 1.1.6'nın yerini alır) Slaytlardaki ortamı aspire edin ve slaytın her dikdörtgenine steril PBS'de 500 μL'ye kadar 2 x10 8 OS /mL yerleştirin. Slaytları Ultraviyole Crosslinker cihazına yerleştirin, tedavi radyant maruziyetini gerektiği gibi ayarlayın (3-9 J /cm2) ve 254 nm'de tedavi edin.
      NOT: İhtiyaç duyulan radyant maruziyeti, otofloresan derecesine kadar 3-9 J /cm2 arasında radyant maruziyet titre edilerek dikkatlice belirlenebilir ve protein çapraz bağlama (Şekil 1B ve Şekil 1C'de görüldüğü gibi) elde edilir.
      DİKKAT: İşletim sisteminin biyogüvenlik kabini dışında kullanılması kontaminasyona neden olabilir. İşletim sisteminin UV Crosslinker Cihazına maruz kalmasından sonra, steril pipet uçlarıyla işletim sistemini toplayın, steril mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve biyogüvenlik başlığındaki diğer tüm adımları uygulayın.
  3. Oksitlenmiş işletim sisteminin karakterizasyonu
    1. Görüntüleme ile otofloresan emisyon spektrumunu ölçmek
      1. İşlenmemiş OS ve OxOS'tan 20-50 μL stok çözeltisini iki ayrı mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2400 x g'de santrifüj, peletleri tamponlanmış (örneğin PBS)% 4 paraformaldehit içinde yeniden askıya alın ve oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyin.
      2. Sabitlemeden sonra, yukarıdaki gibi aşağı doğru döndürün, PBS x 2 ile yıkayın (yıkamalar arasında aşağı doğru eğirin), ardından 30 μL'den daha az PBS'de tekrar askıya alın.
      3. Bir mikroskop slaydına birkaç mikrolitre süspansiyon yerleştirin, montaj ortamı ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) ve son olarak bir kapak kayması.
      4. OxOS'u konfokal mikroskopta görüntüleyin (bkz.
        NOT: OxOS otofloresansı çok çeşitli lazer dalga boyları tarafından uyarılabilir, ancak tipik olarak 405 nm veya 488 nm lazer çizgisi kullanılır. Emisyon benzer şekilde geniştir, ancak tipik bir GFP / FITC uyarma / emisyon filtresi kurulumu otofloresanı görüntülemek için yeterlidir.
      5. OxOS emisyon spektrumunu ölçmek için, konfokal mikroskopta λ-tarama kullanın. Tipik λ tarama ayarları arasında 405 nm veya 488 nm ile uyarma ve lazer uyarma hattından kırmızıya kayan 10 nm'den yaklaşık 800 nm'ye kadar değişen emisyon tespiti ve λ adım boyutu 10 nm'dir. Her mikroskopi sisteminin λ modunun nasıl kullanılacağına dair kendi talimatları vardır ve okuyucunun kendi özel konfokalleri için kılavuza başvurması gerekir.
    2. Alternatif olarak, otofloresanı akış sitometrisi ile sayısallaştırın.
      1. Mikrosantrifüj tüplerinde 2 x 10 7 işlenmemiş işletim sistemini ve ayrı ayrı 2 x 107 OxOS'u döndürün ve 1 mL PBS'de yeniden askıya alın.
        NOT: Akış sitometrisi çözülmeden hemen sonra yapılırsa fiksasyon gerekli değildir.
      2. İşlenmemiş OS ve OxOS örneklerini akış sitometresine yükleyin (bkz. İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) değerlerini FSC-SSC dağılım grafiğinde kabul edilebilir bir yayılmaya ayarlayın. Kirletici küçük parçacıkları dışlamak için PBS'yi bir kontrol olarak kullanın. İşletim sisteminin hücrelerden önemli ölçüde daha küçük olduğunu unutmayın.
      3. Otofloresan ölçümü için akış sitometresinin standart FITC kanalını kullanın. En az 10.000 olay sayın. Floresan yoğunluğunu temsil etmek için FITC histogramının nabız alanı değerini kullanın.
        NOT: Bu çalışma için, tüm veriler üreticinin talimatları izlenerek akış sitometresi analiz yazılımı (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılarak analiz edilmiştir.
    3. OxOS'ta çapraz bağlama derecesini değerlendirin
      1. Mikrosantrifüj tüplerinde 2 x 10 7 işlenmemiş işletim sistemini ve ayrı olarak 2 x 107 OxOS'u döndürün. Süpernatantı çıkarın ve 1.2x Laemmli Numune Tamponu ekleyerek peleti doğrudan lize edin (örtmek için yeterli; bkz. Vorteks, oda sıcaklığında 30 dakika bekletin, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 12000 x g'ye eşit veya daha büyük bir seviyede döndürün ve süpernatan toplayın.
        NOT: OxOS'ta protein çapraz bağlanma derecesinin değerlendirilmesi, UV tedavisinin yeterliliği hakkında bir fikir verir. Tedavi edilmemiş OS ve OxOS arasında karşılaştırma yapılır ve Coomassie boyamasına hakim olan monomerik rodopsin bandı (Şekil 1C, ok) sadece algılanabilir olduğunda, daha yüksek dereceli agregaların ortaya çıkması ve jelin üstünde bir protein yayması ile yeterli çapraz bağlanma meydana gelir.
        DİKKAT: İşletim sistemini lize etmek için Numune Arabelleği kullanırken, daha sonra lizis çözeltisini ısıtmayın, çünkü bu rodopsin agregasyonunu tetikleyebilir. Ayrıca, SDS'yi çökelteceğinden, depolamaya hazır olana kadar lized işletim sistemini soğutmaktan kaçının. Kullanılmayan lizatlar -20 °C'de tutulabilir. Yeniden çözülürse, kullanmadan önce lizatların oda sıcaklığında tamamen çözüldüğünden emin olun.
      2. Yüksek SDS ve indirgeyici konsantrasyonlarına toleranslı bir protein testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün29. Uygun protein tahlil reaktifleri hakkında öneriler için Malzeme Tablosuna bakın ve bu reaktifler için üretici protokolünü takip edin.
      3. İşlenmemiş OS ve OxOS numunelerini SDS-PAGE elektroforezi30 ile standart tris-glisin SDS tamponu kullanarak% 4 -% 15 gradyan jel üzerinde çalıştırın. Jel, numuneler yığına girene kadar 80 V'ta, daha sonra oda sıcaklığında 50-60 dakika boyunca 120 V'ta çalıştırılır.
      4. Standart protokolleri kullanarak jeli Coomassie mavisi ile lekeleyin31. Coomassie boyaması, UV tedavisi ile indüklenen çapraz bağlamanın yeterliliğini gösterecektir.

2. RPE kültürlerinde lipofussin benzeri granüllerin (UAM) oluşturulması

  1. OxOS beslemeleri: miktar, sıklık ve fagositoz köprüleme ligandları
    NOT: Beslenmeler, Bharti laboratuvarı (iPSC-RPE için)32 tarafından özetlenen protokole veya Sheldon Miller laboratuvarı22,23'ten uyarlanan hfRPE için daha önce özetlenen protokolümüze göre yetiştirilen 1. pasajdaki insan iPSC-RPE veya hfRPE kültürlerinde gerçekleşir. Aşağıdaki tüm hesaplamalar, OxOS veya OS'nin bir adet 24 delikli Transwell'e (6,5 mm çap, 0,33cm2 büyüme alanı) beslenmesine dayanmaktadır.
    1. 37 °C'de 5,6 x 107 OxOS/mL'nin 25 μL'sini çözün ve OxOS aliquot'a 45 μL hücre kültürü ortamı ekleyerek 70 μL'lik son hacim elde edin.
      NOT: Adım 1'de hazırlanan OxOS alikotları, MFG-E8 ve Protein S ligandlarını köprüleyen fagositoz içerecektir. Bununla birlikte, eğer bu ligandlar donmadan önce alikotlara eklenmemişse, bu adımda eklenebilirler, böylece beslenecek hücrelerdeki ligandların nihai konsantrasyonunun Protein S için 4 μg / mL ve MFG-E8 için 1.5 μg / mL olmasını sağlarlar. Adım 1.1.11'de belirtildiği gibi, köprüleme ligandlarının konsantrasyonlarının diğer RPE tipleri veya hücre yoğunlukları için değiştirilmesi gerekebilir.
    2. Transwell'den apikal medyayı çıkarın ve apikal odaya fagositoz köprüleme ligandları ile 70 μL 2 x 107 OxOS / mL ekleyin. 24 saat sonra, çıkarın ve yeni bir OxOS beslemesi ile değiştirin. Beslenme, hafta içi günlerde günlük olarak gerçekleşir, hafta sonları atlanır, 20 besleme tamamlanana kadar (~ 1 ay). Bazolateral hücre kültürü ortamını (400-550 μL) haftada 2-3 kez değiştirin.
    3. 20 beslemenin tamamlanmasının ardından, kuyu için normal ortam değişikliklerine devam edin.
      NOT: Yapışkan OxOS'u RPE apikal yüzeyinden temizlemek için birkaç ek ortam değişikliği gerekir, bu nedenle UAM yüklü kültürlerle yapılan deneyler, OxOS beslemeleri sona erdikten en az 1-2 hafta sonra yapılmalıdır.
      DİKKAT: OxOS beslemeleri yoluyla UAM birikimi için uygun kontrollere sahip olmak önemlidir. Günlük medya değişiklikleri RPE biyolojisini etkileyebileceğinden, aşağıdaki kontrol kuyuları önerilir: Kontrol 1: OxOS ile tedavi edilen grupla aynı sayıda besleme için hafta içi günlerde günlük olarak medyayı değiştirin. Kontrol 2: RPE işlenmemiş işletim sistemini hafta içi her gün OxOS beslemeleriyle aynı konsantrasyon ve hacimde, aynı sayıda besleme için besleyin.
  2. Lipofussin benzeri granüllerle yüklü kültürlerin sağlığının trans-epitelyal elektrik direnci (TEER) ve hücre ölümü tahlilleri ile izlenmesi
    NOT: OxOS beslemeleri sırasında ve sonrasında, RPE sıkı bağlantı bütünlüğü ve hücre ölümü değerlendirilerek RPE kültürlerinin sağlığı ölçülebilir. Trans-epitelyal elektrik direncinin (TEER) ölçülmesi yoluyla sıkı bağlantı bütünlüğünün değerlendirilmesinin, genel hücre sağlığı için hassas bir belirteç olduğu daha önce gösterilmiştir33. Laktat dehidrogenaz (LDH) salınımı gibi hücre ölümünün daha geleneksel non-invaziv belirteçleri de kullanılabilir.
    1. TEER gerçekleştirin
      NOT: TEER, genellikle üreticinin talimatlarını izleyerek bir trans epitelyal elektrik direnci (TEER) ölçüm cihazı ve TEER elektrodu ile test edilir (bkz.
      1. TEER elektrodunu sterilize etmek için, elektrodu temizlemek için% 70 etanol içine batırılmış bir görev sileceği kullanın ve ardından elektrot probunun uçlarını 10 dakika boyunca% 70 etanol içine daldırın.
      2. Elektrodun tamamen kurumasını bekleyin, ardından elektrodu steril ortama daldırın.
      3. Probu steril ortamdan çıkarın ve TEER elektrodunun iki probunu kültürlü bir Transwell'in apikal ve bazolateral odalarına yerleştirin; daha uzun prob ucu bazolateral odaya sığar.
        NOT: Apikal odanın tabanını TEER elektrodu ile pratik yapmadan kazımak kolaydır ve bu tür kazıma, akıcı RPE tek katmanı bozulduğu için TEER okumalarını önemli ölçüde değiştirecektir. Bu nedenle, yeni başlayanların deneysel RPE kültürleri üzerinde test yapmadan önce önemli olmayan Transwell'ler üzerinde pratik yapmaları önerilir. Ayrıca, RPE kültürlerinin her plakası test edildikten sonra, deneyci standart bir doku kültürü mikroskobu altında RPE tek katmanının kazınıp kazınmadığını kontrol etmelidir.
      4. Apikal ve bazolateral problar Transwell'e yerleştirildikten sonra, TEER'i kaydetmek için okuma düğmesine basın veya ölçüm cihazının ayak anahtarına basın. Plakalar veya hücre grupları arasında, elektrot probunu steril ortamla yıkayın. Enfeksiyon yüksek bir endişe ise, plakalar arasında yeniden sterilize edin.
      5. Ölçüm cihazından direnç okumasını alarak, ortam içeren ancak hücre içermeyen boş bir Transwell'in değerini çıkararak (genellikle 0.33cm2 yüzey alanına sahip 24 kuyulu bir Transwell için 100-110 Ω) ve ardından Transwell'in yüzey alanı ile çarparak TEER'i hesaplayın.
        NOT: TEER değerleri hücre yüzey alanına normalleştirilmiş olarak bildirilmelidir. Sağlıklı hfRPE kültürleri için tipik değerler 350-1100Ωcm2 arasında değişmektedir. TEER değerleri sıcaklık düştükçe artar. Bu nedenle, kültürleri 37 ° C'lik bir inkübatörden oda sıcaklığındaki bir davlumbaza çıkarırken, TEER değerleri plaka boyunca artma eğiliminde olacaktır. Bu değişkenliğe karşı korunmak için, ya hızlı bir şekilde çalışın (eğer yaşanıyorsa) ya da plaka sıcaklığının oda sıcaklığıyla dengelenmesi için 10-15 dakika bekleyin.
    2. LDH salınım testi yapın
      NOT: LDH'nin hücre kültürü süpernatantına salınması, hücre ölümü sırasında meydana gelir ve standart bir kit ile ölçülür (bkz.
      1. 24 saatlik bir inkübasyondan sonra süpernatantı hücrelerin üstünden toplayın ve standart ortam kullanarak 1:100'e kadar seyreltin.
      2. Adım 2.2.2.1'deki tüm değerleri normalleştirmek için önemli olan toplam olası LDH salınımını, 24 delikli bir Transwell'deki kontrol hücrelerinden 100 μL apikal ortama 2 μL% 10 triton X-100 ekleyerek indükleyin. Triton / hücre süpernatant karışımını 37 ° C'de 15 dakika inkübe ettikten sonra, şimdi lize edilmiş hücrelerin üzerindeki ortamı karıştırın ve toplam olası LDH salınımını ölçmek için toplayın.
      3. Süpernatanlar toplandıktan sonra, üreticinin standart talimatlarını kullanarak tahlili gerçekleştirin, kitin tampon çözeltisini kullanarak 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra lüminesansı ölçün.
        NOT: Tüm LDH değerleri, olası toplam LDH salınımı miktarına normalleştirilir.
  3. Lipofussin benzeri granül spektrumu ve bileşiminin karakterizasyonu
    1. Otofloresan nicelleştirme ve spektrumlarının elde edilmesi
      1. UAM yüklü kültürleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 PFA ile sabitleyin, ardından PBS 5x yıkayın.
      2. Apikal odada az miktarda PBS bulundurun ve Transwell'i baş aşağı çevirin. Bir diseksiyon mikroskobu ve bir tıraş bıçağı kullanarak, yarı gözenekli membranı Transwell'den kesin, membran ve Transwell'in birleşme noktasında kesme kuvveti uygulayın.
        NOT: Transwell membranı, kesikler tutarlı olmadığında bükülme ve kırışma eğilimi gösterdiğinden, kesimin Transwell'in dudağına ne kadar yakın yapıldığı konusunda tutarlı olun.
      3. Transwell zarı kesildikten sonra, Transwell zarının parçalarına hücrelerle dokunmaktan kaçınmaya dikkat ederek, forseps kullanarak hemen bir mikroskop slaydına yerleştirin. Hücrelere dokunmaktan kaçınırken, fazla PBS'yi bir görev silme ile uzaklaştırın. Montaj ortamı ve kapak fişi ekleyin. Transwell'i kapatırken Transwell'in hangi tarafının "sağ taraf yukarı" olduğunu takip ettiğinizden emin olun.
      4. Adım 1.3.1.4 ve adım 1.3.1.5 ile aynı ayarları ve prosedürleri kullanarak otofloresan yoğunluğunu ve spektrumlarını elde edin.
        NOT: UAM'yi görüntülerken, önemli bir karışıklık, OxOS'un otofloresan olması ve genellikle OxOS beslemesinin tamamlanmasından sonra günlerce ve hatta bazen haftalarca RPE apikal yüzeyine yapışmasıdır. Sonuç olarak, UAM'yi ölçerken, ölçülen otofloresansın OxOS'tan değil, UAM'den geldiğinden emin olmak için bir yöntem kullanılması gerekir. En kolay yöntem, lipofussin kültürlerini bir rodopsin antikoru ile birlikte boyamaktır. Örneğin, anti-rodopsin antikoru 4D2, 1:1000 seyreltmede ve standart PFA-fiksasyon immünositokimya protokolü34 ile kullanılabilir. Rodopsin için ikincil antikor, UAM ve OxOS otofloresansı bu dalga boyunda en zayıf olma eğiliminde olduğundan, çok kırmızı boya konjuge bir antikor olmalıdır (örneğin, 647 nm'ye yakın bir uyarma maksimumu ile). Konfokal görüntüler daha sonra iki kanalda sırayla elde edilebilir, UAM ve OxOS otofloresansını 405 nm lazerle heyecanlandırır ve 415 nm'den 550 nm'ye kadar emisyon sağlarken, sindirilmemiş OxOS'u gösteren artık rodopsin, ayrı bir kanaldaki standart uzak kırmızı boya görüntüleme parametreleriyle uyarılabilir. Satın alma sonrasında, rodopsin kanalı, yapışkan kalan OxOS'tan gelen otofloresanı gidermek için ImageJ gibi bir programda çıkarma maskesi olarak kullanılabilir ve nicelleştirmek için sadece UAM otofloresansını geride bırakır.
        DİKKAT: Foto-oksitlenmemiş işletim sistemleri bile bir miktar otofloresan gösterir ve titiz yıkamada bile, bazı işletim sistemleri ve OxOS'lar RPE yüzeyine yapışır. Bu nedenle, yukarıdaki NOT'ta önerildiği gibi, rodopsin immünoboyama kullanarak bir çıkarma maskesi üretmeden, OxOs veya standart işletim sistemi ile beslenen kültürlerde UAM otofloresan seviyelerinin doğru bir şekilde ölçülmesi mümkün değildir.
    2. Lipofussin benzeri granüllerin ve diğer immünofloresan belirteçlerin eşzamanlı tespitini gerçekleştirin
      NOT: Adım 2.3.1'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, lipofuscin'in geniş otofloresan spektrumu, floresan birlikte boyama seçeneklerini sınırlar. Birlikte boyamayı kolaylaştırmak için aşağıdaki yöntemler düşünülebilir.
      1. Çok kırmızı bir florofor kullanın. Lipofuscin'den gelen otofloresan, yakın kızılötesinde zayıftır. Bu nedenle, ilgilenilen bir antijenin floresan tespiti için çok kırmızı bir boya kullanmak, konfokal mikroskopta kanal ayarlarının dikkatli bir şekilde ayarlanmasıyla birlikte, genellikle otofloresanı birlikte boyanan floresandan ayırt edebilir.
      2. Lipofuscin'in uzun floresan emisyon kuyruğundan yararlanın.
        NOT: Lipofuscin çok geniş bir floresan emisyon spektrumuna sahip olduğundan, genellikle düşük nm dalga boyunda (örneğin 405 nm lazer) uyarılabilir ve spektrumun turuncu / kırmızı kısmında (örneğin 585-635nm) hala tespit edilen emisyona sahip olabilir. Uyarma ve emisyon dalga boylarının bu eşsiz kombinasyonu genellikle başka bir birlikte boyanan florofor etrafında uyarlanabilir.
        1. 500-530 nm'de emisyon tespiti ile 488 nm civarında pik uyarıma sahip bir florofor kullanarak ilgilenilen antijeni tespit edin. 405 nm uyarma ve 585-635 nm emisyon ile otofloresan algılama için ayrı bir kanal kurun. Bu ikinci kanal sadece UAM'yi tespit ederken, ilk kanal ilgilenilen antijeni artı lipofusin tespit edecektir.
        2. ImageJ gibi ücretsiz bir program kullanarak, UAM sinyalini ilk kanaldan (hem antijen sinyalini hem de UAM sinyalini içeren) çıkarmak için bu ikinci UAM kanalını çıkarma maskesi olarak kullanın.
      3. Spektral karıştırmayı kullanın. Çoğu modern konfokal mikroskop, spektral bir karıştırma çözme seçeneği içerir. Bu, birinin sadece UAM ile bir numunenin spektrumunu ve sadece ilgilenilen birlikte boyanan floroforla başka bir numunenin elde edilmesini sağlar. Hem UAM hem de birlikte boyanan floroforu içeren deneysel numune daha sonra elde edilebilir ve sinyalin yüzde kaçının otofloresan ve birlikte boyamadan geldiğini hesaplamak için doğrusal karıştırmama yöntemlerine tabi tutulabilir.
        NOT: Spektral karıştırma için kapsamlı kılavuzlar çoğu modern konfokal mikroskopta mevcuttur.
      4. Floresan ömür boyu görüntülemeyi kullanın. UAM ile birlikte boyanan bir florofor arasındaki emisyon spektrumu benzer olsa da, floresan ömürlerinin önemli ölçüde farklı olması muhtemeldir. Genel olarak, UAM çoğu spesifik florofordan daha kısa floresan ömrü gösterir. Ömür boyu görüntülemeye izin veren bir konfokal mikroskopa erişimle, tipik lipofussin ömründen daha uzun olanları tespit etmek için floresan sinyalleri geçebilir.
        NOT: Genel olarak, floresan ömrünün 2 ns'den daha uzun sinyallere geçit edilmesi, sinyali tamamen ortadan kaldırmasa da, UAM kontaminasyonunu büyük ölçüde azaltır.
      5. Bir otofloresan baskılayıcı kullanımı. Geleneksel olarak, Sudan Black, spesifik immünofloresan boyama35'ten önce otofloresanı söndürmek için kullanılmıştır. Ticari olarak temin edilebilen birkaç otofloresan söndürücü ürün, Sudan Black'in sonuçlarını iyileştirmek için rapor vermektedir ve bu ürünler Malzeme Tablosunda detaylandırılmıştır. Otofloresan söndürme, elbette, lipofusin tespit etme yeteneğini yok edecektir.
    3. Lipofussin benzeri granüllerin bileşimini belirleyin
      1. Nötr lipitleri değerlendirin
        1. UAM yüklü RPE'yi sabitleyin ve kuyucukları (işlenmemiş işletim sistemi ile beslenen) oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 PFA'da kontrol edin ve PBS 5x ile yıkayın.
        2. 10 μg/mL Nil Kırmızısı veya 3.33 μg/mL Bodipy 493/503 kullanarak nötr lipitler için leke 1 saat oda sıcaklığında %3'lük BSA PBS çözeltisi içinde lekelendikten sonra PBS ile 5 dakika 3x yıkanır.
        3. Transwell'i adım 2.3.1.2 ve 2.3.1.3'te olduğu gibi kesin ve bağlayın ve görüntü. Genel olarak, görüntüleme için aşağıdaki uyarma ve emisyon bant genişliklerini kullanın: Nil Kırmızısı - ex 543 nm, em 620-700 nm ve Bodipy 493/503 - ex 488 nm, em 500-550 nm.
      2. Esterleştirilmiş ve esterleştirilmemiş kolesterolü değerlendirin
        1. Adım 2.3.3.1.1'i izleyin
        2. Filipin, esterleştirilmemiş kolesterolü tanıyan, ancak esterleştirilmiş kolesterolü tanımayan floresan bir boyadır36. Bu nedenle, UAM'deki toplam kolesterol miktarını (esterleştirilmemiş ve esterleştirilmiş) değerlendirmek için, önce esterleştirilmiş kolesterolü esterleştirilmemiş kolesterole dönüştürmek için numuneye kolesterol esteraz ile ön işlem uygulayın. Hücreleri 0.1 M potasyum fosfat tamponunda (pH 7.2) 20 U / mL kolesterol esterazı ile tedavi edin (pH 7.2) ( Malzeme Tablosuna bakınız) 3.5 saat boyunca 37 ° C'de, ardından PBS ile 5 dakika 3x yıkayın.
        3. PBS'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca 50 μg / mL filipin ile lekeleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve PBS ile 5 dakika 3x yıkayın. Filipin fotobeyazlatıcıları kolayca olduğu için numuneleri ışıktan uzak tutun.
          NOT: Sadece esterleştirilmemiş kolesterol ölçülecekse, adım 2.3.3.2.2'deki kolesterol esterazı atlanabilir. Esterleştirilmiş kolesterol miktarı ölçülecekse, numunedeki toplam kolesterol ile esterleştirilmemiş kolesterol arasındaki farktan çıkarılabilir.
        4. Transwell'i 2.3.1.2 ve 2.3.1.3 adımlarında olduğu gibi kesin ve bağlayın ve görüntü.
          NOT: Filipin görüntülerken, çok hızlı bir şekilde fotoağarır. Uyarılma yoğunluğunu ve süresini en aza indirmeli ve numunenin oküler aracılığıyla görüntülenmesiyle bile bazı fotobeyazlatmaların meydana gelebileceğini beklemelidir. Bu nedenle, görüntüleme sırasında: (1) filipin kanalı dışında bir floresan kanalı kullanarak görüntü için uygun bir alan aranmalı, (2) konfokal mikroskop yerine geniş bir alanda filipin görüntüsü (ışığa maruz kalmanın yoğunluğunu sınırlamak için) ve (3) bir alanın tekrar tekrar görüntülenmesinden kaçınılmalıdır. Genel olarak, filipin görüntüleme için aşağıdaki uyarma ve emisyon bant genişliklerini kullanın - ex 380 nm, em 480 nm.

3. Lipofussin benzeri granüllerin RPE fagositozu üzerine etkilerinin değerlendirilmesi: Toplam Tüketim Kapasitesi

NOT: Aşağıdaki OS nabız protokolü ile OS fagositozunu ölçmenin gerekçesi temsili sonuçlar bölümünde detaylandırılmıştır. "Toplam Tüketim Kapasitesi" olarak adlandırılan yöntem, geleneksel OS nabız kovalama fagositoz testleri ile ortaya çıkabilecek fagositoz etkinliği hakkındaki belirsizlikleri önler. Tahliller, 4 x 106 OS/mL içeren 50 μL ortam kullanılarak 24 delikli Transwell plakaları üzerinde yapılır.

  1. Deney için gereken kuyucuk sayısını hesaplayın ve ardından uygun miktarda normal işletim sistemini çözün, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2400 x g'de döndürün ve standart RPE hücre kültürü ortamında 4 x 106 OS / mL'ye yeniden askıya alın. Fagositoz oranlarını kolaylaştırmak için köprüleme ligandları ekleyin.
    NOT: Beslenecek hücrelerdeki köprüleme ligandlarının nihai konsantrasyonu, Protein S için 4 μg / mL ve MFG-E8 için 1.5 μg / mL'dir. Adım 1.1.11'de belirtildiği gibi, köprüleme ligandlarının konsantrasyonlarının diğer RPE tipleri veya hücre yoğunlukları için değiştirilmesi gerekebilir.
  2. Apikal ortamı çıkarın ve ideal olarak uygun köprüleme ligandı konsantrasyonlarında 50 μL 4 x 106 OS / mL ekleyin.
  3. OS eklenmesinden sonra çeşitli zamanlarda (örneğin - 0 saat, 1 saat, 4 saat ve 24 saat), hem hücreleri hem de üstteki OS içeren süpernatanı lize etmek için proteaz inhibitörleri ile 16.67 μL 4x Laemmli numune tamponu ekleyin. Transwell yüzeyini çizmek için bir P-200 pipeti kullanın, Transwell membranını delmemeye veya zarı Transwell'den ayırmamaya dikkat edin ve kombine hücre süpernatantını artı hücre lizatını birlikte toplayın. Vorteks, aşağı doğru döndürün ve tam denatürasyon için oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
    DİKKAT: İşletim sistemini lize etmek için Numune Arabelleği kullanılmasına rağmen, daha sonra lizis çözeltisini ısıtmayın, çünkü bu rodopsin agregasyonunu tetikleyebilir. Ayrıca, lize edilmiş işletim sistemini depolamaya hazır olana kadar soğutmaktan kaçının, çünkü bu proteini çökeltecektir. Kullanılmayan lizatları -20 ° C'de dondurun, lizatların kullanımdan önce tamamen çözüldüğünden emin olun.
  4. SDS PAGE'de lizatları adım 1.3.3'teki ayarlarla aynı ayarları kullanarak çalıştırın ve kuyu başına eşit miktarda lizat yükleyin. Fagositoz oranları hücre sayısına bağlı olduğundan, hücre sayısını normalleştirmek için GAPDH, β-aktin veya başka bir temizlik proteini kullanılmalıdır.
  5. Western, rodopsin'in N- veya C- terminüsüne karşı antikorlarla lekeleri araştırın. Standart Batı lekeleme koşullarını kullanın ve antikor seyreltmeleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
    NOT: Ana rodopsin bandının altında, birden fazla rodopsin parçası olacaktır. Bu fragmanlar, fagozomun lizozom32,33 ile füzyonundan önce başlayan bir süreç olan kısmen sindirilmiş rodopsini temsil eder. UAM yüklü RPE'deki rodopsin fragmanlarının sayısındaki kontrol RPE'ye kıyasla bir artış, fagolizozom kapasitesinde, fagozom-lizozom füzyonu, lizozomal asitleşme ve / veya degradatif enzim fonksiyonu 16,34,35 düzeyinde bir aşağı akış defektini gösterebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İşletim sisteminin foto-oksidasyonu için kurulum Şekil 1Ai'de gösterilmiştir. Politetrafloroetilen kaplı kızaklar, slaydın geri kalanına yayılmadan açık dikdörtgen başına büyük miktarda çözelti içinde işletim sistemi yüklenmesini sağlar. İşletim sistemli slayt, kapağı kapalı steril bir Petri kabı içinde bulunur ve Şekil 1Aii'de gösterildiği gibi slaytın üzerine bir UV lambası yerleştirilir. Alternatif olarak, slayt Şekil 1Aiii'de gö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RPE lipofuscin on yıllardır çalışılırken, toksisitesi 2,9,16,42 tartışılmaktadır. Hayvan modellerinden lipofuscin'in toksisitesi hakkında belirsizlik göz önüne alındığında11, insan RPE'sini kullanan in vitro modeller değerlidir. Bir dizi in vitro lipofussin birikim modeli tanımlanmıştır, ancak hiçbiri hem OS beslenmesini hem de yüksek olgun ve farklılaş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, kısmen, Vitreo-Retinal Cerrahi Vakfı (VRSF), Görme için Mücadele (FFS) ve Uluslararası Retina Araştırma Vakfı (IRRF) tarafından verilen hibelerle desteklenmektedir. J.M.L.M. şu anda Ulusal Göz Enstitüsü'nden (EY033420) bir K08 hibesi ile desteklenmektedir. HFT araştırması için hiçbir federal fon kullanılmadı. Daha fazla destek James Grosfeld Initiative for Dry AMD ve aşağıdaki özel bağışçılardan geliyor: Barbara Dunn ve Dee &; Dickson Brown.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm hücre kültürü kabıCorning#353003Diğerleri de 24
kuyulu TranswellsCorning#3470
Anti-LC3 antikoruHücre Sinyal Teknolojisi#4801S1:1000 seyreltme
Anti-rodopsin antikoru 1D4Abcam#54171:1000 seyreltme. Epitop C-terminalidir.
Anti-rodopsin antikoru 4D2EnCor BiotechMCA-B630Western blot için 1:5000 seyreltme, immün boyama için 1:1000 seyreltme. Epitop N-terminalidir.
Otofloresan söndürücüBiotium#23007TrueBlack Lipofuscin Otofloresan Söndürücü
Otofloresan söndürücüVektör LaboratuvarlarıSP-8400Vektör TrueVIEW Otofloresan Söndürme Kiti
Bodipy 493/503Yaşam TeknolojileriD3922
Kolesterol esteraz A12216 kitindenYaşam Teknolojileri
konfokal mikroskopLeicaLeica Stellaris SP8
Koyuluğa uyarlanmış sığır retinalarıW. L. Lawson CompanyKoyuluğa uyarlanmış sığır retinaları (önceden disseke edilmiş)İletişim bilgileri:
https://wllawsoncompany.com/
(402) 499-3161
stacy@wllawsoncompany.com
FilipinSigma-AldrichF4767
Akış sitometresiThermo FisherAttune NxT
Akış sitometresi analiz yazılımı BDFlowJo
El Tipi UV ışığı Analytik Jena USUVGL-55
İnsan MFG-E8Çin Biyolojik10853-H08B
İnsan saflaştırılmış Protein SEnzim AraştırmaLaboratuvarları HPS
Laemmli numune tamponuThermo FisherJ60015-AD
LDH testiPromegaJ2380LDH-Glo Sitotoksisite Testi
Montaj ortamıInvitrogenP36930Prolong Gold antifade reaktifi
Nil kırmızısıSigma-Aldrich#72485
Politetrafloroetilen kaplı slaytlarTekdonÖzelleştirilmişÖzelleştirilmiş özellikler: Aşağıdaki "kesiklere" sahip PTFE maskesi -  Her biri 17 mm x 9 mm ölçülerinde 3 cam dikdörtgen, 17 mm kenarı sürgünün üstünden 4 mm ve sürgünün altından 4 mm olacak şekilde yönlendirilmiş, 25 mm x 75 mm'lik standart bir mikroskop lamı varsayılmıştır. Her dikdörtgen, diğer dikdörtgenlerden ve slaytın kenarlarından en az 6 mm aralıklarla yerleştirilir. Slaytın etiketlenmesine izin vermek için bir tarafında buzlu cam bulunan bir slayta PTFE maskesi yazdırın.
Proteaz inhibitörleri Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi# 5872
Protein tahliliBio-Rad# 5000122 RC DC protein tahlili
TEER elektrotDünyası Hassas AletlerSTX3
Trans-epitelyal elektrik direnci (TEER) ölçerDünya Hassas AletlerEVOM3
Ultraviyole çapraz bağlayıcı cihazıAnalytik Jena ABDUVP CL-1000
FALCON modüllü

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Palczewska, G., et al. Receptor MER Tyrosine Kinase Proto-oncogene (MERTK) Is Not Required for Transfer of Bis-retinoids to the Retinal Pigmented Epithelium. The Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26937-26949 (2016).
  2. Boulton, M. E. Studying melanin and lipofuscin in RPE cell culture models. Experimental eye research. 126, 61-67 (2014).
  3. Feeney-Burns, L., Hilderbrand, E. S., Eldridge, S. Aging human RPE: morphometric analysis of macular, equatorial, and peripheral cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (2), 195-200 (1984).
  4. Sparrow, J. R., Nakanishi, K., Parish, C. A. The lipofuscin fluorophore A2E mediates blue light-induced damage to retinal pigmented epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (7), 1981-1989 (2000).
  5. Finnemann, S. C., Leung, L. W., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin component A2E selectively inhibits phagolysosomal degradation of photoreceptor phospholipid by the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (6), 3842-3847 (2002).
  6. Charbel Issa, P., et al. Fundus autofluorescence in the Abca4(-/-) mouse model of Stargardt disease--correlation with accumulation of A2E, retinal function, and histology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5602-5612 (2013).
  7. Cideciyan, A. V., et al. Mutations in ABCA4 result in accumulation of lipofuscin before slowing of the retinoid cycle: a reappraisal of the human disease sequence. Human Molecular Genetics. 13 (5), 525-534 (2004).
  8. Gliem, M., Müller, P. L., Finger, R. P., McGuinness, M. B., Holz, F. G., Charbel Issa, P. Quantitative Fundus Autofluorescence in Early and Intermediate Age-Related Macular Degeneration. JAMA ophthalmology. 134 (7), 817-824 (2016).
  9. Rudolf, M., et al. Histologic basis of variations in retinal pigment epithelium autofluorescence in eyes with geographic atrophy. Ophthalmology. 120 (4), 821-828 (2013).
  10. Ach, T., et al. Quantitative autofluorescence and cell density maps of the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4832-4841 (2014).
  11. Taubitz, T., et al. Ultrastructural alterations in the retinal pigment epithelium and photoreceptors of a Stargardt patient and three Stargardt mouse models: indication for the central role of RPE melanin in oxidative stress. PeerJ. 6, e5215(2018).
  12. Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 34 (3), 3693-3714 (2020).
  13. Ach, T., Tolstik, E., Messinger, J. D., Zarubina, A. V., Heintzmann, R., Curcio, C. A. Lipofuscin redistribution and loss accompanied by cytoskeletal stress in retinal pigment epithelium of eyes with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (5), 3242-3252 (2015).
  14. Boulton, M., McKechnie, N. M., Breda, J., Bayly, M., Marshall, J. The formation of autofluorescent granules in cultured human RPE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 30 (1), 82-89 (1989).
  15. Wassell, J., Ellis, S., Burke, J., Boulton, M. Fluorescence properties of autofluorescent granules generated by cultured human RPE cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (8), 1487-1492 (1998).
  16. Zhang, Q., et al. Highly Differentiated Human Fetal RPE Cultures Are Resistant to the Accumulation and Toxicity of Lipofuscin-Like Material. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 60 (10), 3468-3479 (2019).
  17. Lakkaraju, A., Finnemann, S. C., Rodriguez-Boulan, E. The lipofuscin fluorophore A2E perturbs cholesterol metabolism in retinal pigment epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 11026-11031 (2007).
  18. Toops, K. A., Tan, L. X., Jiang, Z., Radu, R. A., Lakkaraju, A. Cholesterol-mediated activation of acid sphingomyelinase disrupts autophagy in the retinal pigment epithelium. Molecular Biology of the Cell. 26 (1), 1-14 (2015).
  19. Ablonczy, Z., et al. Lack of correlation between the spatial distribution of A2E and lipofuscin fluorescence in the human retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5535-5542 (2013).
  20. Boulton, M., Marshall, J. Repigmentation of human retinal pigment epithelial cells in vitro. Experimental Eye Research. 41 (2), 209-218 (1985).
  21. Wihlmark, U., Wrigstad, A., Roberg, K., Brunk, U. T., Nilsson, S. E. Formation of lipofuscin in cultured retinal pigment epithelial cells exposed to pre-oxidized photoreceptor outer segments. APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. 104 (4), 272-279 (1996).
  22. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (8), 3612-3624 (2006).
  23. Zhang, Q., et al. A platform for assessing outer segment fate in primary human fetal RPE cultures. Experimental Eye Research. 178, 212-222 (2019).
  24. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170(2022).
  25. Mazzoni, F., Mao, Y., Finnemann, S. C. Advanced Analysis of Photoreceptor Outer Segment Phagocytosis by RPE Cells in Culture. Methods in molecular biology. 1834, Clifton, N.J. 95-108 (2019).
  26. Hazim, R. A., Williams, D. S. Cell Culture Analysis of the Phagocytosis of Photoreceptor Outer Segments by Primary Mouse RPE Cells. Methods in molecular biology. 1753, Clifton, N.J. 63-71 (2018).
  27. Farnoodian, M., et al. Cell-autonomous lipid-handling defects in Stargardt iPSC-derived retinal pigment epithelium cells. Stem Cell Reports. 17 (11), 2438-2450 (2022).
  28. Ushikubo, M., et al. Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) on monocytes is a novel biomarker of disease activity in systemic lupus erythematosus. Lupus. 30 (1), 61-69 (2021).
  29. Zheng, H., Yan, G., Marquez, S., Andler, S., Dersjant-Li, Y., de Mejia, E. G. Molecular size and immunoreactivity of ethanol extracted soybean protein concentrate in comparison with other products. Process Biochemistry. 96, 122-130 (2020).
  30. Weber, K., Osborn, M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. The Journal of Biological Chemistry. 244 (16), 4406-4412 (1969).
  31. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of Staining Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gels with Coomassie Brilliant Blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  32. Sharma, R., Bose, D., Montford, J., Ortolan, D., Bharti, K. Triphasic developmentally guided protocol to generate retinal pigment epithelium from induced pluripotent stem cells. STAR protocols. 3 (3), 101582(2022).
  33. Miller, J. M. L., Zhang, Q., Johnson, M. W. Regression of drusen or vitelliform material heralding geographic atrophy: correlation between clinical observations and basic science. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology = Albrecht Von Graefes Archiv Fur Klinische Und Experimentelle Ophthalmologie. 259 (7), 2051-2053 (2021).
  34. Röhlich, P., Adamus, G., McDowell, J. H., Hargrave, P. A. Binding pattern of anti-rhodopsin monoclonal antibodies to photoreceptor cells: an immunocytochemical study. Experimental Eye Research. 49 (6), 999-1013 (1989).
  35. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 47 (6), 719-730 (1999).
  36. Rudolf, M., et al. Detection of esterified cholesterol in murine Bruch's membrane wholemounts with a perfringolysin O-based cholesterol marker. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (8), 4759-4767 (2014).
  37. Wavre-Shapton, S. T., Meschede, I. P., Seabra, M. C., Futter, C. E. Phagosome maturation during endosome interaction revealed by partial rhodopsin processing in retinal pigment epithelium. Journal of Cell Science. 127, 3852-3861 (2014).
  38. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846(2020).
  39. Escrevente, C., et al. Formation of Lipofuscin-Like Autofluorescent Granules in the Retinal Pigment Epithelium Requires Lysosome Dysfunction. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (9), 39(2021).
  40. Guha, S., et al. Approaches for detecting lysosomal alkalinization and impaired degradation in fresh and cultured RPE cells: evidence for a role in retinal degenerations. Experimental Eye Research. 126, 68-76 (2014).
  41. Kaemmerer, E., Schutt, F., Krohne, T. U., Holz, F. G., Kopitz, J. Effects of lipid peroxidation-related protein modifications on RPE lysosomal functions and POS phagocytosis. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1342-1347 (2007).
  42. Bergmann, M., Schütt, F., Holz, F. G., Kopitz, J. Inhibition of the ATP-driven proton pump in RPE lysosomes by the major lipofuscin fluorophore A2-E may contribute to the pathogenesis of age-related macular degeneration. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 18 (3), 562-564 (2004).
  43. Vives-Bauza, C., et al. The age lipid A2E and mitochondrial dysfunction synergistically impair phagocytosis by retinal pigment epithelial cells. The Journal of Biological Chemistry. 283 (36), 24770-24780 (2008).
  44. Sundelin, S., Wihlmark, U., Nilsson, S. E. G., Brunk, U. T. Lipofuscin accumulation in cultured retinal pigment epithelial cells reduces their phagocytic capacity. Current Eye Research. 17 (8), 851-857 (1998).
  45. Esteve-Rudd, J., Lopes, V. S., Jiang, M., Williams, D. S. In vivo and in vitro monitoring of phagosome maturation in retinal pigment epithelium cells. Advances in Experimental Medicine and Biology. 801, 85-90 (2014).
  46. Law, A. -L., et al. Annexin A2 regulates phagocytosis of photoreceptor outer segments in the mouse retina. Molecular Biology of the Cell. 20 (17), 3896-3904 (2009).
  47. Sparrow, J. R., Boulton, M. RPE lipofuscin and its role in retinal pathobiology. Experimental Eye Research. 80 (5), 595-606 (2005).
  48. Strunnikova, N. V., et al. Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium. Human Molecular Genetics. 19 (12), 2468-2486 (2010).
  49. Bharti, K., et al. Cell culture models to study retinal pigment epithelium-related pathogenesis in age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 222, 109170(2022).
  50. Zhang, Q., Presswalla, F., Ali, R. R., Zacks, D. N., Thompson, D. A., Miller, J. M. L. Pharmacologic activation of autophagy without direct mTOR inhibition as a therapeutic strategy for treating dry macular degeneration. Aging. 13 (8), 10866-10890 (2021).
  51. Zhou, J., Jang, Y. P., Kim, S. R., Sparrow, J. R. Complement activation by photooxidation products of A2E, a lipofuscin constituent of the retinal pigment epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16182-16187 (2006).
  52. Pan, C., et al. Lipofuscin causes atypical necroptosis through lysosomal membrane permeabilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (47), e2100122118(2021).
  53. Saadat, K. A. S. M., et al. Inhibition of autophagy induces retinal pigment epithelial cell damage by the lipofuscin fluorophore A2E. FEBS open bio. 4, 1007-1014 (2014).
  54. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: Use and utility of RPE cells in culture. Experimental eye research. 0, 51-60 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Lipofuscin ModelsRetinal Pigment EpitheliumOuter Segment PhagocytosisHuman RPE CulturesLipofuscin AccumulationPhagocytosis AssayTotal Consumptive CapacityAutofluorescence ImagingConfocal MicroscopyRhodopsin Degradation

Related Articles